基于HPLC指紋圖譜對牛樟芝質(zhì)量評價研究

周春權(quán)　龐文生　胡　娟,*

1. 福建省中醫(yī)藥研究院，福建　福州　350003；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建　福州　350122

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基于HPLC指紋圖譜對牛樟芝質(zhì)量評價研究

周春權(quán)1龐文生2胡娟1,2*

1. 福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州350003；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122

目的：建立牛樟芝子實體HPLC指紋圖譜，使用中藥指紋圖譜相似度軟件進行分析，比較椴木上生長的菌絲體、液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)生的牛樟芝指紋圖譜相似度差異性，對不同方法生產(chǎn)的牛樟芝質(zhì)量進行評價。方法：采用島津LC-20AT高效液相色譜儀配備SPD-20AV檢測器，大連依利特C18色譜柱，流速為1mL/min，流動相為乙腈-0.2%冰乙酸水溶液二元梯度洗脫，檢測波長252nm，測定牛樟芝子實體HPLC指紋圖譜。結(jié)果：在上述條件下，三種培養(yǎng)方法產(chǎn)生的牛樟芝HPLC指紋圖譜相似度為0.787，其質(zhì)量具有一定的穩(wěn)定性和一致性。結(jié)論：通過比較牛樟芝指紋圖譜差異性，可以評價其質(zhì)量。

牛樟芝；HPLC指紋圖譜；質(zhì)量評價

牛樟芝亦名牛樟菇、樟生薄孔菌、樟窟內(nèi)菇、紅樟芝，寄生于臺灣特有的保育類樹種牛樟樹，通常腐生于牛樟樹上百年的樹干空洞內(nèi)[1]。研究表明，樟芝含有豐富的生理活性物質(zhì)，包括多糖體、三萜類化合物、超氧化物歧化酶、腺苷、小分子蛋白質(zhì)等，其中最主要的活性成分是多糖和三萜類化合物[2]。牛樟芝有抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、降血脂、降血糖等作用，被臺灣人視為“神菌”，價格日漲，一度高過冬蟲夏草[3]。

牛樟芝生長極為緩慢，自然產(chǎn)量稀少。為了滿足市場的需求，一些商家建立了液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵技術(shù)以縮短時間和增加牛樟芝產(chǎn)量[4]。也有一些人在其它樹木如香樟、沉水樟、甚至杉木上培育“樟芝”，造成牛樟芝產(chǎn)品質(zhì)量混亂。本項目建立牛樟芝子實體HPLC指紋圖譜，分別對三批次牛樟椴木、液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)生的“牛樟芝”HPLC指紋圖譜共有模式進行比較，以進行質(zhì)量評價。

1　儀器與材料

1.1儀器日本島津LC-20AT高效液相色譜儀配備SPD-20AV檢測器。

1.2材料牛樟椴木、液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)牛樟芝的干燥子實體。乙腈(德國Merck公司)為色譜純，其它試劑均為分析純。

2　方法

2.1供試品制備牛樟芝供試品，5倍量體積無水乙醇浸泡30min后，水浴回流提取2次，每次2h。合并兩次提取濾液后減壓濃縮至近干，真空減壓干燥得干浸膏粉。精密稱取牛樟芝乙醇干膏粉1g，用色譜甲醇超聲溶解，定容于5mL容量瓶中，所得牛樟芝質(zhì)量濃度為0.25g/mL。過0.45μm濾膜，備用。

2.2色譜條件采用乙腈-0.2%的醋酸溶液進行梯度洗脫，檢測波長為252nm，流速為1mL/min，室溫，進樣量10μL，梯度洗脫程序見表1。

表1　牛樟芝HPLC指紋圖譜梯度洗脫程序

2.3相似度計算選擇具有代表性的牛樟椴木、液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)牛樟芝的干燥子實體樣品各3個批次，通過實驗獲取樣本圖譜(即指紋圖譜)并進行共有峰的提取，然后根據(jù)對共有峰進行均值或中位數(shù)計算的結(jié)果建立樣品的對照指紋圖譜；再將各樣品的對照指紋圖譜進行保留時間、色譜峰匹配，最后采用相似度評價系統(tǒng)軟件自動計算相似度，采用雙定性、雙定量、相似度等參數(shù)作為其質(zhì)量評價的信息參數(shù)。

3　結(jié)果

3.1提取條件的優(yōu)化與確定在文獻[5]的基礎(chǔ)上，采用無水乙醇對牛樟芝的三萜類成分的提取效果較好；對比加熱回流和超聲處理提取牛樟芝三萜的效果，發(fā)現(xiàn)加熱回流的提取效果較佳；加熱回流2次、每次2h，提取效果較好。

3.2色譜條件的優(yōu)化與確定3.2.1檢測波長的選擇采用對245、250、252、260nm 4個波長下的特征峰數(shù)目及峰面積進行比較，其中252nm波長下牛樟芝的三萜類成分具有最大吸收，特征峰數(shù)目較多、峰面積較大，且基線平穩(wěn)，最終確定選擇252nm作為指紋圖譜的檢測波長。

3.2.2梯度洗脫條件的確定試驗采用乙腈-磷酸溶液、乙腈-冰醋酸溶液，調(diào)節(jié)不同的酸濃度進行梯度洗脫，其中乙腈-0.2%冰醋酸系統(tǒng)的洗脫效果較佳。

3.3指紋圖譜的建立與分析牛樟椴木牛樟芝3批，液態(tài)發(fā)酵牛樟芝3批，固態(tài)發(fā)酵牛樟芝3批；通過對不同類型樣品的指紋圖譜進行比較，采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)生成共有模式。三種類型的牛樟芝HPLC指紋圖譜共有模式疊加圖見圖1。

通過中藥指紋圖譜相似度軟件得出牛樟芝HPLC指紋圖譜共有模式并與共有模式比較得出的相似度，三種培養(yǎng)方法產(chǎn)生的牛樟芝相似度為0.787；所建立的方法不僅分離度較好，且標示出了7個主要的特征峰，三種培養(yǎng)方法產(chǎn)生的牛樟芝出峰均很明顯。結(jié)果表明，牛樟椴木培養(yǎng)、液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵牛樟芝指紋圖譜相似度較好，其質(zhì)量具有一定的穩(wěn)定性和一致性。

4　討論

因牛樟芝具有解毒保肝、抗癌、提高免疫、抗過敏、降血脂等神奇功效，素有“藥芝之王”、“臺灣森林中之紅寶石”的美譽。由于野生牛樟芝在民間的應(yīng)用廣泛，加之野生原料資源匱乏，其價格不斷高漲，并且激發(fā)了研究機構(gòu)、生物公司的強烈興趣。

目前，牛樟芝人工培育大致可以分為椴木栽培法、固體培養(yǎng)法、液體發(fā)酵法三種。椴木栽培法利用樟芝原有宿主牛樟樹椴木為培養(yǎng)基栽培牛樟芝，能獲得與野生牛樟芝相同之成分，功效相同，避免野生牛樟樹被盜伐，但培養(yǎng)時間長達二至三年，培養(yǎng)成本高。固體培養(yǎng)法將牛樟芝菌種以太空包進行菌絲體培養(yǎng)，太空包含有纖維物、醣類、五谷雜糧類等，培養(yǎng)時間約三個月，培養(yǎng)成本稍高。液體發(fā)酵法，利用液體發(fā)酵槽進行菌種液體發(fā)酵以收取菌絲體，培養(yǎng)時間短，約7～14d左右，培養(yǎng)成本較低。

本文對不同的人工培育法生產(chǎn)樟芝的HPLC化學(xué)指紋圖譜比較表明，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，不同人工方法培育的牛樟芝成份組成一致性在不斷提高，有利于牛樟樹資源的保護，同時滿足人們對牛樟芝健康產(chǎn)品的需求。

[1]陳體強, 李開本,林章余.臺灣食(藥)用菌發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技,2000(1): 20-21.

[2]Chang TunTschu，Wang WuRong，Chou ChengJen. Differentiation of mycelia and basidiomes of Antrodia cinnamomea using certain chemical components[J]. Taiwan Journal of Forest Science 2011, 26(2): 125-133.

[3]Chenhsien Lee, Kenghao Hsu, Shengyang Wang.Cloning and Characterization of the Lanosterol 14α-Demethylase Gene from Antrodia cinnamomea[J]. J. Agric. Food Chem. 2010, 58(12)：4800-4807.

[4]TunTschu Chang，Wurong Wang. Basidiomatal formation of Antrodia cinnamomea on artificial agar media[J]. Bot. Bull. Acad. Sin. 2005, 46(1):151-154.

[5]孫金旭.樟芝真菌萜類物質(zhì)提取研究及色譜指紋圖譜的建立[J].中國釀造, 2011(11):135-138.

(編輯：熊金富)

2016-05-12

福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)藥科研課題(wzze201309)；福建省科技廳省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1035-15)。

胡娟，女，從事中藥活性成分與質(zhì)量標準研究。Email: huj@fjtcm.edu.cn

R282.71

A

1007-8517(2016)15-0028-02