基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析

朱秀娟， 李好雨， 郭 林， 趙曉璐

(病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

蛋白質(zhì)磷酸化修飾在生物體內(nèi)普遍存在。真核生物中，磷酸化修飾主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基上[1]。磷酸化修飾參與調(diào)控多種細(xì)胞生命活動，如細(xì)胞增殖、發(fā)育與分化、受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生等。其中，磷酸化修飾對抗病毒天然免疫信號通路的調(diào)控一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。天然免疫反應(yīng)是機(jī)體抵御外界病原微生物入侵的第一道防線。當(dāng)病毒入侵時(shí)，機(jī)體通過自身的模式識別受體(Pattern Recognition Receptors，PRRs)來識別病毒的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated Molecular Patterns，PAMPs)，并通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件誘導(dǎo)干擾素(Interferon ，IFN)表達(dá)，進(jìn)而抵御病毒入侵[2]。在抗病毒天然免疫信號通路活化的過程中，磷酸化修飾起著重要的調(diào)控作用[3]。因此，磷酸化蛋白及位點(diǎn)的鑒定對于更好地了解抗病毒天然免疫信號通路是十分必要的。

蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究特定生理或病理?xiàng)l件下細(xì)胞或組織中所有蛋白的動態(tài)變化。超高靜電場軌道阱傅里葉變換臺式質(zhì)譜(Q Exactive HF )結(jié)合了提供母離子選擇的高性能四極桿和具有超高分辨率、高質(zhì)量精度的超高靜電場軌道阱。在數(shù)據(jù)質(zhì)量無任何損失的情況下，Q Exactive HF 以更快的檢測速度和更高的分辨率，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域有絕佳的表現(xiàn)[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使高通量對磷酸化蛋白進(jìn)行相對定量分析成為可能。其中，穩(wěn)定同位素雙甲基化標(biāo)記技術(shù)因操作簡單而被廣泛采用[5]。細(xì)胞內(nèi)約30%的蛋白質(zhì)能發(fā)生磷酸化修飾，但在特定生理及病理?xiàng)l件下，磷酸化蛋白只占總量的1%～2%[6]。夾雜在高豐度的非磷酸化肽段中，低豐度的磷酸化肽段很難被質(zhì)譜檢測到。因此，在樣品制備過程中要對磷酸化肽段進(jìn)行富集。目前比較常用的磷酸化富集方法有抗體富集、固定相金屬離子螯合層析(IMAC)富集[7]以及TiO2富集(titanium dioxide)[8]。IMAC富集之后，再輔之于色譜分離技術(shù)，如強(qiáng)陽離子交換(SCX)、親水相互作用色譜(HILIC)等，可以鑒定更多的磷酸化肽段[9]。

本研究運(yùn)用穩(wěn)定同位素雙甲基化標(biāo)記技術(shù)、IMAC磷酸化肽段富集技術(shù)，并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜研究了病毒感染引起的宿主細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組的變化。結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件的使用，對受病毒感染調(diào)控的生物學(xué)過程和信號通路進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

nanoHPLC-Q Exactive HF液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Thermo 公司)；Agilent 1200 HPLC分離系統(tǒng)(美國，Agilent公司)。

人胚腎細(xì)胞293T來自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心；日本仙臺病毒(Sendai Virus，SeV)來自武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院舒紅兵實(shí)驗(yàn)室；抗p-IRF3(磷酸化IRF3)抗體購自CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜/質(zhì)譜條件色譜條件：色譜柱為Easy-nano LC1000 C18柱(50 cm×75 μm×2 μm，Thermo 公司)；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度淋洗程序：0～210 min，5%～28%B；210～220 min，28%～80%B；220～240 min，80%B；流速：0.3 μL/min；進(jìn)樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：Easy-spray 離子源；噴霧電壓為2.1 kV；毛細(xì)管溫度為275 ℃；S-Lens RF Level為60；Data-dependent HCD采集母離子和子離子；一級質(zhì)譜(MS)掃描完成后，選取信號強(qiáng)度最高的20個(gè)離子(+2價(jià)到+7價(jià))進(jìn)行MS/MS分析。MS和MS/MS分析的質(zhì)譜參數(shù)參見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

SCX色譜分離條件：PolySULFOETHYL Aspartamide色譜柱(50×2.1 mm，5 μm)；流動相A：5 mmol/L磷酸二氫鉀，20%乙腈的水溶液(pH=2.69)；流動相B：5 mmol/L磷酸二氫鉀，500 mmol/L氯化鉀，20%乙腈的水溶液(pH=2.69)；梯度淋洗程序：0～20 min，0～20%A；20～35 min，20%～60%A；35～40 min，100%A；流速：200 μL/min；進(jìn)樣量：100 μL。

1.2.2病毒感染宿主細(xì)胞病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[10]。

1.2.3蛋白質(zhì)提取、酶解、肽段雙甲基化標(biāo)記以及SCX分離用SeV分別感染宿主細(xì)胞0 h、2 h和4 h，收集細(xì)胞樣品，加入500 μL裂解液(6 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，蛋白酶抑制劑)，對其超聲破碎(功率200 W，間歇3 s，工作5 s，全程時(shí)間為2 min)。4 ℃、11 400 r/min離心20 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)法對蛋白進(jìn)行定量。所用蛋白還原和烷基化、蛋白胰蛋白酶酶解、穩(wěn)定同位素雙甲基化標(biāo)記參考文獻(xiàn)方法[11]。等比例混合雙甲基化標(biāo)記樣品，其中一部分樣品用IMAC富集技術(shù)對磷酸化肽段進(jìn)行富集(參照文獻(xiàn)方法[9]),另一部分樣品用SCX進(jìn)行色譜分離成10個(gè)組分。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒感染宿主細(xì)胞及蛋白組學(xué)分析流程

選擇IRF3為抗病毒天然免疫信號通路激活的判定標(biāo)準(zhǔn)，第396位Ser磷酸化的IRF3能入核誘導(dǎo)IFN表達(dá)。如圖1-A所示,Sev感染宿主細(xì)胞4 h后，蛋白免疫印跡(Western blot)檢測到IRF3第 396位Ser磷酸化，表明抗病毒天然免疫信號通路被激活。

蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)采用SeV分別感染宿主細(xì)胞0 h、2 h(IRF3激活前)和4 h(IRF3激活后)。在每組實(shí)驗(yàn)中，都用Western blot確保Sev成功感染了宿主細(xì)胞，代表性Western blot檢測結(jié)果如圖1-B所示。后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程如圖1-C所示，我們不僅研究了病毒感染引起的宿主細(xì)胞磷酸化組變化，還研究了全蛋白質(zhì)組變化，目的是排除蛋白表達(dá)水平變化對蛋白磷酸化水平變化的影響。

圖1 (A)不同感染時(shí)間條件下Western blot檢測IRF3；(B)Western blot檢測IRF3以驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析細(xì)胞樣品已被病毒激活；(C)基于穩(wěn)定同位素雙甲基化標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程Fig.1 (A)Western blot analysis of IRF3 phosphorylation at different infection times;(B)Phosphorylation level of IRF3 detected by Western blot to validate cell activation by virus in proteomic analysis sample;(C)Workflow of quantitative proteomics based on stable isotope dimethylated labeling

2.2 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)概況分析

對于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)行了兩次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)1中，IMAC磷酸化肽段富集效率為90%(4 922個(gè)磷酸化肽段/5 496個(gè)總肽段)。重復(fù)2中，IMAC磷酸化肽段富集效率為80%(4 725個(gè)磷酸化肽段/5 904個(gè)總肽段)。IMAC磷酸化肽段富集技術(shù)的使用大大提高了磷酸化肽段的鑒定數(shù)目。被雙基化標(biāo)記的磷酸化肽段在MS中就可以進(jìn)行定量，準(zhǔn)確度高于MS/MS的定量。

圖2 (A)不同感染時(shí)間條件下檢測到的顯著變化磷酸化肽段數(shù)量比較分析；(B)磷酸化組和全蛋白質(zhì)組兩組數(shù)據(jù)中顯著上調(diào)蛋白數(shù)量的比較分析；(C)磷酸化組和全蛋白質(zhì)組兩組數(shù)據(jù)中顯著下調(diào)蛋白的數(shù)量比較分析Fig.2 (A)Comparisons of number of significantly-changed phosphopeptides at different infection times；(B)Comparisons of number of significantly-upregulated proteins in phosphoproteme and the whole proteome；(C)Comparisons of number of significantly-downregulated proteins in phosphoproteme and the whole proteome

經(jīng)過對磷酸化肽段的去冗余和可信度鑒定等一系列分析，共定量到4 289個(gè)高度可信的磷酸化肽段。將這些雙甲基化標(biāo)記的磷酸化肽段的比值數(shù)據(jù)進(jìn)行頻率分布，并擬合到正態(tài)分布曲線，這里選取95%置信區(qū)間外作為顯著變化的部分，即中值±1.96倍標(biāo)準(zhǔn)差(mean±1.96×SD)作為上調(diào)和下調(diào)的界限值(即cut-off值)[12]。根據(jù)計(jì)算，2 h/0 h中肽段上下調(diào)變化的cut-off值為1.60和0.55，4 h/0 h中肽段上下調(diào)變化的cut-off值為1.76和0.50。如圖2-A所示，病毒感染宿主細(xì)胞2 h和4 h后，共有373個(gè)磷酸化肽段發(fā)生上調(diào)，493個(gè)磷酸化肽段發(fā)生下調(diào)。

在分析磷酸化肽段的同時(shí)，也將定量到的4 905個(gè)全蛋白(沒有經(jīng)過磷酸化肽段富集)的定量比值數(shù)據(jù)進(jìn)行頻率分布，并擬合到正態(tài)分布曲線，依然選取95%置信區(qū)間外作為顯著變化的部分。根據(jù)計(jì)算，2 h/0 h 中蛋白顯著變化的cut-off值分別為1.27和0.77，4 h/0 h中蛋白顯著變化的cut-off值分別為1.40和0.78。病毒感染宿主細(xì)胞后，共有502個(gè)蛋白發(fā)生上調(diào)，359個(gè)蛋白發(fā)生下調(diào)。

為了進(jìn)一步分析蛋白表達(dá)水平變化對磷酸化水平變化的影響，實(shí)驗(yàn)將磷酸化組數(shù)據(jù)和全蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析。如圖2-B和2-C所示，有1 314個(gè)磷酸化蛋白在全蛋白中也鑒定到，但兩組樣品中共存的上調(diào)蛋白只有18個(gè)，下調(diào)的蛋白只有24個(gè)。因此，可以認(rèn)為病毒感染宿主細(xì)胞后，蛋白磷酸化水平的變化基本不是由蛋白表達(dá)水平的變化引起的。

2.3 受病毒調(diào)控的天然免疫信號通路分析

SeV感染宿主細(xì)胞后，其主要的受體是RIG-I受體，但其核酸同樣可以被NOD樣受體和Toll樣受體所識別。為了進(jìn)一步探討磷酸化修飾對抗病毒天然免疫信號通路的調(diào)控，用KEGG網(wǎng)站對定量的所有磷酸化蛋白進(jìn)行了分類，并把參與早期抗病毒天然免疫信號通路的磷酸化蛋白都挑選出來。圖3-A為RIG-I受體通路，圖3-B為NOD樣受體通路，圖3-C為Toll樣受體通路。

圖3 (A)RIG-I受體信號通路；(B)NOD樣受體信號通路；(C)Toll樣受體信號通路Fig.3 (A)RIG-I receptor pathway;(B)NOD like receptor pathway;(C)Toll-like receptor pathway

病毒感染誘導(dǎo)IFN表達(dá)是宿主細(xì)胞抗病毒免疫機(jī)制的重要組成部分。在上述7個(gè)磷酸化蛋白中，對于誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生有直接影響的是去泛素化酶DUBA。已有研究表明，去泛素化酶DUBA可以抑制RIG-I受體介導(dǎo)的IFN產(chǎn)生[13]。此外，去泛素化酶DUBA的酶活依賴自身第177位Ser的磷酸化修飾[14]。本文研究結(jié)果表明，SeV感染宿主細(xì)胞2 h后，DUBA第64位Ser磷酸化水平下調(diào)，但其表達(dá)水平無顯著變化。因此，推測DUBA可能通過第64位Ser磷酸化參與調(diào)控抗病毒天然免疫信號通路。

2.4 受病毒調(diào)控的生物學(xué)過程和通路分析

我們將顯著變化的磷酸化蛋白提交到PANTHER軟件，進(jìn)行了基于生物學(xué)過程的基因聚類(Gene Ontology，GO)分析。如圖4-A所示，顯著變化的磷酸化蛋白主要與代謝過程、細(xì)胞過程和發(fā)育過程等相關(guān)。使用DAVID軟件進(jìn)行了基于KEGG的通路富集(Pathway Enrichment)分析。如圖4-B所示，當(dāng)上調(diào)磷酸化蛋白與總磷酸化蛋白比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)mTOR 通路發(fā)生了顯著上調(diào)。此外，Toll樣受體通路和NOD樣受體通路等通路也發(fā)生上調(diào)。當(dāng)顯著下調(diào)的磷酸化蛋白和總的磷酸化蛋白比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)Spliceosome通路發(fā)生了顯著下調(diào)。我們進(jìn)一步探討了mTOR和spliceosome 通路在病毒感染中的作用。

通過基于KEGG網(wǎng)站的通路蛋白分析、STRING軟件的蛋白相互作用分析和cytoscape軟件分析，我們得到mTOR通路中定量蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。如圖4-C所示，mTOR 通路中共定量到16個(gè)磷酸化蛋白，之間有87個(gè)相互作用連線。其中，有11個(gè)蛋白的磷酸化水平都發(fā)生顯著變化。已有研究表明，mTOR信號通路通過調(diào)控IRF7的翻譯和磷酸化修飾來參與抗病毒天然免疫信號通路[15，16]。因此，推測mTOR通路可能調(diào)控其他抗病毒蛋白的翻譯。

Spliceosome通路中定量蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖4-D所示，定量到的34個(gè)磷酸化蛋白共有146個(gè)相互作用連線。研究表明，剪接體通路可以間接影響抗病毒天然免疫信號通路，如抗病毒蛋白的異構(gòu)體會抑制此蛋白介導(dǎo)的抗病毒免疫信號通路[17,18]。因此，推測病毒感染引起Spliceosome 通路下調(diào)是為了抑制抗病毒蛋白異構(gòu)體的產(chǎn)生。

圖4 (A)顯著變化磷酸化蛋白基于生物學(xué)過程的GO分析；(B)信號通路富集分析；(C)mTOR通路中蛋白相互作用分析；(D)Spliceosome通路中蛋白相互作用分析Fig.4 (A)GO biological process analysis;(B)pathway enrichment analysis;(C)Protein network of mTOR pathway;(D)Protein network of spliceosome pathway

2.5 磷酸化位點(diǎn)基序分析

在定量到的4 289個(gè)磷酸化肽段中，有3 656個(gè)p-Ser位點(diǎn)，712個(gè)p-Thr位點(diǎn)，27個(gè)p-Tyr位點(diǎn)。蛋白激酶對蛋白的催化需要一定的氨基酸基序，可以通過對磷酸化基序的分析來尋找潛在的蛋白激酶，因此，對于磷酸化位點(diǎn)基序分析具有重要意義。將顯著變化的磷酸化肽段遞交到Motif-X運(yùn)算程序中，對其進(jìn)行磷酸化基序分析。如圖5所示，有7個(gè)針對磷酸化絲氨酸(p-Ser)和2個(gè)針對磷酸化蘇氨酸(p-Thr)的磷酸化基序，因?yàn)門yr磷酸化肽段所占數(shù)目太少，很遺憾沒有找到針對磷酸化酪氨酸(p-Tyr)的磷酸化基序。

為了預(yù)測提取的磷酸化基序?qū)?yīng)的激酶，我們查閱了部分已知其激酶的磷酸化蛋白。圖5-A所示基序可以被激酶MAPK、CDC2、CDK、ERK1等催化，圖5-C和圖5-D所示基序可以被激酶AKT催化,圖5-H所示基序可以被激酶GSK-3、CDK5和ERK1所催化。這些激酶對于磷酸化蛋白進(jìn)一步的功能分析具有重要意義。

圖5 顯著變化磷酸化肽段的磷酸化基序分析Fig.5 Phosphorylation site motif analysis of significantly regulated phosphorylation sitesA-B:p-Ser proline motif.C-F:p-Ser basic amino acid motif.G:p-Ser acidic amino acid motif;H-I:p-Thr proline motif.

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用穩(wěn)定同位素雙甲基化標(biāo)記技術(shù)，并結(jié)合IMAC富集技術(shù)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，研究了Sev感染引起的宿主細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組的變化。借助多種生物信息學(xué)軟件的分析，我們發(fā)現(xiàn)mTOR和spliceosome通路可能參與宿主細(xì)胞對病毒感染的免疫應(yīng)答。此外，病毒感染引起一個(gè)已知具有抗病毒作用的去泛素化酶DUBA第64位Ser磷酸化下調(diào)，我們認(rèn)為其第64位Ser在調(diào)控抗病毒天然免疫信號通路中的作用值得用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)分析軟件的結(jié)合，使我們的研究對于深入解析宿主細(xì)胞對病毒應(yīng)答的分子機(jī)制提供了新線索。