枸杞潤(rùn)膚霜中兩種酚酸類成分的高效液相色譜檢測(cè)及質(zhì)譜確證

劉少靜， 劉 萌， 郭秀英， 韓 祿， 楊黎彬*

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021)

枸杞是茄科植物枸杞的干燥成熟果實(shí)，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、促進(jìn)造血功能等藥理方面的作用[1,2]。近年來(lái)，中藥化妝品已成為化妝品新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。有報(bào)道顯示，枸杞提取液可顯著提高小鼠皮膚中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加皮膚中膠原蛋白含量，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，具有延緩皮膚衰老的作用[3]。另有文獻(xiàn)報(bào)道枸杞中酚酸類化合物具有很好的生物活性，如阿魏酸有抗血栓、清除自由基、抗菌消炎等作用；咖啡酸和綠原酸可抗菌抗病毒、抗腫瘤、抗氧化清除自由基等[4,5]。

目前，對(duì)枸杞中酚酸類物質(zhì)及其它成分的檢測(cè)已有較多報(bào)道[6 - 8]，但枸杞在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用及化妝品中酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)報(bào)道則不多見(jiàn)。本研究建立了同時(shí)測(cè)定自制枸杞潤(rùn)膚霜中綠原酸和咖啡酸2種酚酸類物質(zhì)的高效液相色譜(HPLC)分析及質(zhì)譜(MS)確證方法，該方法能夠?yàn)榛瘖y品中酚酸的監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為枸杞在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟?gòu)V闊的前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Aglient 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)；Agilent 1260/6460液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó),安捷倫科技有限公司)；FA1004B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-160A紫外檢測(cè)儀(日本，島津公司)；L-550臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

綠原酸、咖啡酸對(duì)照品(純度≥98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)；枸杞(黑果枸杞，產(chǎn)地：青海，由西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院馮永輝副教授鑒定)；枸杞潤(rùn)膚霜(實(shí)驗(yàn)室自制)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Aglient HC-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸水溶液(27∶73，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards and the sampleA.standard;B.the sample of wolfberry cream;C.blank matrix.1.chlorgenic acid;2.caffeic acid.

1.3 液相色譜-質(zhì)譜確證條件

液相色譜條件：色譜柱：UItisiLTMXB-C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸水溶液(27∶73，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：ESI電離源；負(fù)離子掃描模式；干燥氣(N2)體積流量為12 L/min；干燥氣溫度為250 ℃；霧化器壓力為70.00 psi；質(zhì)量掃描范圍：m/z80～1 000；碰撞能量：17 eV。綠原酸母離子、子離子(m/z)分別為353.3、191；咖啡酸母離子、子離子(m/z)分別為179、135。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取綠原酸，咖啡酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，制得2個(gè)對(duì)照品濃度分別為500 μg/mL、450 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。用甲醇將2個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液按不同倍數(shù)稀釋，制得系列混合對(duì)照品溶液。其中綠原酸濃度依次為：250、125、50、25、10、5、3.3 μg/mL，咖啡酸濃度依次為：225、112.5、45、22.5、9、4.5、3 μg/mL，4 ℃冷藏備用。

1.5 枸杞潤(rùn)膚霜樣品前處理

精密稱取自制枸杞潤(rùn)膚霜1.0019 g置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲震蕩提取20 min，提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-HAc為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的酸對(duì)目標(biāo)成分分離效果的影響，分別采用甲醇-0.5%HAc、甲醇-0.1%HAc、甲醇-1%HAc對(duì)樣品進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果表明在甲醇-0.5%HAc的條件下主峰與其它雜質(zhì)峰分離度及峰形均良好，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析枸杞及枸杞潤(rùn)膚霜中酚酸類有效成分的目的。為避免樣品中雜質(zhì)的干擾，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定甲醇-0.5%HAc水溶液的最佳比例為27∶73。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)一定濃度的綠原酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明：綠原酸、咖啡酸均在280 nm、327 nm波長(zhǎng)處有吸收，但在327 nm處有最大吸收，故選擇327 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 柱溫的選擇

柱溫對(duì)目標(biāo)化合物的色譜保留及分離選擇性有一定的影響。本研究考察了柱溫25～40 ℃下的分離情況。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜峰之間實(shí)現(xiàn)了良好的分離。

優(yōu)化色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按照“1.2”節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，以各酚酸的進(jìn)樣濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

選取一個(gè)濃度下的混合對(duì)照品溶液，按照“1.2”節(jié)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得綠原酸、咖啡酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.18%、1.36%，表明精密度良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批已知含量的自制枸杞潤(rùn)膚霜5份，各約0.5 g，置于10 mL容量瓶中。分別加入綠原酸、咖啡酸對(duì)照品溶液適量，制成供試品溶液，按照“1.2”節(jié)進(jìn)樣分析。測(cè)得綠原酸、咖啡酸加標(biāo)回收率見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)：綠原酸、咖啡酸平均加標(biāo)回收率分別為98.28%、99.26%；RSD均為1.93%。

表2 綠原酸及咖啡酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 樣品測(cè)定

稱取枸杞潤(rùn)膚霜適量，按照“1.5”節(jié)方法制備樣品溶液，平行處理3份樣品，應(yīng)用本方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算綠原酸和咖啡酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。自制的枸杞潤(rùn)膚霜中綠原酸、咖啡酸含量分別為0.0398 mg/g、0.0323 mg/g。

表3 枸杞潤(rùn)膚霜中兩種酚酸類成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

目前在化妝品領(lǐng)域尚未有枸杞中酚酸類成分含量的測(cè)定方法，對(duì)用于中藥化妝品的枸杞的檢測(cè)存在空白。本研究建立了同時(shí)測(cè)定自制枸杞潤(rùn)膚霜中2種酚酸類物質(zhì)的高效液相色譜分析及質(zhì)譜確證方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、回收率高、精密度良好等特點(diǎn)，為化妝品中酚酸的監(jiān)測(cè)工作和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為枸杞在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。