飛蝗Argonaute1的分子特性及生物學(xué)功能

王艷麗，楊美玲，宋天琪，馬恩波，張建珍

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；3中國科學(xué)院動物研究所，北京 100101）

飛蝗Argonaute1的分子特性及生物學(xué)功能

王艷麗1，2，楊美玲3，宋天琪1，馬恩波1，張建珍1

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；3中國科學(xué)院動物研究所，北京 100101）

【目的】MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約22 nt的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式在多種生命活動中發(fā)揮重要功能。Argonaute1（AGO1）蛋白作為miRNA沉默復(fù)合物（miRNA silencing complex RISC）的重要組成部分，在miRNA調(diào)控通路中起著關(guān)鍵作用。論文旨在研究AGO1的生物學(xué)功能及其對飛蝗（Locusta moratoria）生長發(fā)育的影響，為探索昆蟲miRNA的生物合成和農(nóng)業(yè)害蟲的有效控制提供理論依據(jù)。【方法】采用生物信息學(xué)方法在飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得LmAGO1 cDNA序列；使用在線蛋白翻譯軟件（ExPASy）對LmAGO1進(jìn)行蛋白翻譯，利用SMART分析LmAGO1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；選取家蠶（Bombyx mori）、果蠅（Drosophila melanogaster）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等模式昆蟲的同源序列與LmAGO1氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，采用Phyml軟件構(gòu)建昆蟲AGO蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹；為了進(jìn)一步研究LmAGO1在飛蝗生長發(fā)育過程中的作用，使用T7 RiboMAXTM Express RNAi System體外合成LmAGO1的dsRNA，在飛蝗4齡第2天和5齡第2天若蟲期連續(xù)兩次注射dsRNA進(jìn)行干擾，同時(shí)注射dsGFP作為對照。分別收集注射dsRNA后48 h和72 h的整蟲樣品提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測LmAGO1在不同時(shí)間點(diǎn)的干擾效率并觀察蟲體的發(fā)育表型。同時(shí)，為了檢測LmAGO1沉默是否會影響miRNA的生物合成，采用RT-qPCR對飛蝗體內(nèi)5個高豐度miRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。【結(jié)果】LmAGO1蛋白含845個氨基酸，具有典型的AGO蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域，即位于213—348位點(diǎn)的PAZ結(jié)構(gòu)域和502—804位點(diǎn)的PIWI結(jié)構(gòu)域。聚類分析表明，LmAGO1蛋白與其他昆蟲的AGO1蛋白聚為一類。通過AGO1氨基酸序列同源比對結(jié)果顯示LmAGO1與模式昆蟲果蠅、家蠶AGO1的氨基酸序列一致度高達(dá)82.2%和86.9%。RNAi結(jié)果表明，蟲體注射dsLmAGO1 48 h和72 h后，與對照組相比，LmAGO1表達(dá)量均顯著降低，干擾效率分別為88.1%和93.0%；進(jìn)一步觀察試蟲生長發(fā)育的表型特征，與對照組相比，飛蝗4齡期注射dsLmAGO1后其生長發(fā)育并沒有出現(xiàn)明顯異常，待蛻皮發(fā)育至下一齡期（即5齡期）時(shí)，出現(xiàn)大量死亡，死亡率為89.3%；熒光定量PCR結(jié)果顯示注射dsLmAGO1 48 h后，飛蝗體內(nèi)miRNA-252和miRNA-8的表達(dá)顯著下降，干擾72 h后miRNA-7、let 7、miRNA-252、miRNA-8的表達(dá)均顯著下降?！窘Y(jié)論】飛蝗AGO1除參與RSIC的形成以外，還可能參與miRNA的剪切加工過程進(jìn)而調(diào)控飛蝗的正常發(fā)育。

飛蝗；miRNA；Argonaute1；RNA干擾；生物學(xué)功能

0　引言

【研究意義】miRNA是存在于生物體內(nèi)長約22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進(jìn)行調(diào)控。AGO1蛋白與miRNA相結(jié)合形成RISC，對靶標(biāo)基因mRNA進(jìn)行切割或抑制其翻譯［1］，從而影響靶基因的表達(dá)。飛蝗（Locusta migratoria）隸屬于直翅目，蝗總科，飛蝗屬，廣泛分布于歐洲、亞洲、非洲及澳洲等地，是重要的農(nóng)業(yè)害蟲。目前蝗災(zāi)防治策略主要采取農(nóng)藥防治，但長期的化學(xué)防治已導(dǎo)致飛蝗抗藥性的產(chǎn)生和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的破壞，因此亟需發(fā)展高效且對生態(tài)環(huán)境友好的防治策略。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，篩選分子靶標(biāo)，利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的生長發(fā)育是農(nóng)業(yè)植保領(lǐng)域新的發(fā)展方向。探索LmAGO1的生物學(xué)功能及對miRNA生物合成的影響，對于篩選分子靶標(biāo)，開展害蟲綠色防控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】miRNA的發(fā)現(xiàn)使傳統(tǒng)的“中心法則”得到補(bǔ)充與完善［2］。自1993年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)第一個miRNA-Lin4后，越來越多的研究表明miRNA在生物體的生命活動中具有重要意義，其參與調(diào)控生物體細(xì)胞分化、增殖、衰老、代謝、病毒防御、胚胎發(fā)育以及免疫應(yīng)答等重要過程［3-4］。WEI等［5］首次使用高通量測序法對飛蝗小RNA進(jìn)行鑒定，此工作極大推動了非模式昆蟲小RNA的研究。此后，筆者課題組對飛蝗多個組織及不同發(fā)育時(shí)期的小RNA進(jìn)行系統(tǒng)性鑒定，發(fā)現(xiàn)基因組擴(kuò)大對于小RNA的倍增起到關(guān)鍵作用［6］。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著重要的作用，進(jìn)一步的深入研究表明miRNA可調(diào)控飛蝗的蛻皮發(fā)育及型變［7-8］。miRNA行使其調(diào)控功能需要與AGO蛋白形成RISC復(fù)合體來調(diào)控靶基因的表達(dá)。AGO蛋白是miRNA執(zhí)行功能的重要因子，其一般定位于細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白首先在植物中被發(fā)現(xiàn)，其家族在進(jìn)化上高度保守，其數(shù)量在不同物種具有差異，例如水稻（Oryza sativa）中有19個、擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有10個、人（Homo sapiens）中發(fā)現(xiàn)8個、家蠶（Bombyx mori）中發(fā)現(xiàn)4個、果蠅（Drosophila melanogaster）中存在5個［9-10］。AGO蛋白主要由4個部分組成，分別為N末端、PAZ（Piwi-Argonaute-Zwille）結(jié)構(gòu)域、MID結(jié)構(gòu)域和PIWI（P-element Induced Wimpy Testis）結(jié)構(gòu)域。此外，在AGO蛋白中還有兩個負(fù)責(zé)連接N端PAZ結(jié)構(gòu)域的Linker1（L1）以及連接PAZ和MID結(jié)構(gòu)域的Linker2（L2）［11］。AGO蛋白是組成RISC復(fù)合物的主要成分，通過抑制或阻斷靶標(biāo)基因的表達(dá)，參與基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控［12-14］。DIEDERICHS等［15］研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中AGO2具有核酸內(nèi)切酶活性，通過剪切產(chǎn)生ac-pre-miRNA，并參與成熟體miRNA的合成過程，內(nèi)源性AGO2蛋白的減少會降低ac-pre-miRNA乃至成熟體miRNA的形成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】AGO蛋白不僅作為RISC復(fù)合物重要組分，也可作為核酸內(nèi)切酶參與成熟體miRNA形成，這一功能僅在哺乳動物中有報(bào)道［15］。昆蟲中AGO蛋白是否也具有核酸內(nèi)切酶的功能并參與成熟體miRNA形成目前尚不清楚，需要進(jìn)行深入探索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于上述文獻(xiàn)結(jié)果，提出假設(shè)：飛蝗AGO1可能具有類似于哺乳動物核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能。因此，本文以飛蝗為研究對象，獲得飛蝗AGO1（LmAGO1）cDNA序列，采用RNA干擾技術(shù)沉默LmAGO1，檢測LmAGO1在不同時(shí)間點(diǎn)的沉默效率以及對飛蝗體內(nèi)5個高豐度miRNA表達(dá)的影響，探索AGO1在miRNA合成中的作用以及對飛蝗生長發(fā)育的影響，為昆蟲miRNA的合成機(jī)制和新分子靶標(biāo)篩選提供依據(jù)。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2014—2015年在中國科學(xué)院動物研究所完成。

1.1材料

供試飛蝗（2005年4月采自河北黃驊）為室內(nèi)連續(xù)多代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫（28—30）℃，相對濕度15%—25%，光周期14L∶10D；蟲體飼養(yǎng)在通風(fēng)良好的木籠（25 cm×25 cm×25 cm）中，以麥苗和麥麩飼喂。

1.2LmAGO1結(jié)構(gòu)功能域及分子進(jìn)化分析

通過飛蝗轉(zhuǎn)錄組信息預(yù)測，得到LmAGO1的cDNA序列，使用在線蛋白翻譯軟件（ExPASy）對AGO1進(jìn)行蛋白翻譯。使用蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析軟件SMART對LmAGO1蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定。使用GENEDOC軟件將LmAGO1蛋白與其對應(yīng)的果蠅和家蠶同源AGO1蛋白進(jìn)行多序列比對，并使用EMBOSS軟件包中的needle程序進(jìn)行基于全局比對（Global alignment）策略的氨基酸序列相似度計(jì)算。根據(jù)LmAGO基因序列，運(yùn)用NCBI的BLAST工具對AGO基因序列進(jìn)行同源搜索和比對，下載來源于其他物種的同源序列，使用Phyml軟件中的最大似然法和JTT模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行1 000次bootstrap自舉檢驗(yàn)。

1.3LmAGO1的干擾及熒光定量PCR檢測

1.3.1引物設(shè)計(jì)依據(jù)LmAGO1序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)RNA干擾及熒光定量PCR（RT-qPCR）引物，文中所用引物如表1所示。

1.3.2LmAGO1雙鏈合成及RNA干擾使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega）合成AGO1和GFP（綠色熒光蛋白基因）的雙鏈RNA［16］，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一且無降解產(chǎn)物，可以用作后續(xù)的干擾試驗(yàn)。合成的雙鏈用無RNA酶的水稀釋到5 μg·μL-1，選擇飛蝗4齡第2天的若蟲，在其第2和第3腹節(jié)處用微量注射器注射10 μg dsRNA，待其發(fā)育至5齡第2天時(shí)，再注射一次等劑量的dsRNA。試驗(yàn)組（dsLmAGO1）為28頭若蟲，對照組（dsGFP）為26頭若蟲。注射dsRNA后，每天觀察并記錄表型。

1.3.3RT-qPCR定量檢測收取整蟲樣本，用Trizol分別提取第一次干擾后48及72 h富含miRNA的總RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）及Oligo（dT）-primed反轉(zhuǎn)錄cDNA，使用MiRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（天根）合成miRNA cDNA，每個處理組設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。分別使用RealMaster Mix SYBR Green（天根）和MiRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根）對AGO1及miRNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測分析。運(yùn)用2-??CT對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS15.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件中的Independent samples T-test方法分析差異顯著性。

表1　LmAGO1 RNAi干擾雙鏈合成引物以及RT-qPCR定量引物Table 1　Primers used for AGO1 dsRNA synthesis and AGO1 RT-qPCR

2　結(jié)果

2.1LmAGO1結(jié)構(gòu)域及其系統(tǒng)發(fā)育分析

對AGO1序列分析結(jié)果顯示LmAGO1蛋白含有845個氨基酸，使用SMART軟件預(yù)測該蛋白含有1個起止于153—205位點(diǎn)的DUF結(jié)構(gòu)域和2個典型的保守結(jié)構(gòu)域，分別為位于213—348 位點(diǎn)的PAZ結(jié)構(gòu)域和502—804位點(diǎn)的PIWI結(jié)構(gòu)域。這2個保守的結(jié)構(gòu)域是AGO蛋白行使切割功能的活性中心（圖1-A）。

AGO1氨基酸序列同源比對結(jié)果顯示LmAGO1與DmAGO1、BmAGO1氨基酸序列的序列一致度較高，分別為82.2%和86.9%。比對結(jié)果顯示，LmAGO1與果蠅和家蠶的AGO1氨基酸序列均具有DUF結(jié)構(gòu)域（黑色框區(qū)域）、PAZ結(jié)構(gòu)域（紅色框區(qū)域）和PIWI結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色框區(qū)域）（圖1-B）。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，AGO1和AGO2蛋白被明顯地分為兩支，在AGO1分支中，飛蝗與灰飛虱（Laodelphax striatella）、褐飛虱（Nilaparvata lugens）的親緣關(guān)系最近，并與家蠶、果蠅、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、秀麗隱桿線蟲聚為一簇，均聚為AGO1家族，表明所鑒定的飛蝗AGO蛋白屬于AGO1類型（圖1-C）。

2.2LmAGO1功能分析

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了RNAi AGO1后LmAGO1的干擾效率，發(fā)現(xiàn)LmAGO1在dsRNA注射后48 h和72 h的干擾效率均很高，分別達(dá)到88.1%和93.0%（圖2）。

進(jìn)一步觀察了RNAi干擾AGO1后，飛蝗生長和發(fā)育的表型特征，發(fā)現(xiàn)飛蝗在4齡第2天注射dsRNA后的生長發(fā)育表型與對照組相比無明顯變化，但當(dāng)其蛻至下一齡期（即5齡期）第3天時(shí)，飛蝗開始出現(xiàn)死亡，死亡率高達(dá)89.3%，而對照組的死亡率僅為11.2%（圖3）。

圖1　LmAGO1的功能結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1　Domain organization and phylogenetic analysis of LmAGO1

圖2　熒光定量PCR分析LmAGO1的干擾效率Fig. 2　The silencing efficiency analysis of LmAGO1 by RT-qPCR

2.3LmAGO1基因干擾后miRNA的表達(dá)分析

為了證明AGO1沉默是否影響了miRNA的表達(dá)，選取5個飛蝗體內(nèi)高豐度的miRNAs進(jìn)行了熒光定量PCR檢測。發(fā)現(xiàn)AGO1基因干擾48 h后，被檢測的miRNAs中miRNA-252和miRNA-8的表達(dá)顯著下降（圖4-A）；干擾72 h后miRNA-7、let7、miRNA-252、miRNA-8的表達(dá)均顯著下降（圖4-B）。

3　討論

目前昆蟲中的AGO主要分為Argonaute和PIWI兩個家族［17］。AGO1和AGO2均屬于Argonaute家族，參與RISC復(fù)合物的加工。在昆蟲中AGO1主要負(fù)責(zé)miRNA介導(dǎo)的基因沉默，而AGO2主要負(fù)責(zé)siRNA介導(dǎo)的基因沉默［18-19］。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)昆蟲AGO1成員之間在進(jìn)化樹上的枝長較短，而AGO2成員之間的枝長較長。蛋白質(zhì)序列的比對分析發(fā)現(xiàn)LmAGO1與DmAGO1、BmAGO1一致度分別為82.2%和86.9%，LmAGO2與DmAGO2、BmAGO2一致度分別為37.5%和29.5%。這些結(jié)果表明昆蟲中AGO1家族的基因序列分化程度較小，較AGO2家族更為保守。

圖3　AGO1 RNA干擾后對飛蝗發(fā)育的影響Fig. 3　The effect of LmAGO1 RNAi on locust development

圖4　熒光定量PCR分析AGO1基因干擾后miRNAs的表達(dá)情況Fig. 4　The expression of miRNAs after dsLmAGO1 injection by RT-qPCR

AGO1對飛蝗正常發(fā)育非常重要。本研究中4齡第2天注射dsLmAGO1進(jìn)行RNA干擾后并未引起飛蝗死亡，但飛蝗蛻皮發(fā)育至5齡初期繼續(xù)注射dsLmAGO1后，飛蝗出現(xiàn)了大量死亡。在果蠅脂肪體中miR-8能夠調(diào)節(jié)抗菌肽Drosomycin和Diptericin進(jìn)而維持免疫平衡［20］。miR-252能夠調(diào)節(jié)登革熱病毒包膜蛋白的表達(dá)，在白紋伊蚊（Aedes albopictus）起到細(xì)胞內(nèi)抗病毒的作用［21］。因此，推測LmAGO1基因缺失后引起的大量死亡可能與其后續(xù)影響miRNA的合成有關(guān)，從而影響到飛蝗免疫穩(wěn)態(tài)維持和病毒防御應(yīng)答。由于AGO1基因缺失后對miRNA合成的影響具有時(shí)間效應(yīng)，并不是即時(shí)發(fā)生的，當(dāng)miRNA的量減少到一定程度時(shí)會影響飛蝗的正常發(fā)育，所以在AGO1被注射后，飛蝗蛻皮發(fā)育至下個齡期才引起大量死亡。已有研究發(fā)現(xiàn)AGO1缺失會顯著降低飛蝗Vg蛋白的轉(zhuǎn)錄和卵泡上皮的正常發(fā)育，從而影響卵母細(xì)胞成熟和卵巢的形成［22］。在果蠅中AGO1缺失后導(dǎo)致其卵母細(xì)胞和生殖細(xì)胞的形成和分化異常［23］，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道果蠅胚胎期缺乏AGO1會使其胚胎發(fā)育異常致死［24］。與AGO1密切相關(guān)的miRNAs的表達(dá)受到抑制后也會產(chǎn)生類似于AGO1缺失后的發(fā)育異常。抑制miR-184的表達(dá)同樣能夠使得果蠅早期胎發(fā)育異常［25］。在紅帶袖蝶（Heliconius melpomene）中，翅發(fā)育相關(guān)基因座HmYb中的兩個miRNA能夠控制翅的顏色形成及著色分布［26］。據(jù)此推測AGO1對昆蟲生長發(fā)育影響是多方面的，LmAGO1不僅可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)影響若蟲期的發(fā)育，導(dǎo)致飛蝗大量死亡，同時(shí)也可能影響其卵期發(fā)育及成蟲期多個器官的發(fā)育。

LmAGO1被干擾后，一些高豐度表達(dá)的成熟體miRNAs的合成量顯著減少。研究結(jié)果顯示，被檢測的miRNAs表達(dá)與AGO1的表達(dá)呈正相關(guān)性，AGO1被沉默的時(shí)間越久，miRNAs表達(dá)下調(diào)的數(shù)量越多，表明AGO1在飛蝗miRNAs合成過程中起著重要作用，內(nèi)源性AGO1表達(dá)下調(diào)抑制了成熟miRNA的合成與表達(dá)。DIEDERICHS等發(fā)現(xiàn)人的AGO2蛋白具有核酸內(nèi)切酶的活性，可以將pre-miRNA剪切為ac-pre-miRNA，然后形成成熟體miRNA，AGO2突變后顯著抑制了成熟體miRNA的合成［15，27］，本研究結(jié)果與此一致。已有研究表明人的AGO1、AGO2均參與了miRNA通路的合成和加工［28］，人的AGO1是由AGO2基因倍增以后產(chǎn)生的，AGO2是更古老的參與miRNA加工的Argonaute家族成員［29］，因此推測昆蟲中參與miRNA合成的AGO1可能與人的AGO2是同源基因。本研究結(jié)果表明AGO1基因沉默后顯著影響了一些高豐度miRNA的合成，miRNA的合成紊亂導(dǎo)致其靶基因失調(diào)并影響蟲體的正常發(fā)育，推測飛蝗AGO1也可能與人類AGO2一樣具有核酸內(nèi)切酶的活性。另一方面，AGO1的沉默可導(dǎo)致其蛋白量減少，影響了RISC復(fù)合體的形成以及miRNA的正常調(diào)控功能。這兩方面的原因都有可能導(dǎo)致沉默該基因后，飛蝗出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，但飛蝗致死是上述兩方面的原因共同影響還是單方面原因起主要作用，還需要今后的深入研究。

近年來，由于害蟲抗藥性的產(chǎn)生、殺蟲劑的殘留以及生物多樣性的不斷減少等原因，傳統(tǒng)的殺蟲劑已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要，亟待開發(fā)綠色環(huán)保的新型殺蟲劑。LmAGO1蛋白作為miRNA行使功能的重要因子，在其生長發(fā)育過程中起著十分重要的作用，AGO1的缺失會導(dǎo)致飛蝗的大量死亡，因此利用RNAi技術(shù)將AGO1進(jìn)行沉默可以為研發(fā)有效的生物環(huán)境友好型殺蟲劑提供重要的理論依據(jù)。

4　結(jié)論

通過對AGO1蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析及對飛蝗基因組中的AGO1蛋白進(jìn)行鑒定，研究了飛蝗與其他昆蟲AGO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；經(jīng)體內(nèi)注射dsRNA方法沉默飛蝗LmAGO1，發(fā)現(xiàn)干擾LmAGO1后可導(dǎo)致飛蝗死亡；進(jìn)一步對AGO1生物學(xué)功能進(jìn)行分析，明確了LmAGO1在miRNA合成與表達(dá)中的作用以及對飛蝗生長發(fā)育的影響。研究可為篩選新的分子靶標(biāo)，開展基于RNA干擾的害蟲防治新技術(shù)體系提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

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（責(zé)任編輯岳梅）

Molecular Characterization and Biological Function of Argonaute1 in Locusta migratoria

WANG Yan-li1，2， YANG Mei-ling3， SONG Tian-qi1， MA En-bo1， ZHANG Jian-zhen1
（1Research Institute of Applied Biology， Shanxi University， Taiyuan 030006；2College of Life Science， Shanxi University，Taiyuan 030006；3Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101）

【Objective】 MicroRNAs （miRNAs） are small （approximately 22 nt）， noncoding RNA molecules that play important roles through post-transcriptional regulation in a wide range of biological process. As an essential component ofmiRNA silencing complex （RISC）， Argonaute1 （AGO1） protein plays a key role in miRNA regulatory pathway. The purpose of this study is to explore the biological function of LmAGO1， and determine its impacts on growth and development in the migratory locust. These results will provide an important theoretical basis for biogenesis mechanism of insect miRNAs and effective pest control. 【Method】 The cDNA sequence of LmAGO1 was identified from the locust transcriptome database by using bioinformatics approaches， and was translated into protein sequence using online protein translation software （ExPASy）. The conserved domains were analyzed by SMART based on the deduced protein sequence. A phylogenetic tree of insect AGO was constructed with the locust AGO1， the homologous amino acid sequences from Bombyx mori， Drosophila melanogaster，Tribolium castaneum and other insects using the Phyml program. The double-strand RNAs （dsRNAs） of AGO1 gene were synthesized in vitro using T7 RiboMAXTMExpress RNAi System. The RNA interference （RNAi） experiment was preformed to explore the biological function of LmAGO1 during growth and development in locusts. The dsLmAGO1 was injected into the locust nymphs on day 2 of the 4th-instar and 5th-instar stages， respectively. The injection of dsGFP was used as the control. At the 48 h and 72 h after dsRNA injection， the whole body of locust nymphs was collected for total RNA isolation and cDNA synthesis. The reverse transcript quantitative PCR （RT-qPCR） analyses of the LmAGO1 were performed to determine the gene silencing efficiency. In order to evaluate the influences of the LmAGO1 RNAi on miRNA biogenesis， the five abundantly expressed miRNAs were selected to quantify their expression level by using RT-qPCR after dsLmAGO1 injection.【Result】 The amino acid analysis showed that LmAGO1 protein of locust contains 845 amino acids and has the typical AGO protein family conserved domains， including PAZ （Piwi-Argonaute-Zwille） domain which is located in the region from nucleotide 213 to 348 and PIWI （P-element Induced Wimpy Testis） domain which is located in the region from nucleotide 502 to 804. The phylogenetic analysis showed that LmAGO1 was clustered with the AGO1s of other insect species. The multiple protein sequence alignments indicated that the amino acid sequence identity is 82.2% between LmAGO1and DmAGO1， and is 86.9% between LmAGO1 and BmAGO1， respectively； RNAi results showed that the expression of LmAGO1 was significantly reduced at 48 h and 72 h after dsLmAGO1 injection into locust nymphs. The silencing efficiency of LmAGO1 was 88.1% and 93.0%， respectively. The locust nymphs with dsLmAGO1 treatment did not show any obvious phenotypic defects at the 4th-instar stage. However， compared with dsGFP injected control， the dsLmAGO1 treatment resulted in a high mortality at the 5th-instar stage. A total of 89.3% locust nymphs were dead in dsLmAGO1 injected group. The RT-qPCR results of LmAGO1 showed that LmAGO1 was significantly silenced at 48 h and 72 h after dsRNA injection. Moreover， the expression analysis of miRNA results indicated that the expression levels of miRNA-252 and miRNA-8 were significantly decreased at 48 h after dsLmAGO1 treatments， and that the expressions of miRNA-7， let-7， miRNA-252 and miRNA-8 were significantly down-regulated at 72 h after dsLmAGO1 treatments.【Conclusion】Besides the role in RSIC formation， LmAGO1 can enhance the processing of miRNA maturation and regulate the normal development in the migratory locust.

Locusta moratoria； miRNA； AGO1； RNAi； biological function

2016-05-23；接受日期：2016-08-05

國家自然科學(xué)基金（31472051，31272380）、山西省自然科學(xué)基金（2014011028-3）

聯(lián)系方式：王艷麗，E-mail：wangyanli110327@163.com。通信作者張建珍，E-mail：zjz@sxu.edu.cn