• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    電刺激改善牛肉嫩度的蛋白質(zhì)組學研究

    2016-10-18 05:52:17
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2016年25期
    關(guān)鍵詞:途徑

    沈 瑾

    (山東省新泰市農(nóng)業(yè)局,山東新泰 271200)

    ?

    電刺激改善牛肉嫩度的蛋白質(zhì)組學研究

    沈 瑾

    (山東省新泰市農(nóng)業(yè)局,山東新泰 271200)

    [目的]研究電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)的影響。[方法]利用牛背最長肌雙向電泳凝膠體系研究電刺激后牛背最長肌中的差異蛋白質(zhì),分析宰后1和3 d時電刺激處理牛背最長肌中有顯著降解的差異蛋白點。[結(jié)果]與未電刺激樣品相比,在宰后1和3 d電刺激處理牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào),分為9種蛋白質(zhì):肌間線蛋白、肌鈣蛋白-T、肌球蛋白結(jié)合蛋白H;肌酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶;過氧化物氧化還原酶、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白;組蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶。[結(jié)論]電刺激后9種蛋白質(zhì)通過4條途徑影響電刺激后嫩度變化,包括糖酵解代謝途徑、鈣激活中性蛋白酶途徑、溶酶體途徑和氧化應激途徑。電刺激通過通過4條途徑影響嫩度的信號通路表明,牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯(lián)系;電刺激在一定程度上抑制增殖,加速氧化和凋亡,加快嫩化。

    牛背最長肌;電刺激;嫩度;蛋白質(zhì)降解;差異蛋白質(zhì)組

    嫩度是決定牛肉食用品質(zhì)的最重要指標[1]。大量調(diào)查表明,消費者可以將不同嫩度的肉區(qū)分出來,并愿意以高價購買嫩度較好的牛肉。嫩度的高低在一定程度上決定牛肉食用品質(zhì)的優(yōu)劣[2]。牛肉的嫩度除受肉牛年齡和品種等生理方面的影響外,還包括牛屠宰后所采取的處理方式,如冷卻處理、電刺激處理等。電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)降解的影響仍是肉品界的研究熱點。研究表明,電刺激確實提高了宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解速度,其原因可能是電刺激導致蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)組學的核心為雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù),筆者研究電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)的影響,以期為研究牛肉嫩度的改善提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1材料選擇體重(629.0±50.3)kg、18月齡的雜交黃牛(延邊?!廖鏖T塔爾牛)20頭,并隨機分成2組。肉牛按伊斯蘭屠宰流程屠宰。宰后5 min內(nèi),對其中一組進行電刺激(EST-601型電刺激儀,電壓為42 V,電流為0.7 A,頻率為50 Hz,時間為40 s;Electrical stimulation-ES),另一組未電刺激為對照組(No electrical stimulation-NS)。胴體剝皮、劈半后進入成熟車間(0~4 ℃,濕度90%,風速0.5 m/s)冷卻、成熟,宰后1、3 d時在胴體12~13肋骨間取50 g肉塊放入液氮內(nèi)速凍后保存在-80 ℃,備用。

    1.2樣品處理取冷凍肌肉組織100 mg,加入1 mL裂解液孵化40 min,裂解液含8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、65 mmol/L DTT、1%兩性電解質(zhì)(pH 3~10)。12 000 r/min離心60 min,取上清,使用2D quant kit 定量試劑盒進行蛋白濃度定量,分裝到離心管,保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.3雙向電泳將含有400 μg樣品的再水化液加到24 cm IPG膠條中,過夜使膠條再水化。再水化液包括8 mol/L尿素、0.5% CHAPS、0.28% DTT、1%IPG buffer(pH 3~10)、10%甘油、溴酚藍,等電聚焦條件為50 V水化12 h,100 V 2 h,200 V 1 h,500 V 30 min,1 000 V 20 min,3 000 V 20 min。等電聚焦后,在10 mL含50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、6 mol/L 尿素、2% SDS、20%甘油、溴酚藍、5 mmol/L TBP的平衡液中平衡IPG膠條,然后將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到12.5% SDS凝膠上,進行第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),最初使用每塊膠10 mA 1 h,待蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠的濃縮膠上濃縮成一條線后,開始使用每塊膠20 mA,直至溴酚藍到達底部邊緣時停止電泳。凝膠在含考馬斯亮藍G-250、95%乙醇、85%磷酸的染色液中染色,搖床振蕩30 min,使用超純水脫色2 h。電泳圖譜染色完畢后,采用掃描儀對雙向電泳凝膠圖進行掃描分析,分辨率為300 dpi。采用凝膠圖像分析軟件PDQuest7.0分析圖像,對雙向電泳凝膠上的差異蛋白點進行檢測分析,考染后有2倍以上差異的蛋白點被鑒定出來,最后對差異蛋白點進行質(zhì)譜分析。

    2 結(jié)果與分析

    經(jīng)考馬斯亮藍染色的雙向電泳凝膠通過計算機輔助圖像軟件的分析,檢測到650~669個點。宰后1和3 d時電刺激處理樣品的雙向電泳凝膠圖譜見圖1、2。

    注:蛋白質(zhì)上樣量為400 μg,膠條pH 3~10,膠條長度24 cm,SDS凝膠為12.5%。Note:Protein(400 μg)was loaded and separated in the IPG 3-10 strip(24 cm)and an SDS gel(12.5% T).圖1 宰后1 d時電刺激與未電刺激處理牛背最長肌蛋白質(zhì)表達的比較Fig.1 Comparative analysis of the expressed protein patterns between no simulated group and 1 d post-ES group

    對宰后1和3 d時ES和NS處理樣品經(jīng)雙向電泳并對凝膠染色后,使用PDQuest2D軟件對不同凝膠重復性進行分析,發(fā)現(xiàn)有6個蛋白質(zhì)點的蛋白豐度差異達2倍以上。對雙向電泳后得到的顯著差異蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析,得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。以MASCOT離子搜索模式,檢索NCBI真核生物的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,共成功鑒定出12個蛋白點。其中,細胞骨架蛋白4個,激酶抑制蛋白1個,代謝酶4個,過氧化物氧化還原酶2個,甲基轉(zhuǎn)移酶1個(表1、2)。

    注:蛋白質(zhì)上樣量為400 μg,膠條pH 3~10,膠條長度24 cm,SDS凝膠為12.5%。Note:Protein(400 μg)was loaded and separated in the IPG 3-10 strip(24 cm)and an SDS gel(12.5% T).圖2 宰后3 d時電刺激與未電刺激處理牛背最長肌蛋白質(zhì)表達的比較分析Fig.2 Comparative analysis of the expressed protein patterns in between no simulated group and 3 d post-ES group

    表1 宰后1 d時電刺激處理牛背最長肌樣品中鑒定的差異蛋白點

    表2 宰后3 d時電刺激處理牛背最長肌樣品中鑒定的差異蛋白點

    由表1、2可知,與未電刺激樣品相比,在宰后1和3 d電刺激處理牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào),分為9種蛋白質(zhì):肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白-T(Troponin T alpha isoform)、肌球蛋白結(jié)合蛋白H(Myosin binding protein H);肌酸激酶(Creatine kinase,2個)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase,2個);過氧化物氧化還原酶(Peroxiredoxin-6,2個)、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein);組蛋白(Histone H3.3-like isoform 2)、甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase)。

    3 討論

    3.1電刺激通過糖酵解代謝途徑影響嫩度動物屠宰后,肌肉中的能量代謝系統(tǒng)從有氧代謝轉(zhuǎn)為無氧代謝,ATP主要來源于糖原降解為乳酸及磷酸肌酸中磷酸轉(zhuǎn)移給ADP[3]。肌酸激酶能夠催化ATP與ADP間磷酸基團的可逆轉(zhuǎn)移。研究表明,電刺激能夠加速宰后的糖酵解[4-6],且發(fā)現(xiàn)有些代謝酶因為電刺激而導致表達改變[7]。另外,在糖酵解及糖異生過程中,磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)發(fā)揮了作用,催化3-磷酸甘油醛與磷酸二羥丙酮[8]間的轉(zhuǎn)換。磷酸丙糖異構(gòu)酶已被用作藥物設(shè)計的一個靶目標[9]。屠宰后糖酵解酶的增加有可能是為了增加糖酵解速率,以維持ATP的生成。因此,電刺激后代謝酶Creatine kinase和Triosephosphate isomerase表達下調(diào),表明電刺激加快糖酵解途徑,Creatine kinase和Triosephosphate isomerase快速消耗,防止肌肉快速冷卻時的冷收縮,使胴體內(nèi)能量大量消耗,ATP轉(zhuǎn)化ADP為磷酸鹽,釋放出鈣離子,乳酸積累,形成高溫低pH環(huán)境,嫩度提高。

    3.2電刺激通過鈣激活中性蛋白酶途徑影響嫩度研究表明,細胞骨架蛋白Titin、Nebulin、Desmin和Troponin-T的降解使肌原纖維發(fā)生一系列的物理、化學和結(jié)構(gòu)的變化,導致肌纖維小片化,破壞了肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性,并最終改善了肉嫩度[10-11]。電刺激電流通過神經(jīng)系統(tǒng)或直接使肌膜去極化引起肌肉收縮,使肉的糖酵解速率提高,肉胴體溫度升高,pH迅速降低,進而影響Calpain/Calpastatin的比例[12],也可能是肌漿鈣離子濃度較高激活Ca1pains蛋白酶體系,蛋白質(zhì)降解加速,并最終導致肉的快速嫩化。電刺激后骨架蛋白Desmin、Troponin T alpha isoform、Myosin binding protein H表達下調(diào),表明電刺激激活Calpains蛋白酶體系,加速降解骨架蛋白Desmin、Troponin T alpha isoform、Myosin binding protein H,剪切力降低,嫩度提高。

    3.3電刺激通過溶酶體途徑影響嫩度溶酶體內(nèi)的酶均屬于酸性水解酶,反應的最適pH為5.0左右,溶酶體膜有質(zhì)子泵,將H+泵入溶酶體,使其pH降低。如果細胞pH下降至5.0左右,會導致酸性水解酶活化,水解溶酶體膜,最終導致溶酶體膜裂解,溶酶體酶釋放,使細胞、組織自溶。當細胞中pH接近中性時,Peroxiredoxin-6在肌漿中發(fā)揮過氧化物氧化還原酶活性,當細胞中pH為5.0左右時,Peroxiredoxin-6在溶酶體發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性,利用溶酶體途徑來調(diào)控肉類中骨架蛋白的降解[13-14]。電刺激后Peroxiredoxin-6表達下調(diào),表明電刺激后pH不斷下降,直到pH為5.4左右,肌漿中Ca2+濃度升高,Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性,導致溶酶體膜破裂,溶酶體內(nèi)的水解酶釋放,使肌肉蛋白水解,嫩度提高。

    3.4電刺激通過氧化應激途徑影響嫩度Peroxiredoxin是近年來發(fā)現(xiàn)的可以保護機體細胞免受氧化劑損傷的蛋白質(zhì)家族,可以清除機體內(nèi)的H2O2和烷基過氧化物,通過其過氧化物酶活性,保護細胞免受氧化損傷。Peroxiredoxin-6是一個雙功能蛋白,具有過氧化物酶和磷脂酶A2雙重活性。Peroxiredoxin-6在pH接近中性時,發(fā)揮過氧化物氧化還原酶活性,通過p38 MAPK級聯(lián)途徑刺激增殖和抑制細胞凋亡[15-17]。電刺激后Peroxiredoxin-6表達下調(diào),表明電刺激后pH不斷下降,直至pH為5.4左右,肌漿中Ca2+濃度升高,Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性,通過溶酶體途徑使肌肉蛋白水解,在一定程度上抑制了p38 MAPK級聯(lián)途徑,抑制增殖,加速氧化凋亡,嫩度提高。

    哺乳動物中的PEBP具有雙重作用,包括脂質(zhì)結(jié)合及使絲氨酸蛋白酶受到抑制[18]。牛屠宰后胴體內(nèi)產(chǎn)生活性氧,激活Ras-MAPK級聯(lián)途徑,PEBP與Raf-1相互起作用,抑制Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑。電刺激后PEBP表達下調(diào),表明電刺激加速PEBP抑制Ras-MAPK級聯(lián)途徑,抑制增殖,加速氧化凋亡,嫩度提高。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路誘導細胞的增殖,避免細胞發(fā)生凋亡,且能夠激活甲基轉(zhuǎn)移酶MT[19-20]。而MT表達越低,甲基化水平越低,凋亡越快。電刺激后組蛋白和甲基轉(zhuǎn)移酶下調(diào),表明甲基轉(zhuǎn)移酶表達降低,組蛋白甲基化水平降低,加速凋亡,在一定程度上抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路,抑制增殖,加速氧化凋亡,嫩度提高。

    電刺激后Peroxiredoxin-6、PEBP、Histone、MT表達下調(diào),表明電刺激通過抑制p38 MAPK級聯(lián)途徑、Ras-MAPK級聯(lián)途徑和PI3K/Akt信號通路,抑制增殖,加速氧化凋亡,嫩度提高。

    4 結(jié)論

    該研究運用蛋白質(zhì)組學方法研究了電刺激宰后1和3 d牛背最長肌中降解的蛋白質(zhì)。利用雙向電泳技術(shù)和軟件分析鑒定,確定在電刺激宰后1和3 d牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào),分為9種蛋白質(zhì):肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白-T(Troponin T alpha isoform)、肌球蛋白結(jié)合蛋白H(Myosin binding protein H);肌酸激酶(Creatine kinase,2個)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase,2個);過氧化物氧化還原酶(Peroxiredoxin-6,2個)、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP);組蛋白(Histone H3.3-like isoform 2)、甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase)。分析電刺激處理后的差異蛋白質(zhì)影響嫩度的作用機制表明,電刺激處理后鑒定的9種差異蛋白質(zhì)主要通過4條途徑影響嫩度變化,分別為糖酵解代謝途徑、鈣蛋白酶途徑、溶酶體途徑、氧化應激途徑。電刺激通過氧化應激途徑影響嫩度的信號通路表明,牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯(lián)系;電刺激在一定程度上抑制增殖,加速氧化和凋亡,加快嫩化。具體機制還需要進一步試驗驗證。

    該研究鑒定出的代謝酶為進一步研究成熟嫩化、氧化和凋亡提供了新思路,如對牛肉中基因進行分離及遺傳效應分析,基因的敲除或者過表達,啟動子克隆和轉(zhuǎn)錄因子的研究,可以進行基因結(jié)構(gòu)、時空表達譜、多態(tài)性及性狀關(guān)聯(lián)分析等方面的研究,建立與嫩度的關(guān)系,從而指導生產(chǎn)。從基因水平上,進一步研究代謝通路及基因網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論意義。

    [1]SHACKELFORD S D,WHEELER T L,MEADE M K,et al.Consumer impressions of Tender Select beef[J].Journal of animal science,2001,79:2605-2614.

    [2]BOLEMAN S J,BOLEMAN S L,MILLER R K,et al.Consumer evalution of beef of known categories of tenderness[J].J Anim Sci,1997,75:1521-1524.

    [3]POSO A R,PUOLANNE E.Carbohydrate metabolism in meat animals[J].Meat science,2005,70(3):423-434.

    [4]DAVEY C L,GILBERT K V,CARSE W A.Carcass electrical-stimulation to prevent cold shortening toughness in beef[J].New Zealand journal of agricultural research,1976,19(1):13-18.

    [5]SMULDERS F J M,EIKELENBOOM G,VANLOGTESTIJN J G.The effect of electrical stimulation on the quality of 3 bovine muscles[J].Meat science,1986,16(2):91-101.

    [6]EILERS J D,TATUM J D,MORGAN J B,et al.Modification of early postmortem muscle pH and use of postmortem aging to improve beef tenderness[J].Journal of animal science,1996,74(4):790-798.

    [7]MARTIN A H,MURRAY A C,JEREMIAH L E,et al.Electrical stimulation and carcass aging on beef carcass in relation to postmortem glycolysis rate[J].Journal of animal science,1983,57:1456-1462.

    [8]BAUMAN D E,DEKAY D E,INGLE D L,et al.Effect of glycerol and glucose additions on lipogenesis from acetate in rat and cow mammary tissue[J].Comparative biochemistry and physiology part B:Comparative biochemistry,2002,43:479-486.

    [9]ENRIQUEZ-FLORES S,RODRIGUEZ-ROMERO A,HERNANDEZ-ALCANTARA G,et al.Species-specific inhibition of Giardia lamblia triosephosphate isomerase by localized perturbation of the homodimer[J].Molecular and biochemical parasitology,2008,157:179-186.

    [10]HO C Y,STROMER M H,ROBSON R M.Effect of electrical stimulation on postmortem titin,nebulin,desmin,and troponin-T degradation and ultrastructural changes in bovine longissimus muscle[J].J Anim Sci,1996,74:1563-1575.

    [11]HUFF-LONERGAN E,ZHANG W,LONERGAN S M.Biochemistry of postmortem muscle -Lessons on mechanisms of meat tenderization[J].Meat science,2010,86(1):184-195.

    [12]KOOHMARAIE M,SEIDEMAN S D,SCHOLLEMEYER J E,et al.Effect of post-mortem storage on Ca2+-dependant proteases,heir inhibitor and myofibrile fragmentation[J].Meat Sci,1987,19(3):187-196.

    [13]FISHER A B.Peroxiredoxin 6:A bifunctional enzyme with glutathione peroxidase and phospholipase A activities[J].Antioxid Redox Signal,2011,15:831-844.

    [14]FISHER A B,DODIA C.Role of phospholipase A2enzymes in degradation of dipalmitoyl phosphatidyl choline by granular pneumocytes[J].J Lipid Res,1996,37(5):1057-1064.

    [15]NICK J A,YOUNG S K,BROWN K K.Role of p38 mitogen-activated protein kinase in a murine model of Pulmonaxy inflammation[J].J Immunol,2000,164(4):2151-2159.

    [16]SETERNES O M,JOHANSEN B,HEGGE B.Both binding and activation of p38 mitogen activated protein kinase(MAPK)play essential roles in regulation of the nucleocytoplasmic distribution of MAPK activated protein kinase 5 by cellular stress[J].Mol Cell Biol,2002,20:6931-6945.

    [17]NEW L,JIANG Y,HAN J.Regulation of PRAK subcellular location by P38 MAP kinases[J].Mol Biol Cell,2003,14:2603-2616.

    [18]LI F F,SONG S J,ZHANG R N.Phosphatidylethanolamine-binding protein(PEBP)in basic and clinical study[J].Sheng Li Ke Xue Jin Zhan,2009,40(3):214-218.

    [19]OSAKI M,OSHIMURA M,ITO H.PI3K-Akt pathway:Its functions and alterations in human cancer[J].Apoptosis,2004,9(6):667-676.

    [20]SONG G,OUYANG G,BAO S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival[J].J Cell Mol Med,2005,9(1):59-71.

    The Proteomic Analysis of Beef Tenderness after Electrical Stimulation

    SHEN Jin

    ( Xintai Agricultural Bureau,Xintai,Shandong 271200)

    [Objective]To research the effects of electrical stimulation (ES) on beef protein in the mature process after slaughter.[Method]The differential proteins were identified using the system of two-dimensional electrophoresis gels on muscle longissimus to analysis the relations to tenderness in this system.Differential protein spots with significant degradation during muscle longissimus ES were analyzed after 1 and 3 d of slaughtering.[Result]Compared with no ES samples,twelve protein spots were down-regulated significantly at 1 and 3 d postmortem as a result of electrical stimulation.These proteins were identified as nine types: desmin,troponin T alpha isoform,myosin binding protein H,creatine kinase,triosephosphate isomerase,peroxiredoxin-6,phosphatidylethanolamine-binding protein,histone H3.3-like isoform 2,methyltransferase.[Conclusion]Proteins of nine types affects tenderness as a result of electrical stimulation through four pathways including glycolytic metabolic pathway,calpains pathway,lysosomal pathway,and oxidative stress pathway.These pathways indicate that meat tenderness is closely related to oxidation and apoptosis,electrical stimulation inhibites proliferation,accelerates oxidation and apoptosis and finally accelerates meat tenderization.

    Muscle longissimus;Electrical stimulation;Tenderness;Protein degradation;Differential proteomics

    沈瑾(1983- ),女,山東新泰人,農(nóng)藝師,博士,從事食品科學研究。

    2016-07-20

    TS 201.2+1

    A

    0517-6611(2016)25-112-04

    猜你喜歡
    途徑
    求解不等式恒成立問題的三種途徑
    求解含參不等式恒成立問題的三種途徑
    構(gòu)造等腰三角形的途徑
    多種途徑理解集合語言
    減少運算量的途徑
    成功的途徑
    醫(yī)?;稹翱沙掷m(xù)”的三條途徑
    立法人民性的四條實現(xiàn)途徑
    分級診療有三個可行途徑
    BDNF/TrkB信號途徑與抗腫瘤治療
    女同久久另类99精品国产91| 99热精品在线国产| 亚洲精品国产av成人精品| 听说在线观看完整版免费高清| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av国产免费在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 三级国产精品欧美在线观看| 高清午夜精品一区二区三区 | 精品人妻视频免费看| 少妇高潮的动态图| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲图色成人| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美极品一区二区三区四区| 桃色一区二区三区在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| avwww免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 永久网站在线| .国产精品久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 麻豆一二三区av精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久草成人影院| 国产美女午夜福利| 久久久国产成人免费| 99riav亚洲国产免费| 午夜福利在线观看吧| 六月丁香七月| 深爱激情五月婷婷| 长腿黑丝高跟| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 又粗又爽又猛毛片免费看| av天堂在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 日韩一本色道免费dvd| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩欧美 国产精品| 日韩人妻高清精品专区| 精品人妻偷拍中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 久久精品91蜜桃| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 波野结衣二区三区在线| 人人妻人人看人人澡| 欧美高清成人免费视频www| a级一级毛片免费在线观看| 国内精品久久久久精免费| 国内精品久久久久精免费| 亚洲在线观看片| 国产成人精品一,二区 | www.色视频.com| 日韩中字成人| 久久99精品国语久久久| 国产极品天堂在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 小说图片视频综合网站| 网址你懂的国产日韩在线| kizo精华| 看黄色毛片网站| 色5月婷婷丁香| 国语自产精品视频在线第100页| 在线播放无遮挡| 国产色爽女视频免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲不卡免费看| 内地一区二区视频在线| 亚洲国产精品国产精品| 高清在线视频一区二区三区 | 激情 狠狠 欧美| 欧美性感艳星| 日本爱情动作片www.在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国模一区二区三区四区视频| 好男人在线观看高清免费视频| 国内精品宾馆在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99热全是精品| 中出人妻视频一区二区| 国产91av在线免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品久久久噜噜| 人人妻人人看人人澡| 国产免费男女视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 九九在线视频观看精品| 91久久精品电影网| 日本五十路高清| 精品国产三级普通话版| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 97在线视频观看| 欧美日韩乱码在线| 六月丁香七月| 一进一出抽搐动态| 国产精品蜜桃在线观看 | 国产精品野战在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 黄色配什么色好看| 在线天堂最新版资源| 日韩人妻高清精品专区| 精华霜和精华液先用哪个| avwww免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产亚洲精品久久久com| 简卡轻食公司| 嘟嘟电影网在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 99久久精品一区二区三区| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲成人久久性| av在线观看视频网站免费| 一区福利在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久性生活片| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品电影一区二区三区| 久久久久久久久久成人| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美又色又爽又黄视频| 久久国产乱子免费精品| 五月玫瑰六月丁香| 中国国产av一级| 一本久久中文字幕| 又爽又黄无遮挡网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成年女人永久免费观看视频| 观看美女的网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久99热6这里只有精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av中文av极速乱| 国产私拍福利视频在线观看| 国产一区二区激情短视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日本黄色片子视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 毛片女人毛片| 99热全是精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲国产精品合色在线| 国产高潮美女av| av免费观看日本| 日韩三级伦理在线观看| 综合色丁香网| 麻豆国产av国片精品| 极品教师在线视频| 日韩视频在线欧美| 少妇高潮的动态图| 22中文网久久字幕| 日韩制服骚丝袜av| 一级毛片久久久久久久久女| 熟女人妻精品中文字幕| 九九爱精品视频在线观看| 国产成人精品一,二区 | 我的女老师完整版在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩欧美精品免费久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 中文字幕久久专区| 国产免费男女视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| a级毛片免费高清观看在线播放| videossex国产| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 免费看光身美女| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲欧洲国产日韩| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 1000部很黄的大片| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲最大成人av| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产伦精品一区二区三区四那| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品成人久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 丝袜美腿在线中文| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久精品大字幕| 九草在线视频观看| 欧美又色又爽又黄视频| 波多野结衣高清作品| 国产精品久久视频播放| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲在线自拍视频| 国产黄片美女视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品久久久久久av不卡| 免费看日本二区| 日韩成人伦理影院| 两个人的视频大全免费| 九草在线视频观看| 波多野结衣高清无吗| 国产成年人精品一区二区| 亚洲18禁久久av| 国产黄色小视频在线观看| 97热精品久久久久久| 成人av在线播放网站| 免费观看精品视频网站| 九九在线视频观看精品| 久久精品国产自在天天线| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久九九精品影院| 亚洲图色成人| 波野结衣二区三区在线| 在线观看一区二区三区| 乱人视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产久久久一区二区三区| 国产伦在线观看视频一区| 久久热精品热| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品久久久久久久久免| 国产亚洲精品av在线| 日韩精品青青久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 1024手机看黄色片| 久久人妻av系列| 国产老妇女一区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美zozozo另类| 国产美女午夜福利| 成人欧美大片| 欧美三级亚洲精品| 精品午夜福利在线看| 国内精品宾馆在线| 日本一本二区三区精品| 在线观看免费视频日本深夜| www.色视频.com| 六月丁香七月| 级片在线观看| h日本视频在线播放| 日本与韩国留学比较| 我要看日韩黄色一级片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费人成在线观看视频色| 成人毛片60女人毛片免费| 免费电影在线观看免费观看| 一级毛片我不卡| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品国产高清国产av| 黄片wwwwww| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产成人精品久久久久久| av免费在线看不卡| 插阴视频在线观看视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | ponron亚洲| 色哟哟·www| 久久久久网色| 欧美潮喷喷水| 日韩人妻高清精品专区| 色综合站精品国产| 国产麻豆成人av免费视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久精品94久久精品| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美精品一区二区大全| 少妇的逼好多水| 久99久视频精品免费| 欧美潮喷喷水| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品色激情综合| 午夜精品在线福利| 天堂网av新在线| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品三级大全| 99热全是精品| 亚洲性久久影院| 蜜臀久久99精品久久宅男| 中国国产av一级| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费看光身美女| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本在线视频免费播放| 在线天堂最新版资源| 国产成人福利小说| 国产精品一二三区在线看| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩欧美精品v在线| 两个人视频免费观看高清| 99久久人妻综合| 欧美三级亚洲精品| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品夜色国产| 日本熟妇午夜| 美女国产视频在线观看| 老司机影院成人| 日韩一区二区视频免费看| 久久精品人妻少妇| 我要看日韩黄色一级片| 国产69精品久久久久777片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美激情在线99| 天堂影院成人在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99在线人妻在线中文字幕| 一进一出抽搐动态| 麻豆成人av视频| 热99在线观看视频| 午夜福利视频1000在线观看| 久久人妻av系列| 久久欧美精品欧美久久欧美| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产乱人偷精品视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人福利小说| 国产中年淑女户外野战色| 日本熟妇午夜| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美色视频一区免费| 久久久欧美国产精品| 国产精品无大码| 久久午夜福利片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美+日韩+精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 禁无遮挡网站| 麻豆一二三区av精品| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲三级黄色毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 嫩草影院精品99| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 乱系列少妇在线播放| 亚洲欧美日韩东京热| 精品一区二区免费观看| 好男人在线观看高清免费视频| 尾随美女入室| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久久九九精品影院| 国产精品不卡视频一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲精品国产av成人精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一区二区三区四区激情视频 | 日日啪夜夜撸| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 丝袜美腿在线中文| 97在线视频观看| 淫秽高清视频在线观看| 变态另类丝袜制服| 国产高潮美女av| 三级经典国产精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲精品456在线播放app| 久久精品91蜜桃| 我要搜黄色片| 乱码一卡2卡4卡精品| 三级国产精品欧美在线观看| 国产视频首页在线观看| 在线播放国产精品三级| 日韩av不卡免费在线播放| 嫩草影院新地址| 国产高清三级在线| 村上凉子中文字幕在线| 男女视频在线观看网站免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 午夜福利在线在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本色播在线视频| 亚洲最大成人手机在线| 欧美高清成人免费视频www| av国产免费在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 免费av观看视频| 91av网一区二区| 好男人视频免费观看在线| 看黄色毛片网站| 久久亚洲精品不卡| 51国产日韩欧美| 国语自产精品视频在线第100页| 一级毛片电影观看 | 嫩草影院精品99| 精品久久久久久成人av| 在线观看av片永久免费下载| 六月丁香七月| 成人午夜精彩视频在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美激情在线99| 国产麻豆成人av免费视频| 国产伦在线观看视频一区| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产三级在线视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲三级黄色毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精华一区二区三区| 中文字幕av在线有码专区| 热99在线观看视频| 国产成人aa在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成年女人永久免费观看视频| 少妇熟女欧美另类| 国语自产精品视频在线第100页| 精品久久久久久久久亚洲| 久久国内精品自在自线图片| 尾随美女入室| 97超视频在线观看视频| 亚洲av不卡在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 69av精品久久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 毛片女人毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 长腿黑丝高跟| 中文字幕免费在线视频6| 日韩精品青青久久久久久| 一级毛片我不卡| 色5月婷婷丁香| 国产成年人精品一区二区| 校园春色视频在线观看| av天堂在线播放| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲欧美清纯卡通| 免费看光身美女| 成年女人永久免费观看视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 麻豆国产av国片精品| 婷婷亚洲欧美| 舔av片在线| 成人美女网站在线观看视频| 一本久久精品| 国产在线男女| 我的女老师完整版在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 两个人的视频大全免费| 夜夜爽天天搞| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚州av有码| 色尼玛亚洲综合影院| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男女边吃奶边做爰视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日韩欧美精品v在线| 久久精品夜色国产| 欧美三级亚洲精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 可以在线观看毛片的网站| 草草在线视频免费看| 秋霞在线观看毛片| 悠悠久久av| 亚洲精品国产av成人精品| 国内精品一区二区在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 国产 一区 欧美 日韩| 婷婷色综合大香蕉| 国产亚洲欧美98| 22中文网久久字幕| 一本一本综合久久| 一个人看的www免费观看视频| 国产黄色小视频在线观看| 18+在线观看网站| 深夜精品福利| 级片在线观看| 精品一区二区免费观看| 人妻久久中文字幕网| 最好的美女福利视频网| 精品人妻熟女av久视频| av天堂中文字幕网| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲在久久综合| a级毛片a级免费在线| 国产成人a区在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 国产91av在线免费观看| 亚洲欧美精品专区久久| 久久久久性生活片| 日韩人妻高清精品专区| 老司机影院成人| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩av在线大香蕉| 免费看光身美女| 深爱激情五月婷婷| 看片在线看免费视频| 精品午夜福利在线看| 一本精品99久久精品77| 国产高清激情床上av| 国产91av在线免费观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线天堂最新版资源| 免费搜索国产男女视频| 亚洲,欧美,日韩| 九九热线精品视视频播放| 久久久久久久久中文| 国产亚洲91精品色在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 婷婷色综合大香蕉| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 最好的美女福利视频网| 能在线免费观看的黄片| 欧美三级亚洲精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲第一电影网av| 日韩制服骚丝袜av| 校园春色视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 最近的中文字幕免费完整| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲人与动物交配视频| 久久热精品热| 成人性生交大片免费视频hd| 三级国产精品欧美在线观看| 99久国产av精品国产电影| 成年女人看的毛片在线观看| 97热精品久久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 欧美zozozo另类| 成年版毛片免费区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久久久久久成人| 一个人免费在线观看电影| 亚洲成av人片在线播放无| avwww免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 99久久中文字幕三级久久日本| av黄色大香蕉| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 一本久久精品| av.在线天堂| 禁无遮挡网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产真实乱freesex| 精品人妻偷拍中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 中文欧美无线码| 性欧美人与动物交配| 亚洲乱码一区二区免费版| 干丝袜人妻中文字幕| 久久99精品国语久久久| 如何舔出高潮| 亚洲成人精品中文字幕电影| 啦啦啦啦在线视频资源| 成人三级黄色视频| 国产一级毛片在线| 最新中文字幕久久久久| 国产乱人偷精品视频| 国产高清视频在线观看网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 九九热线精品视视频播放| 国产精品人妻久久久久久| 综合色丁香网| 国语自产精品视频在线第100页| 一本久久精品| 一区二区三区高清视频在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品人妻视频免费看| 中出人妻视频一区二区| 99热网站在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲欧美成人精品一区二区| av在线天堂中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩欧美精品免费久久| 男的添女的下面高潮视频|