高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定飼料中9種霉菌毒素及其代謝物

莊 倩， 曲寶涵， 李 彥， 吳 燕， 穆阿麗， 李 輝

(1.青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東青島 266109；2.青島市飼料獸藥檢測站，山東青島 266071)

霉菌毒素是真菌在谷物或飼料上生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒二次代謝產(chǎn)物，其種類繁多，在收獲、存儲或加工過程中只要條件適宜都有可能產(chǎn)生。霉菌毒素的物理性質非常穩(wěn)定，它可長時間留存在飼料、糧食等作物中，動物攝入含有霉菌毒素的飼料后可使其組織器官受損，甚至誘發(fā)癌變，而受其污染的食物也嚴重影響著人體健康乃至危及生命[1，2]。據(jù)統(tǒng)計，世界上大約有25%的谷物遭受各種霉菌污染，而且隨著全球飼料谷物貿易的增加，動物飼料中不同產(chǎn)地谷物混合的機會增加，進而導致飼料中同時含有多種霉菌毒素的幾率大大提高。因此，研究霉菌毒素的檢測方法日益受到人們的重視。近年來，霉菌毒素檢測有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、高效液相法和液質聯(lián)用法等方法[3 - 6]。傳統(tǒng)的薄層色譜法檢測種類單一而且前處理步驟繁瑣，酶聯(lián)免疫法雖簡便快速但是易受雜質干擾影響定量結果。

高效液相色譜法和液-質聯(lián)用技術是目前常用的霉菌毒素的分析檢測方法，其中液-質聯(lián)用法具有選擇性高、靈敏度好、可同時完成多組分檢測的優(yōu)點。本實驗建立了一種對飼料中9種霉菌毒素及其代謝物同時檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)方法，為霉菌毒素檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1200 Series液相色譜儀，6410 Triple Quad LC/MS串聯(lián)質譜儀(美國，Agilent公司)；Agilent C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm)；Techcomp CT15RT型臺式高速冷凍離心機；IKAMS 3 Basic微型振蕩器；HY-6雙層調速振蕩器；KQ-250B超聲波清洗器；Organomation Associates 5085型氮吹儀。

甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，美國Sigma-Alorich公司)；乙酸銨(色譜純，英國Alfa Aesar公司)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；NaCl(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。實驗用水為去離子水。

標準品(純度>98%)：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2均購自Supelco公司。T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮均購自Pribolab公司，β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇購自Sigma公司。標準品儲備液：黃曲霉毒素B1、B2為液體標準品，濃度為3 μg/mL。黃曲霉毒素G1、G2、T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇為固體標準品，將其分別用乙腈溶解定容，濃度為10 mg/L,于-20 ℃保存。標準品中間液：分別移取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇適量，用甲醇稀釋，配成1 μg/mL的標準品中間液，備用。

1.2 樣品前處理

稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g NaCl和25 mL乙腈-水(85∶15)，振蕩20 min后渦旋混勻30 s，在10 000 r/min下離心5 min。移取5 mL上清液以穩(wěn)定流速過TC-M160多功能凈化柱(時間不少于60 s)，抽干，流出液收集于刻度試管中，于60 ℃下氮氣吹干。殘渣加1 mL乙腈-水(1∶1)，渦混30 s溶解，過0.22 μm濾膜后，上機待測。

1.3 色譜及質譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilen C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm);流動相：A：水(0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨)，B：甲醇(0.1%甲酸)；梯度洗脫程序為:0～0.5 min，10%B；0.5～3.0 min，10%～40%B；3.0～6.0 min，40%～45%B；6.0～12.0 min，45%～95%B；12.0～14.0 min，95%B；14.0～14.1 min，95%～10%B；14.1～20.0 min，10%B。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。

質譜條件：離子源：ESI；掃描方式：采用正負離子同時掃描，黃曲霉毒素類、T-2毒素和HT-2毒素為正離子監(jiān)測模式，玉米赤霉烯酮及其代謝物為負離子監(jiān)測模式；霧化氣：氮氣；離子噴霧電壓：3 500 V(+)/3 500 V(-)；霧化氣溫度及流量：350 ℃、9 L/min；噴霧器壓力：35 psi；鞘流氣溫度及流量：350 ℃、11 L/min。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑及溶劑比例的選擇

圖1 三種提取溶劑對待測物的提取率(添加20 μg/kg)Fig.1 Extraction efficiency of the analytes in three extraction solvents(add 20 μg/kg)

現(xiàn)行我國國家標準[7，8]均采用高效液相色譜法對單一種類的霉菌毒素進行檢測，前處理用乙腈-水進行提取。有一些研究者曾對不同溶劑提取進行比較[9 - 12]。本實驗分別采用乙腈-水、甲醇-水和丙酮-水作為提取溶劑對樣品進行提取。由圖1可知，乙腈-水的提取率最高，因此采用乙腈-水作為提取溶劑。

分別用體積比95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30的乙腈-水溶液進行提取，結果表明水的比例過大可能導致水溶性雜質增多且氮吹時間過長，而乙腈比例過大則會影響部分目標物的提取效果，當乙腈-水為85∶15時對各組分的提取效果最好。

2.2 凈化柱的選擇

黃曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮及其代謝物、T-2毒素和HT-2毒素的性質結構差異大，但極性較弱，因此本實驗選取了Pribolab的PriboFast?M226多功能凈化柱、Waters的Oasis HLB固相萃取小柱和R-Biopharm的TC-M160多功能凈化柱進行比較。結果表明，HLB柱的凈化效果不是很理想，凈化時吸附在柱上的部分非極性雜質也會被洗脫下來，影響測定結果。多功能凈化柱的凈化原理是采取多重復合填料吸附脂肪、蛋白質、色素及碳水化合物等干擾物質，可同時凈化多種目標組分，經(jīng)實驗得出經(jīng)M226柱凈化后HT-2毒素、β-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇的回收率較低，而TC-M160柱則均能使9種目標化合物得到良好的凈化，因此采用TC-M160柱作為凈化柱進行后續(xù)實驗。

2.3 流動相的選擇

大多數(shù)霉菌毒素易溶于甲醇或乙腈，所以本實驗選擇甲醇和乙腈作為流動相進行比較，為了利于正負離子模式下各組分的離子化，在流動相中加入0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨。結果表明，反相色譜中乙腈極性小更易洗脫固定相上吸附的化合物，但是在正負離子同時掃描的模式下，出峰過快使得保留時間相近的組分不易分開，而且采用乙腈作為流動相時離子化程度比甲醇低，使其離子豐度下降，靈敏度也降低(圖2)，因此本實驗采用甲醇作為流動相。進一步優(yōu)化流動相的比例及梯度洗脫條件后，9種待測組分的色譜分離效果良好，而且分析時間在20 min以內(圖3)，可滿足快速檢測的目的。

圖2 不同流動相下待測物的信噪比(S/N)(添加10 μg/kg)Fig.2 Signal to noise ratio(S/N) by using different mobile phases(add 10 μg/kg)

圖3 霉菌毒素及其代謝物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of mycotoxins and metabolins1.Aflatoxin G2;2.Aflatoxin G1;3.Aflatoxin B2;4.Aflatoxin B1;5,6.HT-2 toxin,β -Zearalanol;7.β -Zearalenol;8.T-2 toxin;9.Zearalenone.

2.4 質譜條件的優(yōu)化

黃曲霉毒素類、T-2毒素及HT-2毒素這幾種目標化合物在正離子掃描過程中形成加氫準分子離子峰進而在碰撞時碎裂生成子離子；而玉米赤霉烯酮類由于結構中的羥基會使其在質譜檢測時容易失去質子，產(chǎn)生[M-H]-的分子離子，因此本實驗采用正負離子同時掃描的多反應檢測模式進行檢測。質譜檢測時，通過碎裂電壓(Fragmentor)來控制碰撞誘導解離(CID)，碎裂電壓過低會影響母離子傳輸效率，過高則使母離子在傳輸時發(fā)生解離降低其靈敏度。另一參數(shù)碰撞能量(CE)則影響碎片離子峰，過低時離子難以分解；過高又會使離子碎裂過多，干擾檢測。因此，本實驗經(jīng)全掃描確定母離子的質荷比，在單離子檢測模式下優(yōu)化碎裂電壓，確保母離子盡可能多的到達碰撞池，再由子離子掃描確定最豐富及最穩(wěn)定的子離子，最終在多離子檢測(MRM)模式下找到最大響應值時的碰撞能量。優(yōu)化的各項質譜參數(shù)見表3。9種霉菌毒素及其代謝物均能得到較好的分離，其結果符合歐盟2002/657/EC號決議《質譜分析方法鑒定點數(shù)》[13]中對待測物定性及定量的要求。

表3 9種霉菌毒素及其代謝物的質譜優(yōu)化條件

2.5 標準曲線、檢出限和定量限

飼料中的基質成分復雜，會對霉菌毒素的分析過程有顯著干擾，并影響分析結果的準確性，因此本研究在繪制標準曲線時配制與檢測樣品相同基質的混合標準系列工作液，其濃度為2、5、10、20、50、100 μg/L。然后以9種霉菌毒素定量離子的峰面積(y)對濃度(x，μg/L)梯度繪制標準曲線，結果表明被測霉菌毒素及其代謝物在2.0～100 μg/L范圍內線性關系良好。按照1.2節(jié)的方法對樣品處理后上機檢測，以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)為定量限(LOQ)的結果見表4。

表4 霉菌毒素及其代謝物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限(n=6)

2.6 方法回收率和精密度

飼料的種類多種多樣，其中的成分也有所不同，因此本實驗分別對飼喂時常用的玉米粉、豬用配合飼料和肉雞肉鴨自配料添加了5、20、50 μg/L 3個濃度水平混標溶液做加標回收率實驗，根據(jù)相應基質外標曲線定量，再就其精密度(RSD)進行考察。通過表5的計算結果可知，其回收率在67.5%～103.5%之間，日內和日間的相對標準偏差(RSD)均不大于15%，表明方法精密度良好。

表5 不同種類飼料的加標回收率及精密度(n=3)

(續(xù)表5)

CompoundAdded(μg/L)Corn mealCompound feed for pigCompound feed for chicken and duckRecovery(%)Intra-dayRSD(%)Inter-dayRSD(%)Recovery(%)Intra-dayRSD(%)Inter-dayRSD(%)Recovery(%)Intra-dayRSD(%)Inter-dayRSD(%)5074.77.73.785.07.611.277.93.94.6Zearalenone575.34.31.784.03.95.375.35.35.020101.65.52.978.72.38.078.15.94.85083.82.80.895.96.87.482.44.45.7β-Zearalenol567.53.25.370.88.010.969.35.511.42075.62.36.272.02.810.380.07.15.35078.09.32.774.87.97.879.17.18.4β-Zearalanol568.811.98.970.28.914.871.66.710.12069.27.55.867.91.410.877.95.613.95075.16.86.375.22.37.781.75.610.7

2.7 穩(wěn)定性和重復性實驗

取空白豬用配合飼料作為基質按1.2節(jié)方法配制10 ng/mL混合標準溶液，在0、5、10、15、20、25、30 h內分別進樣測定，9種霉菌毒素的RSD在3.2%～8.7%之間，說明飼料基質對標準品溶液基本沒有干擾，基質標準溶液的穩(wěn)定性好。

再稱取空白飼料樣品5.0 g，平行取樣6份，精密加入中間濃度的9種霉菌毒素混標溶液適量，按1.2節(jié)方法處理后進樣分析，根據(jù)峰面積計算得出9種霉菌毒素的RSD為3.9%～10.4%，說明該方法的重復性良好。

2.8 樣品檢測

經(jīng)本實驗建立的方法對實驗室存儲的83份飼料樣本進行檢測，每份平行兩次實驗，其中7份樣本測出含有黃曲霉毒素B1 2.6～13.8 μg/L，19份樣本中含有T-2毒素6.9～24.5 μg/L，16份樣本中含有玉米赤霉烯酮5.1～42.7 μg/L。

3 結論

研究結果表明，采用多功能凈化柱凈化可同時凈化多種霉菌毒素，前處理步驟簡便快速，再結合液質聯(lián)用法采用正負離子同時掃描，縮短了分析檢測時間，而且方法穩(wěn)定性好，回收率高。該法還可應用于豆粕、濃縮料、魚粉等多種飼料，其檢出限滿足國內外標準的限量要求，為霉菌毒素的檢測分析提供了技術支持。