微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測的研究進展

肖 羽， 史秋佳， 曾文珊, 陳纘光*

(1.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州 510160;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

1 引言

微型化和集成化是現(xiàn)代分析儀器發(fā)展的重要方向之一[1]。微流控芯片具有體積小、樣品和試劑消耗少、分析速度快、樣品處理簡單、分離效能高等特點。它高度集成化，其分析過程包括進樣、反應(yīng)、過濾、分離、檢測，可以在一塊幾平方厘米的芯片上得以實現(xiàn)[2]。目前用于微流控芯片的檢測方法主要有：紫外-可見吸收檢測、誘導(dǎo)熒光檢測、質(zhì)譜、化學(xué)發(fā)光檢測、折射指數(shù)檢測、電化學(xué)檢測等。因為芯片內(nèi)分離微通道的尺寸一般只有幾十μm，檢測光程很短，紫外檢測的靈敏度很低；激光誘導(dǎo)熒光和化學(xué)發(fā)光檢測的靈敏度高，但由于只能檢測具有熒光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，應(yīng)用范圍有很大的限制；質(zhì)譜法靈敏度高，能夠提供結(jié)構(gòu)和質(zhì)量信息，可檢測的分子種類多，但芯片與質(zhì)譜儀的接口問題很難解決；電化學(xué)檢測可檢測的物質(zhì)種類多，且檢測限低，線性范圍寬，選擇性好，易于集成化、微型化，檢測電路結(jié)構(gòu)簡單、成本低，直接將待測物的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號，避免了信號變換過程，減少了信號噪聲。采用微細加工技術(shù)制作微電極或超微電極可提高電化學(xué)檢測的靈敏度，符合微流控分析系統(tǒng)的要求[3]。

圖1 微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematics of microfludic chip

常用的微流控芯片的結(jié)構(gòu)如圖1所示。在微流控芯片上加工有進樣通道和分離通道[4]，在進樣高壓作用下，待測溶液隨電滲流(EOF)從進樣緩沖池經(jīng)進樣通道流入進樣廢液池。待測溶液完全填充進樣通道后，關(guān)閉進樣高壓，施加分離高壓，在分離高壓作用下，進樣通道與分離通道交叉區(qū)域的待測溶液中各待測組分隨分離通道的EOF以不同速度運動，形成不同的組分區(qū)帶。粒子在電解質(zhì)中的遷移速度為電泳和EOF兩種速度的矢量和。正離子的運動方向和EOF一致，最先流出；負離子的運動方向和EOF方向相反，最后流出；中性粒子的電泳速度相當(dāng)于電滲流速度，在兩性粒子之間流出，各種粒子在不同時刻經(jīng)過位于分離通道末端的檢測器，利用信號檢測電路檢測，即可得到待測溶液各組分的分離譜圖[5]。

非接觸電導(dǎo)是直接將檢測電極放置在分離溝道的芯片外表面，避免電極與待測溶液的直接接觸，有效消除高壓分離電場對檢測的干擾及電極污染問題，實現(xiàn)檢測電極與被測溶液之間的耦合，通過測定分析物的電導(dǎo)變化實現(xiàn)檢測[6]。

2 微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測技術(shù)的研究進展

非接觸電導(dǎo)檢測技術(shù)早期主要用于無機離子的檢測，后來又逐漸擴展到有機酸、脂肪醇、有機胺、氨基酸、糖、肽及蛋白質(zhì)，有機磷化合物等的檢測。最初的應(yīng)用可追溯到20世紀60年代，主要應(yīng)用于工業(yè)工程傳感檢測、高頻電導(dǎo)滴定[7]等方面。當(dāng)時所用的非接觸電導(dǎo)檢測器采用4根金屬絲電極呈放射狀垂直固定在聚四氟乙烯毛細管的外壁上，其中兩個電極與高頻信號源連接作為激發(fā)電極，另外兩個電極作為接收電極。2000年Weber等[8]首次將非接觸電導(dǎo)檢測集成在微流控芯片上，采用濺射-光刻工藝在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基片上制作檢測電極，使用一層PMMA薄膜隔離電極與溝道中的溶液，該電極與溶液之間通過絕緣膜耦合，檢測池結(jié)構(gòu)簡單，電極易固定，易微型化、集成化。2001年Guijt等[9]采用四電極非接觸電導(dǎo)檢測器耦合于玻璃芯片，使用碳化硅層作為絕緣層覆蓋電極，該檢測器穩(wěn)定性更好，相應(yīng)更靈敏，線性范圍更寬。2002年P(guān)umera等[10]把兩個鋁膜電極集成于一層厚度為125μm的PMMA薄膜上，這一種微電泳芯片非接觸電導(dǎo)檢測系統(tǒng)的集成相對簡便，成本更低。2004年Guijt等[11]采用PMMA材料為基片，把電導(dǎo)檢測電極加工在玻璃蓋片上，組成一個新的電泳芯片非接觸電導(dǎo)檢測系統(tǒng)。2006年陳纘光等[12]將進樣和分離通道蝕刻在玻璃基片的表面，采用一層薄玻璃覆蓋在電極表面作為電導(dǎo)檢測器的絕緣層，成功將電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器集成到微流控芯片單通道上，可在較低的激發(fā)頻率和較低的激發(fā)電下工作，安全和穩(wěn)定性更好。

3 微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測技術(shù)的應(yīng)用

3.1 無機離子的檢測

無機離子的檢測是根據(jù)樣品區(qū)帶電導(dǎo)和測量背景電解質(zhì)之間差異來進行的，因此選用低電導(dǎo)率、離子強度大的背景電解質(zhì)。陽離子的遷移方向與電滲方向相同，陰離子的遷移方向與電滲方向相反，導(dǎo)致陰離子出峰時間晚或不出峰，需要在緩沖溶液中加入電滲改性劑改變EOF方向。常用的是陽離子表面活性劑，如十二烷基、十四烷基、十六烷基三甲基溴化銨等，或加入不同體系的有機溶劑，如甲醇、乙腈、陽離子表面活性劑等。Wang等[13]對普通陰離子包括氯離子、硫酸鹽、氟化物、乙酸鹽和磷酸鹽陰離子進行檢測，其中氯離子的檢出限為6.4 μmol/L。Kuban[14]及Lee等[15]使用外置電極電泳芯片檢測了飲料和飲用水中的無機陽離子和陰離子。

3.2 有機離子的檢測

有機物大部分以弱電解的離子狀態(tài)存在，所帶電荷與體積之比較低，檢測靈敏度不是很理想。Chen等[16]分離檢測了標樣中的多巴胺、兒茶酚和有機陰離子、有機酸；Kuban等[17]定量分析了飲料中的有機陰離子。Law等[18]采用組氨酸-酒石酸鹽(pH=6.5)緩沖液檢測了飲料中的常規(guī)防腐劑及維生素C。Tanyanyiwa等[19]成功分離三種β-受體阻滯劑和五種胺，檢出限為0.06～5 μmol/L。 Wang等檢測了河水樣品中三種可用于軍事目的的神經(jīng)毒劑(Srrin、Soman、VX)及其降解物[20]；又基于有機磷神經(jīng)毒劑與磷酸水解酶的反應(yīng)，測定了多種有機磷毒劑[21]。Gong手性分離反式環(huán)乙烷-1，2-二胺對映體[22]，檢測人尿樣和血清樣本中的γ-羥丁酸(GHB)濃度，臨床樣品中的檢出限為2 μg/mL[23]。Zhang等[24]使用聚陽離子涂層的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，使EOF反向，在負分離電場下快速分離檢測了尿樣中尿酸及杭壞血酸(AA)。Lu等[25]采用20 mmol/L的檸檬酸-組氨酸(His)為緩沖溶液快速檢測果汁和自來水中的氟乙酸鈉，檢出限為1～2 mg/L，總分析時間少于5 min。Kumar等[26]采用2-(N-嗎啉代)乙磺酸-組氨酸(MES-His)緩沖溶液快速測定土壤與水樣中的肼類化合物，肼、甲基肼和1-1-二甲肼的檢出限分別為6.5、15.3和11.4 ng/mL。

3.3 氨基酸、肽類的檢測

氨基酸是生物大分子的基本組成結(jié)構(gòu)單元，在采用熒光、此外等光學(xué)檢測時，需要將其轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)的衍生物才能檢測，但因為氨基酸、蛋白質(zhì)在強酸性緩沖溶液中帶正電荷，不需要進行衍生就可以用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測器進行檢測，而且分析過程中所需分析物的量極少，這對于不易取得的分析物而言是一種很好的應(yīng)用技術(shù)。氨基酸分子中既有堿性的氨基又有酸性的羧基，為兩性電解質(zhì)，其中羧基和氨基的解離度取決于緩沖溶液的pH值，肽由兩個或兩個以上氨基酸鍵合而成。Aiping等[27]利用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測器檢測人血液中的尿素。童艷麗等[28]采用配體交換技術(shù)，以Cu2+和L型氨基酸絡(luò)合物作為手性選擇劑成功分離蛋氨酸、苯丙氨酸、青霉胺3種手性物質(zhì)，檢出限達到5 μmol/L。肖羽等[29]采用MES-His緩沖溶液成功分離注射液中門冬氨酸、鳥氨酸兩種氨基酸。

3.4 藥物分析

目前的藥物分析中，微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測法主要應(yīng)用于藥物成分分析和手性拆分領(lǐng)域，其中對藥品主成分進行含量測定的報道占大多數(shù)。在藥物的分離檢測中其具有樣品預(yù)處理簡單、分析速度快、操作方便、成本低等優(yōu)勢。近年來，微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測法在天然藥物、合成藥物及藥物制劑的分析檢測上的應(yīng)用越來越廣泛,楊秀娟等[30]采用Tris-H3BO3(pH=8.0)緩沖體系分離檢測日夜百服嚀片中鹽酸偽麻黃堿和氫溴酸右美沙芬，檢出限分別為10、5.0 mg/L。吳小林等[31]采用Tris-H3BO3(pH=7.5)緩沖體系快速分離丹參滴注液中丹參素和原兒茶醛，檢出限分別為5.0、10 mg/L；測定滴鼻液中鹽酸萘甲唑啉，檢出限為5.0 μg/mL[32]。2010年姜清芳等[33]采用Tris-H3BO3(pH=7.5)緩沖體系分離檢測鹽酸普蔡洛爾和酒石酸美托洛爾，檢出限分別為10、20 mg/L。王充等[34]采用HAc-NaAc(pH=4.5)緩沖體系測定注射液中苦參堿，檢出限為1.0 μg/mL。李永沖等[35]采用HAc-NaAc(pH=4.5)緩沖體系測定丁溴東莨菪堿注射液中丁溴東莨菪堿，檢出限為6.0 μg/mL。周勰等[36]采用MES-His緩沖體系測定鹽酸異丙嗪，檢出限為10 mg/L。2011年蔡自由等[37]采用HAc-NaAc(pH=4.5)緩沖體系成功實現(xiàn)了幾種藥物的的快速檢測，其中鹽酸金剛烷胺檢出限為0.6 mg/L，鹽酸嗎啉胍檢出限為2.0 μg/mL[38]，鹽酸利多卡因檢出限為5.0 mg/L[39]，鹽酸奈福泮檢出限為1.2 μg/mL[40]，溴吡斯的明檢出限為0.6 μg/mL[41]。李永沖等采用HAc-NaAc(pH=4.5)緩沖體系快速測定鹽酸雷尼替丁膠囊中鹽酸雷尼替丁含量，檢出限為1.3 μg/mL[42]；鹽酸小檗堿片中鹽酸小檗堿，檢出限為2.0 μg/mL[43]；普魯卡因注射液中鹽酸普魯卡因，檢出限為5.0 μg/mL[44]；鹽酸金剛烷胺片中的鹽酸金剛烷胺，檢出限為0.6 mg/L[45]；鹽酸地芬尼多片中鹽酸地芬尼多，檢出限為2.0 μg/mL[46]；鹽酸倍他司汀片中鹽酸倍他司汀，檢出限為1.0 μg/mL[47]。2012年翟海云等[48]采用5.0 mmol/L HAc快速測定加替沙星注射液中加替沙星的含量，檢出限為1.0 μg /mL。2013年楊輝等[49]采用硼酸緩沖液(pH=9.6)快速測定葡萄糖氯化鈉注射液中Na+和葡萄糖，檢出限分別為8.2、26.7 μmol/L。

4 微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測的影響因素

4.1 緩沖溶液的影響

在不同的測定中，所使用的緩沖溶液的種類、濃度不同，各離子對EOF速度的影響不同。非接觸電導(dǎo)檢測是基于樣品和緩沖溶液的電導(dǎo)差進行檢測，電導(dǎo)差越大，靈敏度越高。緩沖溶液的濃度決定Zeta電位和雙電層厚度的大小[50]，隨著緩沖溶液濃度的增加，信噪比降低，形成離子對的幾率增大，使雙電層變薄，電滲流速度減小，各離子遷移時間變大，分析物的保留時間增大，分離效果變好[51]，同時背景壓力值增大，與檢測離子之間的電導(dǎo)差減小，使檢測靈敏度下降，溶液電導(dǎo)變大，分離電流增加，焦耳熱增加，基線噪音增加。因此，可以通過調(diào)節(jié)緩沖溶液的濃度來調(diào)節(jié)分析物的分離速度。陳蓉等[52]對PMMA微流控芯片中的EOF速度進行考察，研究發(fā)現(xiàn)NH4Ac濃度溶液在10～50 mmol/L范圍內(nèi)，PMMA微流控芯片中的EOF速度與其溶液濃度成反比。不同緩沖溶液種類體系下，EOF與緩沖溶液之間所存在的定量關(guān)系式不同，但EOF值都是隨緩沖溶液濃度增加而減小。李紅旗等[53]研究發(fā)現(xiàn)無論在弱電解質(zhì)溶液中還是在強電解質(zhì)溶液中，EOF的速度與溶液的pH值均呈線性關(guān)系。Schwer等[54]和Lambert等[55]研究發(fā)現(xiàn)，在pH<3或pH>8時，EOF隨著pH值變化平緩，當(dāng)pH值在5～6之間時，EOF速度變化很快，總體來說EOF速度隨著pH值的增加而增大。

4.2 添加劑的影響

在緩沖溶液體系中，所使用的添加劑種類較多，如無機電解質(zhì)、兩性電解質(zhì)、表面活性劑、有機溶劑等等。添加劑一方面可以通過動態(tài)涂布改變管壁的電荷性質(zhì)，雙電層中的粘合度等；另一方面可以改善分析物與緩沖液的結(jié)合度，直接改變?nèi)芤旱恼扯?。其中增粘劑主要是纖維素及其衍生物，非增粘劑包括有機陽離子，兩性離子，中性分子。無機電解質(zhì)可以使雙電層變薄，EOF減小，但高濃度的無機電解質(zhì)容易導(dǎo)致過熱，使分離效率下降；兩性電解質(zhì)可以使通道壁的負電荷增加，從而增大EOF而不產(chǎn)生較大電流；有機溶劑可以增加溶液的粘度，使EOF速度減小，但不能改變EOF方向；表面活性劑可以改變?nèi)軇┑腪eta電位、粘度，通過疏水-離子相互作用的可逆和不可逆吸附到通道內(nèi)壁，影響壁上的電荷數(shù)量及其分布，影響EOF的大小[56]。微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測常用的是陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，當(dāng)CTAB的濃度達到一定量時，可以使EOF反轉(zhuǎn)向陽極移動。

4.3 分離電壓的影響

高電壓下，毛細管電泳微流控芯片焦耳熱不能有效擴散，引起溫度升高，從而使溶液粘度減小，進而使EOF增大。升高分離電壓，出峰時間明顯縮短，有利于加快分析速度，但分離電壓過高，電流增大，焦耳熱亦增大，會導(dǎo)致噪音大幅度增加，分離度變差，不利于分離。

4.4 進樣時間的影響

在電場強度一定的情況下，進樣時間直接影響進樣量，進樣量的多少對于檢測靈敏度直接相關(guān)，隨著進樣時間的增大，信噪比增加，單分離效率和分離度變差，進樣量過大時，各離子不能有效地分開，且會導(dǎo)致區(qū)帶展寬，峰拖尾現(xiàn)象。通過縮短進樣時間可提高各離子的分離度，但也會造成進樣量太小，響應(yīng)信號過低，檢測困難。

4.5 溫度的影響

一般來說在一定的范圍內(nèi)，電導(dǎo)率和溫度存在線性關(guān)系，溫度升高時，對于強電解質(zhì)溶液，離子的水化作用減弱，溶液的粘度降低，從而使離子的運動速度增大，引起電導(dǎo)的增加；對于弱電解質(zhì)，會直接影響電介質(zhì)的電離常數(shù)，使電離常數(shù)增大。溫度升高亦會使離子熱運動加快，導(dǎo)電能力增加，由此可能會造成樣品遷移時間、峰面積的偏差和分離效率的下降。溫度還會影響微分流通道內(nèi)壁的雙電層厚度。因此在檢測時必須消除或盡量減少溫度對電導(dǎo)率的測定的影響，最好要保持溫度恒定。

5 微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測技術(shù)存在的問題和展望

微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測器輸出信號十分微弱，屬于微弱信號檢測范疇，且檢測器輸出信號易受各種噪聲干擾，如芯片材料性質(zhì)、片基材料不均勻或污染造成的芯片噪聲、檢測電路本身的電氣噪聲、分離電場對檢測效果的干擾噪聲等。因此，采用有效地檢測方法從各種噪聲中檢測出真實信號至關(guān)重要。微流控芯片的發(fā)展依賴于微細加工技術(shù)的進步，目前許多方面還沒得到很好的解決，如芯片材料的選取、微通道的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和溝道尺寸的優(yōu)化設(shè)計、功能單元的集成、擴大芯片的通量、芯片的集成化和標準化程度等。目前微流控技術(shù)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用尚處早期階段，大多是針對簡單的化學(xué)藥品或單一中藥制劑進行的研究，隨著該技術(shù)受到越來越多的關(guān)注，其應(yīng)用范圍將得到進一步的擴大。