多方法組合分析脲誘導(dǎo)的淀粉液化芽孢桿菌α -淀粉酶去折疊和重折疊過程的構(gòu)象轉(zhuǎn)化

楊文慧， 冀 旭， 邊六交*

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069)

作為從分子水平上闡明生命奧秘的中心課題之一，蛋白質(zhì)分子的去折疊和重折疊過程一直受到生物化學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等領(lǐng)域研究者的高度關(guān)注。目前普遍認(rèn)為完全的去折疊或重折疊過程往往不是一步就能達(dá)到的[1 - 5]，而是存在一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)[6,7]，它們對(duì)研究蛋白質(zhì)分子的功能、自構(gòu)、折疊和集聚等都具有重要意義[8 - 10]。

研究蛋白分子去折疊和重折疊過程時(shí)，常用細(xì)胞色素C、卵清溶菌酶[11,12]等分子量較小、結(jié)構(gòu)比較緊湊的蛋白質(zhì)以及牛碳酸酐酶B[13,14]作為模型蛋白分子。本實(shí)驗(yàn)室曾分別研究和比較了由變性劑誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的豬胃蛋白酶[15]和牛血清白蛋白[16]分子的去折疊過程，并對(duì)這兩種蛋白折疊中間態(tài)的分布和過渡進(jìn)行了研究[17]；也對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的分子量較大但結(jié)構(gòu)又不過于復(fù)雜的淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶分子的去折疊過程進(jìn)行了研究[18]。在該研究基礎(chǔ)上，本文利用變性和非變性電泳、體積排阻色譜、內(nèi)源熒光發(fā)射光譜、熒光相圖、熒光猝滅以及活性測定等組合分析方法研究了變性劑脲誘導(dǎo)的淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶分子的去/重折疊過程，并與一般常用的分子量較小的蛋白分子的去/重折疊過程進(jìn)行比較,為以后研究分子量更大、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子的去/重折疊過程奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4500型熒光光譜儀、U-3310型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)；LC-10A型高壓液相色譜儀(日本，島津公司)；Mini-Protein?Ⅱ垂直板蛋白電泳儀(美國,Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(法國,Viber Lovrmat公司)。

淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase)、脲和鹽酸胍(純度均>99%)，均為Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1去折疊及重折疊稱取適量α-淀粉酶，分別溶于含不同濃度脲的pH=7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，使α-淀粉酶的終濃度為6.0 mg/L。室溫下放置過夜使其不同程度去折疊；稱取適量α-淀粉酶，溶于10.0 mol/L脲溶液中，放置過夜使其完全去折疊。將上述變性酶溶液稀釋成含不同脲濃度的6.0 mg/L的α-淀粉酶溶液，放置過夜使其不同程度重折疊。同時(shí)，稱取適量α-淀粉酶，溶于8.0 mol/L鹽酸胍溶液中使其完全去折疊，將該變性α-淀粉酶溶液稀釋成含不同鹽酸胍濃度的6.0 mg/L的α-淀粉酶樣品溶液，放置過夜使其不同程度重折疊。

1.2.2電泳通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)，對(duì)上述脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶的去折疊和重折疊過程以及鹽酸胍誘導(dǎo)的酶分子重折疊過程進(jìn)行電泳分析。分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.3體積排阻色譜采用高效體積排阻色譜法，對(duì)上述脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程，以及鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程進(jìn)行了體積排阻色譜分析。色譜柱為Shimadzu Shim-pack DIOL-300柱(25 cm×7.9 mm)，流動(dòng)相為含0.2 mol/L Na2SO4的10.0 mmol/L PBS(pH=7.0)，流速1.0 mL/min，280 nm檢測，上樣50 μL。

1.2.4去折疊過程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖扣除對(duì)照體系熒光后，測定上述不同變性程度α-淀粉酶的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜,及在320 nm和365 nm波長下的熒光強(qiáng)度I320和I365，繪制熒光相圖。對(duì)照體系除不含α-淀粉酶外，其余成分和濃度均與上述變性樣品溶液相同。儀器參數(shù)：激發(fā)波長295 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，掃描范圍300～400 nm，掃描速度1 200 nm/min。

1.2.5重折疊過程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖方法及儀器參數(shù)設(shè)置同1.2.4。

同時(shí)用此方法研究了鹽酸胍誘導(dǎo)的變性α-淀粉酶分子重折疊過程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖。

1.2.6去折疊和重折疊過程的熒光猝滅選擇丙烯酰胺和KI作為α-淀粉酶分子的熒光猝滅劑。按照Lehrer[19]和Eftink[20]的方法，以丙烯酰胺為猝滅劑，將其加入到不同程度變性和復(fù)性的α-淀粉酶樣品溶液中。樣品中α-淀粉酶的濃度為1.0×10-6mol/L，丙烯酰胺的濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.4、0.5、1.0 mol/L，室溫放置2 h后進(jìn)行光譜測定?？鄢龑?duì)照體系熒光后，取最大熒光發(fā)射強(qiáng)度，根據(jù)Stern-Volmer公式作圖；而以KI作為猝滅劑時(shí)，用0.1 mol/L PBS(pH=7.0)配制5.0 mol/L的KI溶液(其中含2.0 mmol/L Na2S2O3，以防止I3-的生成)，將其加入不同程度變性和復(fù)性的α-淀粉酶樣品溶液中，樣品中α-淀粉酶的濃度均為 1.0×10-6mol/L，KI的濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08 mol/L，放置2 h后進(jìn)行光譜測定?？鄢龑?duì)照體系熒光后，取最大熒光發(fā)射強(qiáng)度，根據(jù)Stern-Volmer公式作圖。儀器參數(shù)設(shè)置同1.2.4。

1.2.7去折疊和重折疊過程的生物活性測定稱取適量α-淀粉酶，分別溶于含不同濃度脲的0.1 mol/L的PBS(pH=7.0)中，酶的終濃度為0.75 mg/L。室溫下放置過夜使其不同程度去折疊。以1.0%(m/V)淀粉溶液為底物在540 nm下測定樣品溶液吸光值來確定α-淀粉酶的生物活性。以天然酶活性為100%，以不同脲濃度下α-淀粉酶的殘余活性率對(duì)脲濃度作圖。脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的生物活性測定方法基本同上，只是要先將適量α-淀粉酶溶于含10.0 mol/L脲的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中放置過夜使其完全去折疊，然后將它們稀釋到不同脲濃度下稀釋復(fù)性后進(jìn)行活性測定。鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶去折疊和重折疊過程的生物活性測定方法同上，以7.0 mol/L鹽酸胍變性過夜。

2 結(jié)果與討論

2.1 去折疊和重折疊過程的電泳分析

圖1和圖2為變性α-淀粉酶復(fù)性液的SDS-PAGE和Native-PAGE圖譜。SDS-PAGE結(jié)果表明α-淀粉酶的稀釋復(fù)性液僅在分子量約50 kD處有一條帶，這表明在α-淀粉酶的復(fù)性過程中，酶分子始終以單分子形式存在于溶液中，并沒有任何形式的聚集體形成。我們同時(shí)對(duì)α-淀粉酶的稀釋復(fù)性液進(jìn)行了Native-PAGE分析，結(jié)果表明α-淀粉酶的稀釋復(fù)性液中也僅僅存在一條單分子條帶。α-淀粉酶的變性液電泳分析中，也得到了類似的結(jié)果。這表明在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的變性過程和變性α-淀粉酶分子的稀釋復(fù)性過程中，酶分子只以單分子狀態(tài)存在，并沒有通過非共價(jià)鍵作用產(chǎn)生任何形式的聚集或沉淀。同時(shí)，對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的電泳分析也表明，在鹽酸胍誘導(dǎo)的稀釋復(fù)性過程中，酶分子同樣是以單分子形式存在于緩沖溶液中，沒有任何形式的聚集體形成。

圖1 含不同濃度脲的α -淀粉酶復(fù)性液的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE images of denatured Bacillus α -amylase in the renaturation solutions containing different concentrations of urea Lanes 1-2 and 4-8:urea concentrations are 1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 and 8.0 mol/L,respectively;lane 3:protein molecular weight marker(from top to bottom,the molecular weights are 200.0,116.0,97.2,66.4 and 44.3 kD,respectively).

圖2 含不同濃度脲的α -淀粉酶復(fù)性液的Native-PAGE圖Fig.2 Native-PAGE images of denatured Bacillus α -amylase in the renaturation solutions containing different concentrations of urea Lanes 1-7:urea concentrations are 0.0,8.0,6.0,4.0,3.0,2.0 and 1.0 mol/L,respectively.

2.2 去折疊和重折疊過程的凝膠排阻色譜分析

圖3僅給出了脲變性的α-淀粉酶分子分別在含8.0、4.0、1.0 mol/L脲的復(fù)性液中稀釋復(fù)性的凝膠排阻色譜分析?？梢钥闯觯煌瑥?fù)性程度的α-淀粉酶分子都僅有一個(gè)主色譜峰，出現(xiàn)在約8.4 min，與天然態(tài)酶分子的出峰時(shí)間一致，且經(jīng)Bradford法分析表明該峰為蛋白峰。在不同脲濃度的α-淀粉酶分子變性液中，樣品的凝膠排阻色譜分析也出現(xiàn)類似結(jié)果。這表明在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程中，沒有任何形式的α-淀粉酶分子間的聚集體出現(xiàn)。在鹽酸胍誘導(dǎo)的變性α-淀粉酶分子的復(fù)性過程中，凝膠排阻色譜分析圖譜也呈現(xiàn)類似結(jié)果。

圖3 變性α -淀粉酶在含不同濃度脲的復(fù)性液中的體積排阻色譜分析Fig.3 Size-exclusion chromatograms of denatured Bacillus α -amylase in the renaturation solutions containing different concentrations of urea a,b and c:urea concentrations are 8.0,4.0 and 1.0 mol/L,respectively;d:native Bacillus α -amylase.

2.3 去折疊過程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖

圖4給出了脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶去折疊過程的內(nèi)源熒光發(fā)射圖譜?？梢钥闯?，在脲濃度從0.0 mol/L逐漸增加到4.0 mol/L的過程中，隨著脲濃度的增加，α-淀粉酶的最大熒光發(fā)射峰位置無明顯變化，但其熒光發(fā)射強(qiáng)度迅速降低(4.0 mol/L脲時(shí)的熒光發(fā)射強(qiáng)度僅是天然態(tài)α-淀粉酶分子熒光發(fā)射強(qiáng)度的60%)；而在脲濃度從4.0 mol/L繼續(xù)增加到8.0 mol/L的過程中，隨著脲濃度的增加，α-淀粉酶分子的最大熒光發(fā)射峰發(fā)生明顯紅移，由334 nm移至約355 nm處，且其熒光發(fā)射強(qiáng)度快速升高(8.0 mol/L脲時(shí)的熒光發(fā)射強(qiáng)度上升到天然態(tài)酶的80%)。圖4結(jié)果表明隨著溶液中脲濃度的逐漸增大，α-淀粉酶分子中色氨酸殘基逐漸由其分子內(nèi)部過渡到分子表面，并最終可能完全暴露于溶液中。由此推測，在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子變性過程中，隨著溶液中脲濃度的逐漸增加，天然態(tài)α-淀粉酶分子逐步失去其三維立體結(jié)構(gòu)；當(dāng)脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)，溶液中存在一個(gè)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的α-淀粉酶分子的部分折疊中間態(tài)。

為了進(jìn)一步證實(shí)上述推斷，我們同時(shí)研究了脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子去折疊過程的熒光相圖。由圖5可以看出，脲誘導(dǎo)的該酶分子去折疊過程的熒光相圖由兩條斜率不同的直線組成，它們相交處的脲濃度約為4.0 mol/L。進(jìn)一步表明脲誘導(dǎo)的該酶分子的去折疊過程是一個(gè)序變過程，在脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)存在一個(gè)部分折疊中間態(tài)，其去折疊過程符合“三態(tài)模型”。

圖4 脲誘導(dǎo)的α -淀粉酶去折疊過程的熒光發(fā)射光譜圖Fig.4 Fluorescence emission spectra of Bacillus α -amylases during the urea-induced unfolding procedure Urea concentration values in mol/L were indicated for the corresponding emission spectral curves.

圖5 脲誘導(dǎo)的α -淀粉酶去折疊過程的熒光相圖Fig.5.Fluorescence phase diagram of Bacillus α -amylase during the urea-induced unfolding procedure Urea concentrations values in mol/L were indicated in the vicinity of the corresponding curves.

2.4 重折疊過程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖

圖6給出了脲變性α-淀粉酶分子重折疊過程的內(nèi)源熒光發(fā)射圖譜?？梢钥闯?，當(dāng)溶液中脲濃度為8.0 mol/L時(shí)，完全變性的該酶分子的最大熒光發(fā)射波長接近于自由色氨酸在水溶液中的最大發(fā)射波長。隨著脲濃度的降低，該酶的最大熒光發(fā)射波長無顯著變化，但熒光強(qiáng)度迅速下降。當(dāng)溶液中脲濃度降至4.0 mol/L時(shí)，α-淀粉酶的熒光強(qiáng)度降至最低；當(dāng)溶液中脲濃度從4.0 mol/L進(jìn)一步降低至0.1 mol/L時(shí)，該酶的最大熒光發(fā)射峰藍(lán)移至334 nm左右，接近于天然態(tài)α-淀粉酶分子的最大熒光發(fā)射峰位，且熒光強(qiáng)度也迅速回升。該結(jié)果表明，隨著溶液中脲濃度的逐漸降低，α-淀粉酶分子由原來松散、色氨酸殘基完全暴露于溶液中的結(jié)構(gòu)逐步進(jìn)行折疊，色氨酸殘基逐漸向分子內(nèi)部過渡，并大部分埋入分子內(nèi)的非極性區(qū)域。當(dāng)溶液中脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)，可能存在一個(gè)過渡態(tài)的、結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)。

圖7給出了脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的熒光相圖。由圖可以看出，脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的熒光相圖中兩條斜率不同的直線相交處脲濃度約為4.0 mol/L。這也進(jìn)一步證實(shí)脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程是一個(gè)序變過程，當(dāng)溶液中脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)存在一個(gè)α-淀粉酶分子的部分折疊中間態(tài)，其重折疊過程符合“三態(tài)模型”。

圖6 脲誘導(dǎo)的變性α -淀粉酶重折疊過程的熒光發(fā)射光譜圖Fig.6 Fluorescence emission spectra of denatured Bacillus α -amylase during the urea-induced refolding procedure Urea concentration values in mol/L were indicated for the corresponding emission spectra curves.

圖7 脲誘導(dǎo)的變性α -淀粉酶重折疊過程的熒光相圖Fig.7 Fluorescence phase diagram of denatured Bacillus α -amylase during the urea-induced refolding procedure Urea concentrations in mol/L were indicated in the vicinity of the corresponding curves.

通過比較脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子去折疊和重折疊過程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖，我們推測：脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程可能是相互可逆的。此外，鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的熒光發(fā)射光譜和熒光相圖顯示：當(dāng)溶液中鹽酸胍濃度從7.0逐漸降低至1.0 mol/L時(shí)，α-淀粉酶分子從完全去折疊態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變成一個(gè)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)；當(dāng)鹽酸胍濃度進(jìn)一步從1.0 mol/L逐漸減少到0.1 mol/L時(shí)，α-淀粉酶分子會(huì)進(jìn)一步從這個(gè)部分折疊中間態(tài)逐漸折疊轉(zhuǎn)變成近天然構(gòu)象。這表明，鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的重折疊過程也符合“三態(tài)模型”，與它們的去折疊過程相同[18]。因此我們進(jìn)一步推測，鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程也可能是相互可逆的。

蛋白質(zhì)分子在變性劑誘導(dǎo)變性后，其天然態(tài)分子所具有的致密空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，原來包埋于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，多肽鏈處于一種松散狀態(tài)。隨著溶液中變性劑濃度的降低，這些松散的多肽鏈在熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)下會(huì)折疊形成一種熔球態(tài)，而熔球態(tài)大量的疏水殘基暴露在溶劑中會(huì)使不同多肽鏈間的疏水作用力增強(qiáng)，這就有可能驅(qū)使中間體之間形成聚集。這里所選擇的α-淀粉酶分子中不含二硫鍵和游離的半胱氨酸殘基，這就保證了它們之間不會(huì)由于二硫鍵錯(cuò)配而形成分子聚集體。無論是鹽酸胍或脲作為變性劑，在α-淀粉酶的去折疊和重折疊過程中都存在一個(gè)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)，即熔球態(tài)。但通過SDS-PAGE，Native-PAGE和高效凝膠排阻層析檢測結(jié)果表明，α-淀粉酶分子并未形成聚集體。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)脲誘導(dǎo)的豬胰腺α-淀粉酶分子稀釋復(fù)性過程的研究結(jié)果[15]，我們發(fā)現(xiàn)這兩種不同來源的α-淀粉酶分子所形成的中間態(tài)均不會(huì)通過疏水作用而產(chǎn)生分子間聚集。

2.5 去折疊過程的熒光猝滅

在蛋白分子的熒光猝滅研究中，對(duì)于單個(gè)熒光基團(tuán)的均一溶液體系，其猝滅過程可用Stern-Volmer公式(1)和(2)進(jìn)行分析[21,22]：

(1)

(2)

其中,F0和F分別表示加入猝滅劑前后蛋白分子的熒光強(qiáng)度，[Q]為溶液中猝滅劑的濃度，K為可被猝滅劑所接近的分子發(fā)色基團(tuán)的Stern-Volmer常數(shù)，KSV為猝滅劑的猝滅常數(shù)，其倒數(shù)1/KSV等于熒光物質(zhì)50%熒光被猝滅時(shí)猝滅劑的濃度，fm為分子中可被猝滅劑接近的發(fā)色基團(tuán)占總熒光發(fā)色基團(tuán)的百分比。

在不同脲濃度下，取猝滅劑丙烯酰胺和KI對(duì)芽孢桿菌α-淀粉酶內(nèi)源熒光猝滅圖譜最大發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度，如公式(1)和(2)所示，分別以F0/F對(duì)[Q]和F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]進(jìn)行Stern-Volmer線性分析，從斜率和截距即可獲得1/KSV和fm。表1總結(jié)了不同脲濃度下的Stern-Volmer線性分析參數(shù)KSV和fm。表1結(jié)果表明：(1)當(dāng)溶液中存在猝滅劑丙烯酰胺或KI時(shí)，相比天然態(tài)酶分子的線性分析參數(shù)，誘導(dǎo)劑脲存在時(shí)且隨脲濃度的增大KSV和fm均增大。這說明，在脲存在時(shí)α-淀粉酶分子中的色氨酸殘基會(huì)逐漸暴露出來，且隨著溶液中脲濃度的增大和α-淀粉酶分子去折疊程度的加深，丙烯酰胺和KI對(duì)α-淀粉酶的猝滅效率提高，猝滅程度增強(qiáng)；(2)當(dāng)溶液中不存在脲時(shí)，酶分子中有14個(gè)色氨酸殘基會(huì)被丙烯酰胺猝滅，其猝滅率約為83%；而當(dāng)溶液中脲濃度為4.0和8.0 mol/L時(shí)，α-淀粉酶分子中被丙烯酰胺猝滅的色氨酸殘基數(shù)均為15個(gè)，其猝滅率分別約為88%、90%。而該酶分子中共有17個(gè)色氨酸殘基。這表明當(dāng)溶液中脲濃度為8.0 mol/L時(shí)，該酶分子中仍有丙烯酰胺分子無法接近的區(qū)域；(3)當(dāng)溶液中存在猝滅劑KI時(shí)，隨著溶液中脲濃度的增大，α-淀粉酶分子中能夠被KI猝滅的色氨酸殘基數(shù)也逐漸增多，猝滅程度逐漸增強(qiáng)。這表明隨著溶液中變性劑脲濃度的增加，α-淀粉酶分子的去折疊程度也在加深。

丙烯酰胺為不帶電荷的非極性猝滅劑，既可能猝滅蛋白分子表面基團(tuán)的熒光，也可能猝滅深埋于蛋白分子內(nèi)部基團(tuán)的熒光[23,24]。而KI為陰離子猝滅劑，因此，它只能猝滅位于蛋白分子表面或接近于分子表面的極性環(huán)境中的熒光基團(tuán)[24,25]。通過比較表1中同一脲濃度下可被丙烯酰胺和KI猝滅的α-淀粉酶分子中的色氨酸殘基數(shù)，我們認(rèn)為KI在研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變和部分折疊中間體方面效果更好。

表1 丙烯酰胺和KI對(duì)不同濃度脲誘導(dǎo)的變性α -淀粉酶分子內(nèi)源熒光猝滅的猝滅參數(shù)KSV和fm Table 1 Fluorescence quenching parameters KSV and fm of Bacillus α -amylase by acrylamide and KI in the denaturation solutions containing different concentrations of urea

2.6 重折疊過程的熒光猝滅

表2總結(jié)了丙烯酰胺和KI對(duì)脲誘導(dǎo)的不同程度重折疊α-淀粉酶分子內(nèi)源熒光猝滅的猝滅參數(shù)KSV和fm。從表2可看出，在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的重折疊過程中，隨著溶液中脲濃度的降低，參數(shù)KSV和fm均逐漸減小，說明隨著溶液中脲濃度的降低，丙烯酰胺和碘化鉀對(duì)酶分子的猝滅效率降低，猝滅程度減弱。該結(jié)果表明在脲誘導(dǎo)的酶分子重折疊過程中，隨著復(fù)性液中脲濃度的逐漸降低，酶分子中的色氨酸殘基逐漸被包埋進(jìn)分子內(nèi)部。

表2 丙烯酰胺和KI對(duì)不同濃度脲誘導(dǎo)的復(fù)性α -淀粉酶分子內(nèi)源熒光猝滅的猝滅參數(shù)KSV和fm

圖8 不同濃度脲和鹽酸胍下α -淀粉酶去折疊過程的殘余活性率Fig.8 Residual activity rates of Bacillus α -amylase under different concentrations of urea and guanidine hydrochloride○:urea solution;△:guanidine hydrochloride solution.

比較表1和表2我們發(fā)現(xiàn)，在α-淀粉酶去折疊和重折疊過程中，無論猝滅劑為丙烯酰胺或KI，當(dāng)脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子變性液和復(fù)性液對(duì)應(yīng)的脲濃度相同時(shí)，猝滅劑對(duì)酶分子的猝滅參數(shù)KSV和fm基本一致。進(jìn)一步證實(shí)了前面有關(guān)脲誘導(dǎo)α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程可能是互為可逆過程的推測。此外，對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的內(nèi)源熒光猝滅也進(jìn)行了研究，并將結(jié)果與它們的去折疊過程[18]相比較，發(fā)現(xiàn)無論猝滅劑為丙烯酰胺或KI，當(dāng)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子變性液和復(fù)性液對(duì)應(yīng)的鹽酸胍濃度相同時(shí)，猝滅劑對(duì)酶分子的猝滅參數(shù)KSV和fm基本一致。這也進(jìn)一步證實(shí)了前面有關(guān)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程是互為可逆過程的推測。

2.7 去折疊和重折疊過程的生物活性

圖8給出了脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子去折疊過程中的殘余活性率(r)。由圖8可知，隨著變性劑濃度的增加，α-淀粉酶分子的殘余活性均逐漸降低，且在鹽酸胍中下降的更快。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過程的復(fù)性率圖線幾乎與其去折疊過程的殘余活性率圖線重合。這也進(jìn)一步證實(shí)了前面有關(guān)脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程分別是一個(gè)可逆過程的推測。

3 結(jié)論

本研究及我們之前的工作表明，在脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過程中，芽孢桿菌α-淀粉酶分子始終以單分子形式存在，且分別在4.0 mol/L脲和1.0 mol/L鹽酸胍溶液中存在一個(gè)部分折疊中間態(tài)，它們的去折疊和重折疊過程均是可逆的三態(tài)過程。