熒光法研究苯胺藍與人血清白蛋白的相互作用

董文娟， 侯曉莉， 董 川*

(山西大學環(huán)境科學與工程研究中心，山西太原 030006)

人血清白蛋白(HSA)是人體血漿中含量最豐富的蛋白質，占血漿總蛋白的60%，是維持血液膠體滲透壓的主要成分和運輸內(nèi)源性及外源性物質的重要載體[1],能與許多內(nèi)源及外源性化合物結合起到轉運的作用。蛋白質中存在著酪氨酸和色氨酸殘基，它們本身可發(fā)射熒光，這種內(nèi)源熒光的猝滅過程是研究蛋白質和其他物質相互作用的重要方法。例如人們通過研究染料分子與蛋白質相互作用后的熒光特性變化，從而獲得有關蛋白質大分子結構和性能的相關信息。水溶性苯胺藍(AnB)是一種重要的三苯甲烷酸性染料，被廣泛的用于羊毛、蠶絲及羊毛混紡的染色，且它的染色技術在植物、動物和環(huán)境科學等領域都展現(xiàn)出很好的應用潛力[2]。同時它還曾用作酸堿指示劑、生物染色劑用于神經(jīng)組織、細胞、結締組織的染色[3]。已有研究報道了利用水溶性苯胺藍的吸光光度法來測定人血清白蛋白[4 - 6]，還未見用熒光法來研究苯胺藍與蛋白質相互作用的報道。

本文采用熒光光譜法研究AnB與HSA的相互作用機制,研究二者相互作用的結合位點、結合常數(shù)，以及溫度對結合常數(shù)的影響,并從熱力學角度探討它們之間的主要作用力類型。這對于闡明AnB與HSA相互作用機理，以及AnB對活體生物組織染色時的作用機制具有一定的意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CARY Eclipse熒光分光光度計(美國，VARIAN)(自帶恒溫裝置)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；pHS-3C數(shù)顯酸度計(上海雷磁儀器有限公司)。

HSA(Sigma)儲備液：將HSA溶于0.5% NaCl 溶液,配制成1.0×10-4mol·L-1的儲備液，于4 ℃下儲存。AnB(分析純，上海第三試劑廠)，配制成1.0×10-3mol·L-1的儲備液避光保存；pH=7.4 的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液，所用試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中加入一定量1.0×10-4mol·L-1的HSA溶液，用pH=7.4 的B-R緩沖溶液稀釋至刻度，配制成工作溶液，取2 mL于石英杯中，于λex=293 nm，掃描 300～500 nm波長范圍的發(fā)射光譜，然后用微量注射器將AnB溶液注射到石英杯中，攪勻，放置5 min后測量熒光。熒光的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

分別以△λ=15 nm和△λ=60 nm掃描AnB對HSA同步熒光光譜的影響，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

圖1 不同濃度AnB存在下HSA的熒光光譜Fig.1 Emission spectra of HSA in the presence of various concentration of AnB T=290 K,pH=7.4;λex=293 nm.cHSA=1.0×10-5 mol·L-1.a-e:cAnB:0,1.25×10-6,2.0×10-6,3.0×10-6,4.0×10-6 mol·L-1.

為了模擬人體生理環(huán)境，選用中性條件來研究AnB與HSA的相互作用。固定HSA濃度，在激發(fā)波長293 nm下掃描HSA的熒光光譜，其最大發(fā)射峰位于342 nm。測得加入含不同濃度AnB時體系的熒光光譜如圖1。由圖可見，隨著AnB濃度的增加，HSA的熒光逐漸被猝滅，且發(fā)射峰紅移14 nm，這表明AnB和HSA發(fā)生了相互作用。

2.2 熒光猝滅機理

引起HSA熒光猝滅的原因可能有靜態(tài)猝滅或動態(tài)猝滅[7]。對于動態(tài)猝滅， 隨著溫度的升高，熒光物質的猝滅常數(shù)將增大，而靜態(tài)猝滅則相反[8]。因此，為了闡明AnB對HSA的猝滅機制，本文研究了不同溫度下，猝滅常數(shù)的變化。

熒光猝滅符合Stern-Volmer猝滅方程：

F0/F=1+KSV[Q]=1+τ0Kq[Q]

(1)

其中，F(xiàn)0為猝滅劑不存在時熒光體的發(fā)光強度，F(xiàn)為加入猝滅劑后的熒光強度；KSV為猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅劑的濃度，Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，τ0為熒光體的分子平均壽命。

圖2 AnB猝滅HSA 的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer curve of fluorescence quenching of HSA by AnB ()17 ℃，()27 ℃，()37 ℃ (λex=293 nm).

以F0/F對相應的[Q]作圖，根據(jù)猝滅曲線的斜率可求得猝滅常數(shù)。圖2為不同溫度(17、27和37 ℃)下的Stern-Volmer曲線，從圖中可以看出，曲線呈線性，且隨著溫度的升高斜率降低。

因為生物分子的熒光壽命τ0是10-8s[9]，KSV是圖2中直線的斜率，根據(jù)方程：

KSV=Kqτ0

(2)

由此計算得到猝滅常數(shù)Kq及其線性相關系數(shù)r，見表1。猝滅劑與生物大分子的最大猝滅分散碰撞常數(shù)是 2.0×1010L·mol-1·s-1[10]。顯然，AnB對HSA熒光的猝滅過程速率常數(shù)大于擴散控制的速率常數(shù)。由此推斷AnB對HSA熒光的猝滅不是由動態(tài)猝滅引起的，而是靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下苯胺藍與HSA的相互作用參數(shù)

2.3 結合常數(shù)和結合位點數(shù)

圖3 AnB對HSA的靜態(tài)猝滅曲線Fig.3 The curves for quenching of AnB to HSA ()17 ℃ ()27 ℃ ()37 ℃.

利用靜態(tài)猝滅的公式：lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]處理實驗數(shù)據(jù)。分別作不同溫度下的lg(F0-F)/F對lg[Q]的曲線圖，如圖3所示。由直線截距和斜率可求得不同溫度下的結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)n，計算結果見表1。由此可見AnB和HSA的結合常數(shù)較大，結合位點在1附近，表明AnB和HSA形成1∶1復合物。

2.4 AnB與HSA的作用力類型

染料小分子與蛋白質間的作用力屬于分子間的弱相互作用，包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力，不同小分子與蛋白質的作用力不相同[11]。為了進一步研究AnB與HSA的作用力類型，根據(jù)Gibbs-Helmholtz方程計算不同溫度下的熱力學參數(shù)，結果見表2。從表2的數(shù)據(jù)可以看出，△G<0，說明在等溫等壓條件下沒有非膨脹功存在下，AnB與HSA的結合是吉布斯自由能驅動的自發(fā)過程，而△H<0和△S>0，說明AnB與HSA的相互作用也是由焓、熵驅動的自發(fā)過程，這就表明兩者存在靜電作用和疏水作用。

表2 不同溫度下苯胺藍與HSA的熱力學參數(shù)

2.5 AnB與HAS結合的同步熒光光譜

固定激發(fā)波長與發(fā)射波長間的間距，掃描激發(fā)和發(fā)射單色器即得同步熒光光譜。這種光譜已被用于蛋白質構象變化的分析，由△λ=15 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質酪氨酸殘基的熒光，△λ=60 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質色氨酸殘基的熒光[13]。因殘基的最大激發(fā)和發(fā)射波長與所處微環(huán)境的極性有關，由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。固定HSA的濃度，逐漸增加AnB的濃度，分別以△λ=15 nm和△λ=60 nm繪制HSA的同步熒光光譜。圖4a和圖4b分別為HSA中的酪氨酸和色氨酸殘基的熒光譜?？梢钥闯鲈诖藢嶒灄l件下HSA的熒光譜主要來自色氨酸殘基，且隨著AnB濃度的增加，酪氨酸的最大發(fā)射波長藍移，色氨酸的最大發(fā)射波長略有紅移，表明AnB的加入引起了HSA構象的變化。

圖4 苯胺藍對HSA 構象的影響Fig.4 The effect of AnB on the configuration of HSA (a)△λ=15 nm;(b)△λ=60 nm.cHSA=1.0×10-5 mol·L-1;cAnB：(1)0,(2)1.0；(3)5.0；(4)8.0(×10-5 mol·L-1).

3 結論

本文用熒光光譜法研究了水溶性苯胺藍與人血清白蛋白的結合反應。研究表明苯胺藍對HSA的猝滅機理為靜態(tài)猝滅，測得了該反應在不同溫度下的結合常數(shù)及結合位點數(shù)，并探討了它們的相互作用機理，結果表明苯胺藍以靜電作用和疏水作用與HSA相互作用.進一步用同步熒光技術研究了AnB對HSA構象的影響，結果表明，HSA的熒光主要源于色氨酸殘基，AnB對HSA的構象產(chǎn)生了影響。