響應(yīng)面法優(yōu)化紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的提取工藝研究

張玉楓，張金華，黃　瑤，李開(kāi)秀，楊莉娜，王　丹

（1.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，四川 成都 610500；2.中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

響應(yīng)面法優(yōu)化紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的提取工藝研究

張玉楓1，張金華1，黃瑤1，李開(kāi)秀1，楊莉娜2，王丹1

（1.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，四川 成都 610500；2.中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

為建立紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比為自變量，抑菌圈直徑為響應(yīng)值，建立數(shù)學(xué)模型，求解得到最佳提取條件和理論最大抑菌圈并驗(yàn)證。結(jié)果顯示，紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，提取時(shí)間78min，固液比1∶31g/mL。此時(shí)，紅花酢漿草醇提取物拮抗金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為30.17mm，較優(yōu)化前提高67.61%。響應(yīng)面優(yōu)化法不僅效率高，而且可靠性強(qiáng)，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抑菌圈直徑。同時(shí)，證明紅花酢漿草的醇提取物具有較為廣泛的抑菌譜。

紅花酢漿草；抑菌活性；響應(yīng)面法；抑菌譜；提取工藝

0　引　言

目前，抗生素濫用引起的致病菌株耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥抗菌譜廣、副作用小、耐藥性低，同時(shí)兼具來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[3-4]；因此，篩選抗菌中草藥、探究其作用機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)[5-6]。紅花酢漿草（Oxalis corymbosa）又名三葉草、大酸味草等，原產(chǎn)巴西和南非好望角，在我國(guó)分布廣泛[7]。作為一種傳統(tǒng)中藥，紅花酢漿草常用于治療咽峽炎、扁桃體炎、腮腺炎等疾病[8]。目前，已證實(shí)酢漿草中富含多種生物活性物質(zhì)，如β-谷甾醇、β-生育酚、胡蘿卜苷、酒石酸等[9-10]。其中，黃酮類、總酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗菌及抗氧化等生物活性[11-12]。本課題組在前期研究中，分別以細(xì)菌、真菌作為指示菌，利用杯碟法檢測(cè)黃葛蘭紫荊、馬蓼、千里香等20種植物的抑菌活性，其中紅花酢漿草乙醇提取物的抑菌活性最佳，且抑菌譜廣泛。此外，和正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)曲面法采用多元二次回歸方法，通過(guò)研究因素與因素間的交互作用，對(duì)擬合后的回歸方程進(jìn)行分析，篩選最佳提取條件，同時(shí)能直觀地分析各因素的相互影響，試驗(yàn)周期短，結(jié)果更加直觀、可靠[13-14]。因此，本文利用響應(yīng)面法優(yōu)化紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的提取工藝。

1　材料與儀器

1.1藥品與試劑

紅花酢漿草，采自成都植物園及成都醫(yī)學(xué)院校園；乙醇、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等均為分析純，購(gòu)自成都科龍公司。

1.2菌種與培養(yǎng)基

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏桿菌（Salmonella enteritidis）等細(xì)菌；白色念珠菌（Monilia albican）、八孢裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus）、漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、假絲酵母（Candida albicans）、隱球酵母（Cryptococcus neoformans）、土曲霉（Aspergillus terreus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、放射毛霉（Actinomucor elegans）、綠色木霉（Trichoderma viride）等真菌保存于成都醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心。

指示細(xì)菌培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基；指示真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.3儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（SWITZERLAND公司）；SHB-IIIG真空泵：（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；ZHWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器（海智城分析儀器制造有限公司）；SW-GJ-2FD潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）。

2　方　法

2.1抑菌活性物質(zhì)的制備

采集新鮮紅花酢漿草葉和莖，洗凈，50℃烘箱內(nèi)烘干。經(jīng)打粉機(jī)粉碎為≤100目的粉末，4℃避光保存。采用冷浸法提取紅花酢漿草的抑菌活性物質(zhì)[15]：稱取粉末4 g，裝入250 mL三角瓶，按照1∶50 g/mL加入50%的乙醇200mL，室溫靜置2d。布氏漏斗真空抽濾，收集濾液，將濾液轉(zhuǎn)移到蒸餾燒瓶中蒸餾濃縮。蒸餾溫度為50℃，濃縮到10mL，45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，4℃冰箱避光保存。

2.2抑菌活性檢測(cè)

采用管碟法檢測(cè)提取液的體外抑菌活性。指示菌選用革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌沙門氏桿菌，將OD600在2.2～2.4的菌液稀釋100倍，每個(gè)LB平板加130μL稀釋菌液，涂布均勻。每個(gè)平板放3個(gè)牛津杯，每個(gè)平板設(shè)置3個(gè)平行組，每個(gè)牛津杯中加入提取液200 μL，4℃冰箱放置4 h后，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，最后檢測(cè)抑菌圈直徑。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

以抑菌直徑為考核指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、固液比和提取次數(shù)5個(gè)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，各個(gè)變量的取值范圍見(jiàn)表1。

表1　5個(gè)提取條件的取值范圍

2.4響應(yīng)面法確定最佳提取工藝

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選取提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比這3個(gè)主要的提取條件，提取溫度設(shè)定為50℃，提取次數(shù)設(shè)定為1次。以提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面法的Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)。以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比為變量，通過(guò)Design Expect8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

3　結(jié)　果

3.1抑菌譜測(cè)定

由表3可見(jiàn)，紅花酢漿草乙醇提取物不僅抑制巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌等11種細(xì)菌，還可以抑制白色念珠菌、土曲霉、綠色木霉等10種真菌的生長(zhǎng)，具有較廣的抑菌譜。

表2　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表

3.2單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1提取時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

分別以革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌沙門氏桿菌為指示菌，考察提取時(shí)間對(duì)乙醇提取物抑菌活性的影響。由圖1可知，隨著時(shí)間的增加，乙醇提取物的抑菌圈直徑逐漸增大；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)70min后，抑菌圈直徑開(kāi)始減小。究其原因，可能是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致有效物質(zhì)的分解失活，最終確定最佳提取時(shí)間為70min。

圖1　提取時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響

3.2.2提取溫度對(duì)抑菌效果的影響

由圖2可見(jiàn)，隨著提取溫度的增加，乙醇提取物的抑菌圈直徑逐漸增大。當(dāng)超過(guò)50℃后，繼續(xù)升高溫度，抑菌圈直徑開(kāi)始降低。這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致有效物質(zhì)失活，因此確定最佳提取溫度為50℃。

圖2　提取溫度對(duì)抑菌圈直徑的影響

3.2.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌效果的影響

研究發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，紅花酢漿草乙醇提取物的抑菌圈直徑逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，達(dá)到最大值。而乙醇提取分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，提取物抑菌活性下降。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)水溶性的有效物質(zhì)溶解減少，其他沒(méi)有活性的脂溶性物質(zhì)溶解增加，故確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌圈直徑的影響

3.2.4固液比對(duì)抑菌效果的影響

從圖4中可見(jiàn)，對(duì)于金黃色葡萄球菌而言，固液比從1∶5增加到1∶15后抑菌圈直徑增大，但繼續(xù)增大固液比后，抑菌圈直徑變化不大。T檢驗(yàn)可以看出不同固液比之間沒(méi)有顯著性差異。而以沙門氏桿菌作為指示菌時(shí)，隨著固液比從1∶5增加到1∶35的過(guò)程中，抑菌圈直徑逐漸增大，但繼續(xù)增大固液比后，抑菌圈直徑開(kāi)始降低。T檢驗(yàn)可以看出1∶35下的固液比與1∶5、1∶25和1∶45下的抑菌圈直徑之間的P＜0.05，有顯著性差異，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于是最佳固液比值確定為1∶35。

圖4　固液比對(duì)抑菌圈直徑的影響

3.2.5提取次數(shù)對(duì)抑菌效果的影響

從圖5中可以看出，對(duì)于金黃色葡萄球菌而言，隨著提取次數(shù)從1次變?yōu)?次后，抑菌圈直徑顯著增大，而3次時(shí)抑菌圈直徑略微減小，但差異不顯著。當(dāng)以沙門氏桿菌作為指示菌時(shí)，從圖中可以看出隨著提取次數(shù)的增加抑菌圈直徑逐漸增大。但從減少生產(chǎn)能耗的角度，提取次數(shù)確定為1次。

3.3響應(yīng)面法確定最佳提取工藝

3.3.1Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定影響紅花酢漿草乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的主要因素為提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比。按表2的因素與水平設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平的優(yōu)化試驗(yàn)方案，其中中心點(diǎn)為5個(gè)，總共17組試驗(yàn)。

圖5　提取次數(shù)對(duì)抑菌圈直徑的影響

3.3.2建立數(shù)學(xué)模型

利用Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)表4中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得到提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比與抑菌直徑的二次多元回歸方程：

3.3.3方差分析

對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到的方差分析結(jié)果如表4所示。F檢驗(yàn)（P=0.0009）證明回歸方程在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，相關(guān)系數(shù)r2=0.9520，說(shuō)明響應(yīng)面95.20%的變化可以用該模型來(lái)解釋。只有0.08%的改變不能通過(guò)該模型擬合得到，可能是噪點(diǎn)的干擾?；貧w方程系數(shù)顯著性結(jié)果見(jiàn)表5。X3（P=0.044 8）、X1和X2的交互作用（P=0.020 6）、X1的二次項(xiàng)（P=0.003 6）、X2的二次項(xiàng)（P<0.001)、X3的二次項(xiàng)（P=0.0119）對(duì)抑菌圈的直徑影響顯著。X1、X2、X1和X3的交互作用、X2和X3的交互作用對(duì)抑菌圈直徑?jīng)]有顯著性影響。

表3　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4　響應(yīng)面二次模型方差分析表

表5　回歸方程系數(shù)顯著性結(jié)果

3.3.4響應(yīng)曲面分析

應(yīng)用Design-Expert.8.0.6軟件繪制響應(yīng)曲面圖，可直觀反映各因素對(duì)響應(yīng)值影響的變化趨勢(shì)，圖示表明在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。如圖6所示，在本試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)固液比處于中心水平（C=0）時(shí)，提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響紅花酢漿草抑菌物質(zhì)提取的曲面圖和等高線圖，由等高線的形狀可以看出兩因素的交互作用顯著（橢圓形代表兩因素交互作用顯著）。

如圖7所示，在本試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)處于中心水平（B=0）時(shí)，提取時(shí)間和固液比不同水平上的變化，引起響應(yīng)值的變化不顯著，所以提取時(shí)間和固液比的交互作用不明顯。

如圖8所示，在本試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)提取時(shí)間處于中心水平（A=0）時(shí)，隨著固液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的改變，響應(yīng)值抑菌圈直徑變化不大，所以說(shuō)乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比的交互作用不明顯。

圖6　提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用等高線圖

圖7　提取時(shí)間和固液比交互作用等高線圖

圖8　乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比交互作用等高線圖

3.3.5最大抑菌直徑和最佳提取條件的確定

應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件預(yù)測(cè)的理想結(jié)果為：提取時(shí)間為77.81 min，固液比為1∶31.37，乙醇體積分?jǐn)?shù)為72.52%；此時(shí)，獲得的抑菌圈直徑可達(dá)30.21mm，如圖9所示。為了便于試驗(yàn)，提取時(shí)間定為78 min，固液比采用1∶31 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)定為73%（見(jiàn)表6）。用以上最佳提取條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，抑菌圈直徑為30.25，30.16，30.11mm，平均值為30.17mm，與預(yù)測(cè)值有很好的擬合性，證明了模型的可行性。

表6　模型最佳條件的驗(yàn)證

4　結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法Box-Behnken分析建立了紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝：提取時(shí)間78 min，固液比1∶31 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，此時(shí)獲得的抑制金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大值為30.17mm，較優(yōu)化之前提高了67.61%（優(yōu)化前后的抑菌圈直徑對(duì)比如圖10所示）。由此可見(jiàn)，本文利用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型可靠性強(qiáng)，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抑菌圈的直徑，這為下一步的抑菌活性物質(zhì)的分離、純化，抑菌作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

圖9　響應(yīng)面模擬最大抑菌圈直徑

圖10　優(yōu)化前后的抑菌圈直徑

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（編輯：莫婕）

Extraction process optimization of antibacterial active substance from Oxalis corymbosa by response surface method

ZHANG Yufeng1，ZHANG Jinhua1，HUANG Yao1，LI Kaixiu1，Yang Li’na2，WANG Dan1
（1.Department of Biomedicine，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China）

An optimum process is designed for extracting antibacterial active substance from Oxalis corymbosa.The extraction time，ethanolconcentration and solid-liquid ratioareselectedas independent variables based on single factor experiment and the diameter of the inhibition zone is considered as response value.After that，a mathematical model is established to calculate and verify the optimal extraction conditions and the theoretically maximum inhibition zone.The optimum extraction process is shown as follows：73%ethanol concentration，78min extraction time，1∶31g/mL solid-liquid ratio.Under these conditions，the maximum antibacterial diameter is 30.17 mm，which hasbeenincreasedby67.61%afteroptimization.Theresponsesurfaceoptimizationmethod introduced in this paper is not only efficient but also reliable；with it，the inhibition zone diameter has been accurately predicted.Besides，the alcohol extract of Oxalis corymbosa has been proved to have a wide range of antibacterial spectra.

Oxalis corymbosa；antimicrobial activity；response surface method；antibacterial spectrum；extraction process

A

1674-5124（2016）03-0053-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.03.013

2015-10-18；

2015-11-23

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（16ZA087）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201513705006）；中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（KLCAS-2014-04）

張玉楓（1993-），男，四川宜賓市人，專業(yè)方向?yàn)樯锛夹g(shù)。

王丹（1977-），女，遼寧遼陽(yáng)市人，副教授，博士，主要從事生物制藥相關(guān)方向的研究。