塞來昔布和5-FU聯(lián)用對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、VEGF和Survivin表達(dá)的影響

揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（揚(yáng)州市蘇北人民醫(yī)院）（225001）宋樹祥 陳平 柳欣欣 趙艷

胃癌的發(fā)生、發(fā)展與多種細(xì)胞因子的過度表達(dá)相關(guān)。近年來研究表明選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）在胃癌細(xì)胞中大量表達(dá)，其抑制劑對(duì)胃癌是否有抑制作用一直是研究熱點(diǎn)[1]。很多研究者通過基礎(chǔ)及臨床的多種研究認(rèn)為，COX-2抑制劑在抗腫瘤方面有重要作用，尤其是消化系統(tǒng)腫瘤，雖然COX-2抑制劑在腫瘤發(fā)展過程中的具體機(jī)制仍未闡明，但其作用明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。COX-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）以及凋亡相關(guān)基因Survivin之間可互相調(diào)節(jié)、協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[2][3]。我們應(yīng)用選擇性COX-2抑制劑塞來昔布作用于胃癌細(xì)胞株，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響；并將其與治療胃癌的常用化療藥物5一氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)用，探討兩者抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡可能的協(xié)同作用和相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 材料①實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞株BGC-823系購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。②主要試劑：塞來昔布購自美國(guó)輝瑞公司，5-FU購自Sigma公司；RPMI-DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)GIBCO公司、胎牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）及二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；RNA提取試劑盒購自北京天根公司，RT-PCR試劑盒購自南京唯贊生物科技公司；Marker、VEGF、Survivin、β-actin引物由深圳華大基因公司合成；③主要儀器：酶標(biāo)儀、梯度PCR儀、核酸擴(kuò)增儀、電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823胃癌細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI-DMEM培養(yǎng)基，使用時(shí)均加入10%的小牛血清和雙抗（100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素），置細(xì)胞于含有5%的CO2、37℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該細(xì)胞系在培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到整個(gè)培養(yǎng)皿的85%～90%，用0.25%胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞已傳至8代。

1.2.2 MTT比色分析法 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，2.5g/L胰蛋白酶消化，以RPMl-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×108/L，接種于96孔板(1×104/孔)，每孔接種100uL，貼壁24h后，分別加入含有不同濃度(0、100、200、300、400umoL/L)塞來昔布孵育24h、48h、72h后分別加入MTT，再孵育4h，棄去孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜，在酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%，對(duì)照組中細(xì)胞培養(yǎng)為普通營(yíng)養(yǎng)液加入相同含量DMSO混合液。邊緣空以PBS覆蓋減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增VEGF和Survivin基因序列，選擇β-actin作為內(nèi)參照。細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁后分別用塞來昔布IC50、5-FU（200umoL/L）及塞來昔布聯(lián)合5-FU孵育48h。收獲細(xì)胞1×107，RNA試劑盒法提取細(xì)胞總RNA。取5ulRNA按照Vazyme試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA. RNA500/檢測(cè)濃度。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增VEGF和Survivin基因序列，選擇β-actin作為內(nèi)參照。引物序列設(shè)計(jì)：VEGF上游引物為：5’-ATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3’，下游引物為：5’-TGCATGGTGATGTTGGAC-3’，擴(kuò)增片斷大小為382 bp，Survivin上游引物為：5’-GGCATGGGTGCCCCGACGTT-3’，下游引物為：5’-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3’，擴(kuò)增片段大小為439bp，內(nèi)參β-actin的上游引物為：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物為：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，擴(kuò)增片段大小為564bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。72℃徹底延7min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在70～80V電壓下電泳，30min后于凝膠成像及分析儀上進(jìn)行圖像成像，將電泳結(jié)果放在凝膠成像分析儀中分析結(jié)果。

附圖1 不同作用時(shí)間塞來昔布對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞lC50值

附圖2 M：Marker；A：對(duì)照組；B：塞來昔布200umoL/L；C：5-FU200umoL/L；D：塞來昔布+5-FU200umoL/L

附圖3 M：Marker；A：對(duì)照組；B：塞來昔布200umoL/L；C：5-FU200umoL/L；D：塞來昔布+5-FU200umoL/L

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用方差分析，兩樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以x±s表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞增生的影響 隨著藥物濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)，BGC-823胃癌細(xì)胞活性明顯下降，24h、48h、72h塞來昔布干預(yù)BGC-823胃癌細(xì)胞IC50為(255.36±21.1)umoL/L、(149.12±2.29)umoL/L、(89.95±1.61)umoL/L(見附圖1)。

2.2 塞來昔布聯(lián)合5-FU對(duì)VEGF和Survivin mRNA表達(dá)的影響 VEGF和Survivin mRNA在BGC-823胃癌細(xì)胞中表達(dá)正常。塞來昔布和5-FU聯(lián)用可完全抑制VEGF和Survivin mRNA在BGC-823胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，單獨(dú)用藥組也可抑制VEGF和Survivin mRNA的表達(dá)，但抑制效果無聯(lián)合應(yīng)用顯著，見附圖2、3。

3 討論

近年來，COX-2在消化道腫瘤中所起的作用日益受到重視。COX-2又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶，具有環(huán)氧合酶和過氧化物合成酶的功能，主要分布在腫瘤組織和腫瘤微血管組織中，在多種腫瘤組織和轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，增加腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力，抑制機(jī)體免疫功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移等[4][5]。

COX-2選擇性抑制劑塞來昔布在很多動(dòng)物模型中抑制腫瘤的發(fā)生：在偶氮甲烷所致的鼠大腸癌模型中，塞來昔布可使大腸癌的發(fā)生率和腫瘤數(shù)量分別減少93%和97%，并抑制異常結(jié)腸腺管灶的形成[6]。在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞株[7]及SMMC-7721細(xì)胞株陽[8]、結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29[9]，均有程度不同的抑制率。但是塞來昔布抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制目前還不十分清楚，這種作用可涉及多方面：如抑制腫瘤血管的形成[10]，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞亡，對(duì)磷酸化ERK表達(dá)的影響，并有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤消耗引起的消瘦而對(duì)正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、凋亡無明顯影響[11]。目前，關(guān)于COX-2抑制劑對(duì)腫瘤的抑制作用及其機(jī)制的研究已成為熱點(diǎn)。我們研究選擇性COX-2抑制劑塞來昔布和5-FU聯(lián)用對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷和誘導(dǎo)凋亡抑制VEGF以及Survivin mRNA的表達(dá)的作用，其目的是為臨床化療藥物和選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合抗腫瘤治療新思路的實(shí)行提供一些理論依據(jù)。本研究中，我們應(yīng)用塞來昔布干預(yù)BGC-823胃癌細(xì)胞，通過計(jì)算塞來昔布對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞的IC50值，從而明確，濃度梯度不變，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，BGC-823胃癌細(xì)胞增生受到抑制。

VEGF的表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)速度、微血管密度、血管結(jié)構(gòu)及腫瘤轉(zhuǎn)移等腫瘤的多種生物學(xué)特征有密切關(guān)系[12][13]。COX-2主要表達(dá)在新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞和形成血管的細(xì)胞中，目前認(rèn)為COX-2主要通過以下幾種途徑促進(jìn)腫瘤血管的生成：一方面COX-2可使腫瘤中VEGF的表達(dá)上調(diào)，抑制COX-2可抑制VEGF的表達(dá)；另一方面VEGF又可上調(diào)COX-2的表達(dá)，從而形成一個(gè)正反饋網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同刺激腫瘤血管生成[14]。研究認(rèn)為COX-2可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致腫瘤組織局部呈缺氧狀態(tài)，此時(shí)HIF-1被迅速激活，激活后的HIF-1又可以促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄，增加VEGF的表達(dá)。

隨著新的凋亡抑制家族成員的發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)Survivin高表達(dá)，包括肺癌、直腸癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌[15][16]。Srvivin是一種新發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡的蛋白IAP家族成員，定位于人染色體17q25上。其在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。很多學(xué)者集中研究Survivin與胰腺癌的關(guān)系。Satoh等[17]列發(fā)現(xiàn)，在胰腺導(dǎo)管癌中Survivin表達(dá)率為76.9%，導(dǎo)管乳頭狀鈣黏蛋白瘤中表達(dá)率為56.3%。Survivin在惡性腫瘤中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于良性腫瘤的表達(dá)。Survivin的主要作用為抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制基因，同時(shí)也是預(yù)后不良的因素之一。因而，其已經(jīng)成為腫瘤靶向治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。國(guó)外對(duì)前列腺癌和大腸癌的研究表明[18]，選擇性COX-2抑制劑可通過抑制survivin表達(dá)而達(dá)到治療腫瘤的目的。然而也有不同意見，Lubet RA和Gradilone A分別通過對(duì)膀胱癌和肺癌的研究表明[19]。COX-2抑制劑并不能影響survivin的表達(dá)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布、5-FU及塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用5-FU均可抑制VEGF和Survivin的表達(dá)，并且塞來昔布聯(lián)用5-FU抑制效果最為明顯。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，塞來昔布對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)有抑制作用，同時(shí)，對(duì)化療藥物的不敏感和耐藥是目前胃癌治療中存在的主要問題。我們的體外研究表明，選擇性COX-2抑制劑和5-FU的聯(lián)用可顯著提高胃癌細(xì)胞的殺傷率和凋亡發(fā)生率。然而，目前對(duì)于塞來昔布抑制腫瘤生長(zhǎng)的確切機(jī)制尚不十分清楚，但我們相信，隨著研究的不斷深入，選擇性COX-2抑制劑和化療藥物的聯(lián)用有可能成為胃癌治療的一種新方法。