呋喃妥因分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用

胡 琪， 譚學(xué)才， 楊素平， 黃翠玉， 吳佳雯， 李曉宇， 李鵬飛， 余會成， 李小燕， 雷福厚

(廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室,廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點實驗室，廣西南寧 530008)

呋喃妥因(Nitrofurantoin,NTF)是抗菌類藥物，廣泛應(yīng)用于尿道細菌感染。目前，檢測NTF的主要方法有分光光度法[1,2]，原子吸收法[3]、高效液相色譜法[4 - 6]、極譜法[7]、光纖傳感器[8]和電化學(xué)伏安法[9]等。電化學(xué)檢測與分子印跡技術(shù)[10,11]結(jié)合能很好的解決靈敏度、選擇性的問題。本文利用自制的馬來松香丙烯酸乙二醇酯(EGMRA)為交聯(lián)劑，以甲基丙烯酸為功能單體，NTF為模板分子，制備分子印跡聚合膜，采用差分脈沖伏安(DPV)法測定，實現(xiàn)了對NTF腸溶片樣品中NTF的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI760D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GCE，Φ=3.0 mm)、印跡或非印跡電極為工作電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，鉑柱電極為對電極；DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

NTF(分析純，中國藥品生物制品檢定所)；呋喃西林(分析純，中國藥品生物制品檢定所)；鹽酸氨基脲、呋喃它酮、呋喃唑酮均為分析純，購買于阿拉丁試劑公司；甲基丙烯酸(分析純，Sigma公司)；馬來松香丙烯酸乙二醇酯(EGMRA，自制)，其余試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 印跡及非印跡電極的制備

在25 mL燒杯中加入適量9∶1的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和無水乙醇，稱取0.1 mmol NTF模板分子，然后依次加入0.4 mmol的甲基丙烯酸、0.8 mmol EGMRA和0.0072 g偶氮二異丁腈(每加入一種試劑均超聲溶解5 min)。取2 μL NTF溶液滴涂于預(yù)處理好的裸電極表面，將該電極放入60 ℃真空干燥箱內(nèi)反應(yīng)4 h。將熱引發(fā)聚合后的電極置于DMF-甲醇-乙酸(8∶1∶1，V/V)溶液中洗脫，直至洗脫之后的印跡電極峰電流不變，將印跡電極(MIP)保存于水中待用。非印跡電極(NIP)的制作除不加模板分子外，其余步驟同上。

1.3 檢測方法

采用循環(huán)伏安(CV)法、差分脈沖伏安(DPV)法、交流阻抗(EIS)法對印記電極進行表征。測定溶液為5.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]-0.10 mol/L KCl(pH=4.0)，實驗所用溶液均需通氮氣除氧處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1模板去除溶劑及洗脫時間的選擇分別考察了體積比為3∶7、4∶6、5∶5的DMF-水溶液，體積比為5∶4∶1的DMF-乙酸-水溶液，體積比為1∶9、2∶8的乙酸-甲醇溶液，體積比為8∶1∶1的DMF-乙酸-甲醇溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體積比為8∶1∶1的DMF-乙酸-甲醇溶液可快速有效地去除模板分子。實驗選擇10 mL體積比為8∶1∶1的DMF-乙酸-甲醇溶液為去除模板的洗脫劑。對印跡電極進行磁力攪拌洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨洗脫時間不斷增加，NTF溶出而留下的“空穴”就越多，探針峰電流就越大。當洗脫50 s后，K3[Fe(CN)6]峰電流變化并不顯著，表明聚合膜中的NTF已全部溶出。故選擇50 s為最佳的洗脫時間。

2.1.2支持電解質(zhì)pH的選擇在0.10 mol/L KCl溶液中加入不同體積的0.10 mol/L HCl或0.10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。實驗結(jié)果表明，堿性太強會破壞印跡膜的穩(wěn)定性導(dǎo)致模板分子的識別能力下降。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當溶液的pH值為4.0時，峰形較為理想，而且響應(yīng)電流最大。因此選擇測試底液的pH值為4.0。

2.1.3孵化時間的選擇實驗結(jié)果表明，隨著孵化時間從5 s逐漸增加到60 s時，印跡傳感器對探針分子的氧化峰電流不斷地降低。這表明隨著孵化時間的增加，模板分子與印跡膜中的“空穴”能重新結(jié)合，導(dǎo)致洗脫之后的印跡電極表面的“空穴”被封閉。當孵化時間超過60 s時，峰電流變化趨于平衡，說明NTF分子在印跡膜中的識別能力已經(jīng)飽和，故選用60 s為最佳孵化時間。

2.2 分子印跡膜電化學(xué)表征

2.2.1不同電極的循環(huán)伏安圖和差分脈沖伏安圖圖1是裸GCE(a)、去除模板分子后的印跡電極(b)、加入1.5×10-6mol/L NTF與印跡電極作用后(c)、加入2.0×10-6mol/L NTF與印跡電極作用后(d)、非印跡電極(e)的CV圖及DPV圖。由圖可知，探針分子在裸GCE上有較大的峰電流；去除模板分子后，印跡電極表面形成了印跡“空穴”，使電化學(xué)傳感器上出現(xiàn)了小于裸GCE上的峰電流；然而加入不同濃度的NTF與印跡電極作用后，NTF會進入空穴中，從而阻礙探針分子的電子傳遞速率，高濃度的NTF擴散能快速結(jié)合從而阻礙就更大；而在洗脫之后的非印跡電極的表面不會出現(xiàn)印跡空穴，因而洗脫之后的非印跡電化學(xué)傳感器上基本上沒有峰電流出現(xiàn)。

圖1 不同電極在5.0×10-3 mol/L [Fe(CN)6]-3/-4(含0.1 mol/L KCl,pH=4.0)中循環(huán)伏安圖(A)及差分脈沖伏安圖(B)Fig.1 Cyclic voltammograms (A) and different pulse voltammograms (B) of different modified electrodes in 5.0×10-3 mol/L [Fe(CN)6]-3/-4 solution containing 0.1 mol/L KCl(pH=4.0)the bare GCE(a),after removal of the NTF(b),after interaction with 1.5×10-6 mol/L NTF(c),after interaction with 2.0×10-6 mol/L NTF(d) and nMIPs-electrode(e).

圖2 不同電極的交流阻抗圖Fig.2 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodes the bare GCE(a),after removal of the NTF(b),after interaction with 5.0×10-6 mol/L NTF(c),after interaction with 8.0×10-6 mol/L NTF(d),after interaction with 5.0×10-5 mol/L NTF(e) and nMIPs-electrode(f).

2.2.2不同電極的交流阻抗圖圖2是不同電極的交流阻抗(EIS)圖。從圖中可以看到，裸GCE的EIS半圓直徑非常小，表明對探針分子有很小的電子轉(zhuǎn)移阻抗；印跡電極去除模板分子后，會形成了“空穴”但其非孔穴部分會覆蓋電極表面，從而使電極的阻抗值有所增大；在印跡電極測試時候，加入不同濃度的NTF，NTF模板分子會和印跡膜孔穴發(fā)生識別，從而封閉印跡“空穴”，高濃度的模板分子能快速和印跡膜發(fā)生結(jié)合，因而使電極的阻抗值出現(xiàn)不同的情況；洗脫之后的非印跡電極的阻抗變化表明，洗脫之后的非印跡電極表面不能形成印跡孔穴，從而使電化學(xué)傳感器的阻抗值最大。這與圖1中的CV圖十分吻合。

2.2.3傳感器的響應(yīng)特征實驗結(jié)果表明(圖3)，在8.0×10-8～5.0×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)，[Fe(CN)6]3-/4-氧化峰電流與NTF的濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為:ip(μA)=10.209-0.0186c(10-8mol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.9939，檢出限為6.5×10-8mol/L。該傳感器具有更高的靈敏度，且制作簡便價格低廉。

2.2.4傳感器的選擇性實驗考察了印跡和非印跡傳感器的選擇性。由圖4可知，NTF在印跡電極上的響應(yīng)電流(△i)最大，對NTF分子有較好的識別的能力。而非印跡電極在NTF及其類似物中響應(yīng)電流(△i)均非常小且差別不大,表明非印跡膜電極不具備特異性識別能力。

圖3 不同濃度NTF的差分脈沖伏安圖(內(nèi)插圖為峰電流與NTF濃度的校正曲線)Fig.3 Different pulse voltammograms of different NTF concentration；Inset shows the linear relation between peak current and the concentration of NTF NTF concentrations are 8.0×10-8,5.0×10-7,8.0×10-6,1.0×10-6,2.0×10-6,3.0×104,4.0×10-6 and 5.0×10-6 mol/L(from up to low),respectively.

圖4 印跡膜電極和非印跡膜電極對不同物質(zhì)的選擇性響應(yīng)Fig.4 The selective response of the MIP and NIP electrochemical sensors to NTF(a),furaltadone(b),furazolidone(c),furacilinum(d),semicarbazide hydrochloride(e) with the same concentration of 1.0×10-6 mol/L

2.2.5傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性用同一根電極對1.0×10-8mol/L的NTF溶液平行測定20次，其相對標準偏差為1.9%，說明該傳感器的重現(xiàn)性較好。將使用過的電極用洗脫液重新洗滌，然后將其保存于水中，47 d后進行測試，其響應(yīng)電流下降了3.3%，說明了該傳感器的穩(wěn)定性良好。

2.3 實際樣品分析

取NTF藥片3片(山西汾河制藥，標示含量50 mg/tablet)，稱量之后研細。準確稱取藥粉0.0196 g(約含有NTF 10 mg)，加DMF溶解并定容于25 mL容量瓶中。采用標準加入法進行藥品含量以及回收率測定。其測定結(jié)果見表1，回收率在96.6%～101.6%之間。

表1 回收率測定

3 結(jié)論

本文制備的NTF分子印跡傳感器具有良好的選擇性，快速結(jié)合模板分子能力和穩(wěn)定性，制作方法簡便易行，應(yīng)用于腸溶片中的回收率檢測，獲得了較好的結(jié)果。