狹鱈魚皮膠原肽對過氧化氫誘導的人成骨細胞氧化損傷作用

薛玲芳，陳雪紅，徐宏偉，韓彥弢*，王春波

(1.青島大學藥學院,山東青島 266021；2.青島大學基礎醫(yī)學院，山東青島 266021)

?

狹鱈魚皮膠原肽對過氧化氫誘導的人成骨細胞氧化損傷作用

薛玲芳1，陳雪紅1，徐宏偉2*，韓彥弢1*，王春波2

(1.青島大學藥學院,山東青島 266021；2.青島大學基礎醫(yī)學院，山東青島 266021)

[目的]復制過氧化氫誘導人成骨細胞氧化損傷模型，探討狹鱈魚皮膠原肽保護作用機制。[方法]以人成骨細胞為研究對象，將對數生長期的細胞分為6組：正常對照組、H2O2損傷組、膠原蛋白肽低(100 μg/mL)、中(300 μg/mL)、高(600 μg/mL)濃度組、陽性對照組(300 μg/mL維生素E)，CCK-8法檢測成骨細胞的存活率，酶聯免疫法檢測細胞培養(yǎng)液中SOD、MDA的含量，PCR技術檢測Foxo3amRNA的表達水平，Western blot技術檢測Sirt1、Foxo3a的蛋白表達水平。[結果]與模型組相比，膠原肽組細胞存活率及SOD的水平升高，MDA含量下降，Foxo3amRNA及蛋白表達水平下降，Sirt1 蛋白表達水平上升。[結論]300 μmol/L H2O2可成功復制成骨細胞氧化損傷模型；一定濃度的膠原蛋白肽能降低MDA的含量，提高SOD水平，并具有抗氧化損傷功能，膠原肽對成骨細胞的保護作用可能與下調Foxo3a和上調Sirt1的表達水平有關。

膠原蛋白肽；骨質疏松；過氧化氫；人成骨細胞；氧化損傷

近年來，膠原蛋白肽成為國內外廣泛研究的課題之一，狹鱈魚皮膠原肽是提取自深海狹鱈魚皮，然后經過多種酶解[1]、滅活等技術得到的膠原蛋白肽的混合物。研究發(fā)現，膠原蛋白肽具有多種生理活性，如抗氧化、抑制血管緊張素酶、降血壓等功效[2-3]。骨質疏松是一種與年齡增長相關的疾病，多發(fā)于中老年人，尤其是絕經后的婦女。骨組織中破骨細胞所維持的骨吸收與成骨細胞所維持的骨形成之間的失衡是骨質疏松發(fā)生的潛在機制，體外動物試驗研究表明，卵巢切除大鼠體內活性氧等自由基的水平上升，從而促進破骨細胞的吸收作用，而抑制成骨細胞的形成[4]。Foxo(The class O of forkhead box transcription factors)家族因子與氧化應激作用有一定的關系，可保護細胞免受損傷，有研究表明，Foxo家族因子通過上調抗氧化物酶的活性而維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡[5]。Foxo3a是FOXO家族中的一員，在機體新陳代謝、細胞增殖及凋亡等方面起到重要作用。Sirt1是一種存在于哺乳動物體內的NAD+依賴性去乙?；?，隨年齡增長相關疾病的發(fā)生與其有密切關系[6-7]。Sirt1參與成骨細胞的增殖與分化，并與成骨細胞中堿性磷酸酶、骨鈣素等的表達有關[8]。因此，根據膠原肽具有抗氧化的功能特性，該試驗采用人體成骨細胞(Saos-2)作為研究對象，以過氧化氫誘導成骨細胞氧化損傷模型，觀察不同濃度的狹鱈魚皮膠原肽對H2O2誘導的人成骨細胞存活率，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量以及Sirt1與Foxo3a表達的影響，研究膠原蛋白肽抗氧化損傷作用機制，為骨質疏松的預防和治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗藥物。狹鱈魚皮膠原肽粉(青島福生食品有限公司)，使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋，并用微孔濾膜過濾，然后稀釋至相應濃度。維生素E(Sigma公司)，使用時用無水乙醇溶解至相應濃度。

1.1.2細胞株。人成骨細胞(Saos-2)購自中科院細胞庫。

1.1.3試劑。H2O2(上海埃彼化學試劑有限公司)，α-minimal essential medium(美國Gibco公司，批號AAG205912)；胎牛血清(BI，批號1544459)； 青鏈霉素混合液、二甲亞砜(批號20151020，D837),北京索來寶生物科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(beyotime公司，批號P0015)；Sirt1抗體(Cell Signaling Technology，貨號3711S)；Foxo3a抗體(英國abcam公司，批號ab154786)；GAPDH抗體(中杉金橋，批號15900409)；SOD試劑盒、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；Trizol Reagent(Invitrogen，批號14104)；FastQuant cDNA第一條鏈合成試劑盒(目錄號KR106)、2×Taq PCRMasterMix(目錄號KT201)、6×DNA Loading Buffer(RT201)等，天根生化科技有限公司；Foxo3a、GAPDH引物均由生工生物工程股份有限公司合成，Foxo3a引物序列：上游5’-GTCCGCGATCCTGTACGTGG-3’，下游5’-GTCCTCCTCGGGGATCAT-3’，擴增產物的長度109 bp。

1.1.4儀器。倒置顯微鏡(江南光學有限公司，批號2006254804)；臺式離心機(上海安亭科學儀器)；酶標儀(FC型Ultiskan)；CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)。當細胞在培養(yǎng)瓶中生長至大約80%時，加入0.25%的胰蛋白酶溶液，消化并離心，棄上清液，加入含有10%的胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基吹打，分裝至培養(yǎng)瓶中，至于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，備用。

1.2.2細胞存活率檢測。試驗共分為6組：①正常對照組、②模型對照組(300 μmol/L H2O2損傷組)、③膠原肽低濃度組(150 μg/mL膠原肽+300 μmol/L H2O2)、④膠原肽中濃度組(300 μg/mL膠原肽+300 μmol/L H2O2)、⑤膠原肽高濃度組(600 μg/mL膠原肽+300 μmol/L H2O2)、⑥陽性對照組(300 μg/mL維生素E+300 μmol/L H2O2)。將細胞吹打成細胞懸液以后，以每孔104個/mL接種于96孔板，每孔體積200 μL，每組設置6個復孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換一次培養(yǎng)液。待細胞生長至50%時，③、④、⑤組加入膠原肽預保護，⑥組加入維生素E，48 h后，除正常組外，其他各組加入300 μmol/L H2O2。6 h后，吸出舊的培養(yǎng)液，每孔加入含10%CCK-8的細胞培養(yǎng)液200 μL，培養(yǎng)箱中孵育3 h后，在490 nm的波長下，用酶聯檢測儀測定各孔吸光度，計算細胞存活率。

1.2.3SOD、MDA含量測定。將細胞以1×104個/mL鋪于6孔板中，細胞分組及處理同“1.2.2”，分別取各組細胞上清液，按試劑盒操作說明用酶標儀測定其OD值。

1.2.4PCR檢測細胞中Foxo3amRNA的水平。

1.2.4.1細胞中總RNA的提取。采用Trizol法提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測樣品RNA在260和280 nm下的吸光度值，RNA的濃度為OD260×稀釋倍數×40 ng/mL，在使用前將濃度調至1 μg/μL,各組細胞中mRNA的純度A260/A280均為1.8～2.1。

1.2.4.2反轉錄。按試劑盒說明，首先配制gDNA去除反應體系，再配制反轉錄反應體系，然后將兩者充分混勻，共建立20 μL的反應體系，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，獲得cDNA。

1.2.4.3PCR擴增。樣品模板6 μL、Primer1(10 μmol/L)0.8 μL、Primer2(10 μmol/L)0.8 μL、2×Taq PCR MasterMix10 μL、ddH2O 2.4 μL，共建立20 μL的反應體系，將各組反應體系置于PCR擴增儀中，并設置擴增程序：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)，72 ℃延伸5 min，結束反應，得擴增產物。

1.2.4.4瓊脂糖凝膠電泳。取5 μL擴增產物，加入1 μL 5×DNA Loading Buffer混合，配制2%的瓊脂糖凝膠，取5 μL產物進行電泳，并在凝膠成像儀中顯影。

1.2.5細胞中Sirt1、Foxo3a蛋白水平檢測。

1.2.5.1細胞總蛋白的提取。待細胞爬滿至培養(yǎng)瓶80%～90%時,用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，并吹打成細胞懸液，將細胞以1×105個/mL的密度鋪至100 mm大皿中。給藥處理之后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，收集細胞，每組分別加入含有0.8 μL苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液80 μL，冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度。每組各加入5×SDS上樣緩沖液16 mL，95 ℃加熱10 min，冷卻至常溫后，放在-20 ℃冰箱中，冷藏，備用。

1.2.5.2western blot檢測。以GAPDH作為內參，配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，加樣，電泳分離總蛋白后，將蛋白轉移至PAGE膜上50 min，用含5%脫脂奶粉的PBST稀釋一抗(1∶3 000),封閉4 ℃過夜，PBST洗后，加入二抗(1∶10 000),37 ℃條件下孵育1 h。加顯色液(A液∶B液=1∶1)，顯影，檢測蛋白的相對表達量。

2　結果與分析

2.1不同濃度膠原蛋白肽對成骨細胞增殖的影響由圖1可見，細胞用300 μmol/L H2O2損傷后，細胞存活率為51%，與正常組相比，明顯下降(P<0.05)。在給予濃度分別為150、300、600 μg/mL的膠原蛋白肽預保護之后，與模型組相比，細胞活力升高，且具有劑量依賴性，其中，高濃度組細胞存活率升高趨勢明顯(P<0.01)。表明H2O2能夠降低細胞存活率，而膠原肽能夠保護細胞免受損傷。

注：#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)；*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。Note: # stands for significant difference compared with normal group(P<0.05);*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.圖1　不同濃度膠原蛋白肽對細胞存活率的影響(n=6)Fig.1　Effects of different concentration collagen peptide on cell survival rate

2.2膠原蛋白肽對H2O2損傷的成骨細胞中SOD、MDA的影響從表1可看出，與正常組相比，模型組細胞中SOD含量下降(P<0.01)，MDA含量上升(P<0.05)，與模型組相比，膠原肽預保護組SOD含量升高，MDA含量下降(P<0.01)。表明膠原蛋白肽能夠使成骨細胞中抗氧化酶的含量升高，降低氧化物的含量，因此狹鱈魚皮膠原肽具有一定的抗氧化功能。

表1不同濃度膠原蛋白肽對成骨細胞中SOD、MDA含量的影響(n=6)

Table 1The influence of different concentration of collagen peptide on the concent of SOD and MDA in osteoblast cell

組別GroupsSODU/molMDAnmol/L正常對照組Normalcontrolgroup93.14±2.801.36±0.04模型對照組Modelcontrolgroup34.03±4.61##4.05±0.21#膠原肽低濃度組Collagenpep-tidelowconcentrationgroup55.92±4.98*3.62±0.09*膠原肽中濃度組Collagenpep-tidemediumconcentrationgroup66.02±3.91**2.16±0.12**膠原肽高濃度組Collagenpep-tidehighconcentrationgroup84.91±1.39**1.75±0.11**陽性對照組Positivecontrolgroup89.46±1.89**1.55±0.07**

注：#、##分別表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)；*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：#,## stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with normal group.*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.

2.3細胞內 Foxo3amRNA表達水平的測定由圖2～3可見，與正常組相比，H2O2損傷組Foxo3a與GAPDH的灰度值之比升高(P<0.05)；而用不同濃度的膠原肽預保護后，隨劑量的增加，Foxo3a與GAPDH的灰度值之比下降(P<0.01)。表明膠原肽能夠降低Foxo3amRNA的表達水平，且具有劑量依賴性。

注：1.正常對照組；2.模型對照組；3.膠原肽低濃度組；4.膠原肽中濃度組；5.膠原肽高濃度組。Note: 1.Normal control group;2.Model control group;3.Collagen petide low dose group;4.Collagen petide middle dose group;5.Collagen petide high dose group.圖2　各組 Foxo3amRNA的相對表達量(n=3)Fig.2　Relative expression of Foxo3amRNA in each group(n=3)

注：#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)；*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。Note: # stands for significant difference compared with normal group(P<0.05);*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.圖3　膠原蛋白肽對成骨細胞中Foxo3amRNA相對表達水平的影響(n=3)Fig.3　Effects of collagen peptide on Foxo3amRNA relative expression in osteoblast cell

2.4細胞內Foxo3a、Sirt1蛋白表達水平測定從圖4和表2可看出，與正常組相比，H2O2組中Foxo3a與GAPDH灰度值之比上升(P<0.05)，而Sirt1與GAPDH灰度值之比下降(P<0.01)；與模型組相比，給藥組Foxo3a與GAPDH灰度值之比下降，Sirt1與GAPDH灰度值之比上升(P<0.05)。表明300 μmol/L H2O2可以激活Foxo3a蛋白的表達，抑制Sirt1蛋白的表達，600 μg/mL膠原蛋白肽可顯著下調Foxo3a蛋白表達水平。

注：1.正常對照組；2.模型對照組；3.膠原肽低濃度組；4.膠原肽中濃度組；5.膠原肽高濃度組。Note: 1.Normal control group;2.Model control group;3.Collagen petide low dose group;4.Collagen petide middle dose group;5.Collagen petide high dose group.圖4　各組Foxo3a、Sirt1蛋白的相對表達量(n=3)Fig.4　Relative expression of Foxo3a,Sirt1 of each group(n=3)

3　討論與結論

成骨細胞是由骨髓間質細胞分化而來的，是維持骨的正常發(fā)育和骨組織的動態(tài)平衡有關的重要的功能細胞。因此，成骨細胞的研究對骨相關疾病的發(fā)生機制及治療途徑有重要意義，如關節(jié)炎、骨質增生、骨質疏松等。絕經后婦女雌激素水平下降所致的骨質疏松尤為常見，主要表現為骨密度的下降，從而增加患者的骨脆性，提高骨折的風險[9]。Guillerminet等[10]分別將來源于牛、豬組織的膠原蛋白肽作用于鼠的成骨細胞，發(fā)現成骨細胞數量增加，堿性磷酸酶的活性提高。從該研究結果來看，將濃度分別為150、300、600 μg/mL的狹鱈魚皮膠原肽作用于成骨細胞后，細胞的增殖率上升，SOD含量上升，MDA含量下降。表明膠原肽能夠降低成骨細胞中氧化物的含量，提高抗氧化物的含量。因此，膠原肽可能通過抗氧化應激作用，從而在一定程度上保護成骨細胞免受H2O2損傷。

表2膠原蛋白肽對成骨細胞中Sirt1、Foxo3a相對表達量的影響 (n=3)

Table 2The influence of collagen peptide on the relative expression of Foxo3a and Sirt1 in osteoblast cell

組別GroupsFoxo3a/GAPDHSirt1/GAPDH正常對照組Normalcontrolgroup0.82±0.011.04±0.06模型對照組Modelcontrolgroup1.07±0.05#0.59±0.01##膠原肽低濃度組Collagenpep-tidelowconcentrationgroup0.98±0.01*0.93±0.01*膠原肽中濃度組Collagenpep-tidemiddleconcentrationgroup0.96±0.02**0.96±0.04**膠原肽高濃度組Collagenpep-tidehighconcentrationgroup0.91±0.03**1.01±0.04**

注：#、##分別表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01);*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：#,## stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with normal group.*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.

該試驗結果中，與H2O2損傷組相比，膠原肽降低Foxo3amRNA和蛋白表達水平，提高Sirt1蛋白表達水平，并具有劑量依賴性。說明H2O2能夠激活Foxo3a，而膠原肽能夠抑制H2O2對Foxo3a的激活。Tseng等[11]研究發(fā)現Sirt1與Foxo3a的C-末端結構域結合，促進Sirt1/Foxo3a復合物的形成。因此，狹鱈魚皮膠原肽抑制H2O2誘導的成骨細胞氧化應激可能是通過上調Sirt1的表達水平、下調Foxo3a的表達水平導致的。然而，Sirt1/Foxo3a通路是否參與了此過程，還需要進一步的研究。

[1]MUTHUKUMAR T,PRABU P,GHOSH K,et al.Fish scale collagen sponge incorporated with Macrotyloma uniflorum plant extract as a possible woundburn dressing material[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2014,113(1):207-212.

[2]MURAKAMI M,TONOUCHI H,TAKAHASHI R,et al.Structural analysis of a new anti-hypertensive peptide(β-lactosin B)isolated from a commercial whey product[J].Journal of dairy science,2004,87(7):1967-1974.

[3]ZHANG Y,DUAN X,ZHUANG Y.Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of tilapia (Oreochromis niloticus) skin gelatin[J].Peptides,2012,38(1): 13-21.

[4]LEAN J M,DAVIES J T,FULLER K,et al.A crucial role for thiol antioxidants in estrogen-deficiency bone loss[J].Clin Invest,2003,112(6):915-923.

[5]RACHED M T,KODE A,XU L.FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts[J].Cell Metab,2010,11(2):147-160.

[6]HAIGIS M C,SINCLAR D A.Mammalian Sirtuins: Biological insights and disease relevance[J].Annu Rev Pathol,2010,5:253-295.

[7]BAUR J A,UNGVARI Z,MINOR R K,et al.Are Sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan?[J].Nat Rev Drug Discov,2012,11(6):443-461.

[8]LEE H W,SUH J H,KIM A Y,et al.Histone deacetylase 1-mediated histone modification regulates osteoblast differentiation[J].Mol Endocrinol,2006,20(10):2432-2443.

[9]WEITZMANN M N,PACIFICI R.Estrogen deficiency and bone loss: An inflammatory tale[J].Clin Invest,2006,116(5):1186-1194.

[10]GUILLERMINET F,BEAUPIED H,FABIEN-SOULE V,et al.Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice: an in vitro and in vivo study[J].Bone,2010,46(3):827-834.

[11]TSENG P C,HOU S M,CHEN R J,et al.Rensvertrol promotes osteogensis of human mescenchymal cells by upregulating RUNX2 gene via the SIRT1FOXO3A axis[J].Bone Miner Res,2011,26(10):2552-2563.

Protective Effects of Collagen Peptide from Pollock Skin against H2O2Induced Human Osteoblasts Oxidative Damage

XUE Ling-fang1,CHEN Xue-hong1,XU Hong-wei2*,HAN Yan-tao1*et al

(1.Department of Pharmacology of Qingdao University,Qingdao,Shandong 266021;2.Basic Medical College of Qingdao University,Qingdao,Shandong 266021)

[Objective]The aim was to investigate the protective mechanism of collagen peptide from pollock skin by establishing the H2O2induced human osteoblasts oxygen damaged model.[Method]Human osteoblast cells in logarithmic growth phase were divided into four groups:normal control group,H2O2induced oxygen damaged group,collagen peptide low (100 μg/mL),medium(300 μg/mL) and high(600 μg/mL) does group,positive control group(300 μg/mL VitE).CCK-8 method was performed to determine the survival rate of osteoblasts cells.The content of SOD and MDA were detected by enzymic method.The expression levels of Foxo3 mRNA was determined by PCR,Western Blot was used to detect the protein expression levels of Foxo3 and Sirt1.[Result]Compared with the control group,the survival rate of osteoblasts cells,the level of SOD and the expression of Sirt1 protein in model group was increased,while the content of MDA,the expression of Foxo3a mRNA and Foxo3a protein were declined significantly.[Conclusion]The osteoblasts oxygen damaged model was established induced by 300 μmol/L H2O2.A certain concentration of collagen peptide could reduce the content of MDA and increase the content of SOD against oxygen damage.The mechanism might be related to down-regulating the expression of Foxo3a and up-regulating the expression of Sirt1.

Collagen peptide;Osteoporosis;Hydrogen peroxide;Human osteoblasts;Oxidative damage

青島市民生科技計劃項目(14-2-3-50-nsh)。

薛玲芳(1989- )，女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：生化藥學。*通訊作者，徐宏偉，副教授，博士，碩士生導師，從事生化藥學研究；韓彥弢，副教授，博士，碩士生導師，從事海洋藥物與功能食品研究。

2016-07-06

S 986.2

A

0517-6611(2016)25-142-04