高效液相色譜法測定美白面膜中7種熒光增白劑

余佩佩,程 俊，顧 華，余肖峰，邵超英*

(1.東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620；2.國土資源部上海資源環(huán)境監(jiān)督檢測中心，上海 200072)

熒光增白劑(Fluorescent Whitening Agents，F(xiàn)WAs)被廣泛用于紙制品、紡織品及洗滌劑等產(chǎn)品中以提高產(chǎn)品的白度和光澤度。有報道指出，使用含有熒光增白劑的洗滌液或紙制品，會導致皮膚上熒光增白劑的殘留[1,2]。這些熒光劑與人體中的蛋白質(zhì)結合，會加重肝臟負擔、造成血液系統(tǒng)受損、甚至導致細胞變異，具有潛在的致癌性。因此，我國對紙制品、餐具洗滌劑等產(chǎn)品中熒光增白劑的使用進行了嚴格監(jiān)管，并制定了相關規(guī)范與標準[3,4]。然而，在日用護膚化妝品[5]及面膜[6]等產(chǎn)品的衛(wèi)生規(guī)范中均未明確禁止熒光增白劑的使用，也未出臺相關的標準檢測方法。一些不良商家在美白面膜中惡意添加熒光增白劑，以達到一敷即白的效果，給人類健康帶來潛在威脅。因此，研究面膜等護膚產(chǎn)品中熒光增白劑的檢測方法，對相關機構加強化妝品產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督管理和保障消費者身體健康具有重要意義。

目前，熒光增白劑的檢測方法主要有紫外燈照射觀測法[7]、熒光分光光度法[8]、高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)法[9 - 11]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[12 - 14]等。其中，紫外燈照射觀測法僅限于熒光劑的定性試驗；熒光分光光度法只能定量測定熒光物質(zhì)的總量；而色譜法是分析種類繁多、成分復雜的熒光增白劑的重要手段。與儀器設備昂貴、檢測成本高的液-質(zhì)聯(lián)用法相比，HPLC法的應用更為廣泛。Shu等[9]使用TBA離子對試劑和液相色譜法分析了洗滌劑及表層水中的熒光增白劑；焦艷娜等[10]及吳鐘玲等[11]均建立了測定食品接觸材料中熒光增白劑的反相HPLC-FLD法。而關于化妝品中熒光增白劑的測試方法研究尚未見報道。

根據(jù)市場上熒光增白劑的使用情況，本文選擇了7種具有代表性的熒光增白劑:4,4′-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2′-二磺酸二鈉鹽(FWA 85)、4,4′-雙(2-磺酸鈉苯乙烯基)聯(lián)苯(CBS 351)、4,4′-雙[(4-苯胺基-6-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2′-二磺酸二鈉鹽(FWA 71)、4,4′-雙(苯并噁唑-2-基)二苯乙烯(FWA 393)、4,4′-雙(2-甲氧苯乙烯基)聯(lián)苯(FWA 378)、4,4′-雙(5-甲基-2-苯并噁唑基)二苯乙烯(FWA 368)、2,5-雙(5-叔丁基-2-苯并噁唑基)噻吩(FWA 184))作為研究對象，建立了美白面膜中上述7種熒光增白劑的靈敏、準確的HPLC-FLD分析法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)，配熒光檢測器(FLD)及色譜工作站；MinPlus型渦旋混合器(合肥艾本森科學儀器有限公司)；DS-2510DTH型超聲波清洗機(上海生析超聲儀器有限公司)；TD5A-WS型臺式離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；BSA224S-CW型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

熒光增白劑標準品均購自上海安譜科學儀器有限公司。其中，F(xiàn)WA 85和FWA 71熒光強度100%；CBS 351和FWA 393的純度≥97.0%；FWA 184的純度≥98.0%；FWA 368的純度≥95.0%；FWA 378的純度≥90.0%。甲醇、乙腈(賽默飛世爾科技有限公司)、乙酸銨(德國CNW公司)為色譜純試劑；其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗用超純水由Hi-tech KFLOW型超純水機(上海和泰儀器有限公司)制備。

實驗所用美白面膜購自上海市某超市。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取各熒光增白劑標準品10.0 mg(精確至0.1 mg)，其中FWA 85、FWA 71和CBS 351分別用甲醇溶解并定容至100 mL，F(xiàn)WA 393、FWA 184、FWA 368和FWA 378分別用三氯甲烷溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的各熒光增白劑單標標準儲備液。上述標準儲備液于4 ℃避光冷藏保存。

1.3 樣品前處理

稱取美白紙質(zhì)面膜精華液1.0 g(精確至0.1 mg)于50 mL具塞比色管中，加入15 mL乙腈，渦旋混合1 min后，于溫度30 ℃下超聲提取20 min，冷卻至室溫后用甲醇定容，搖勻。取部分溶液于50 mL聚丙烯離心管中，以5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm有機濾膜，待HPLC-FLD測定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：25 mmol/L乙酸銨溶液，B：甲醇；梯度洗脫程序：0.0 min，60%A+40%B；20.0 min，20%A+80%B；21.0 min，5%A+95%B；40.0 min，5%A+95%B。進樣量：5 μL；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；熒光檢測器：激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長430 nm。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑及其用量選擇由于熒光增白劑具有較強極性，實驗分別考察了N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇作為提取劑對樣品中7種熒光增白劑的超聲萃取效率。圖1的結果表明，乙腈對7種待測物有較高的提取率。進一步比較了不同乙腈用量條件下7種熒光劑的回收率。由圖2可知，隨著乙腈用量的不斷增加，F(xiàn)WA 85的提取率逐漸降低，同時FWA 393、FWA 368呈現(xiàn)較大誤差，因此實驗選擇使用15 mL的乙腈作為提取劑。

2.1.2超聲萃取條件選擇分別考察了不同超聲時間和萃取溫度條件下乙腈對7種熒光增白劑的提取效率。實驗結果表明，開始時熒光增白劑的萃取率隨超聲時間的增加上升，超聲時間為20 min時達到最高值；而后基本保持不變或下降。經(jīng)實驗證明提取溫度對熒光增白劑的提取率影響不大，因此將超聲萃取條件確定為溫度30 ℃條件下提取20 min。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1熒光測試條件選擇分別對待測熒光物進行多激發(fā)和多發(fā)射掃描試驗，掃描范圍200～800 nm，步進值為2 nm，結果見表1。由表1可見，7種熒光增白劑的最大激發(fā)波長為360～367 nm，最大發(fā)射波長為420～436 nm，故選擇λex=365 nm、λem=430 nm。

表1 7種熒光增白劑的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長

2.2.2流動相的選擇反相高效液相色譜常用甲醇-水或乙腈-水作為流動相。本實驗中為改善FWA 85和FWA 71的色譜峰拖尾情況，在流動相中加入25 mmol/L乙酸銨。分別考察了甲醇-乙酸銨和乙腈-乙酸銨兩種流動相條件下7種熒光增白劑的分離情況。乙腈-乙酸銨作流動相時，F(xiàn)WA 85和CBS 351、FWA 393和FWA 378未獲得完全分離，且分析時間較長，故選擇甲醇-25 mmol/L乙酸銨體系作為流動相。進一步對梯度洗脫程序進行了詳細優(yōu)化，7種待測物在38 min內(nèi)獲得滿意分離。7種熒光增白劑的標準色譜圖見圖3。

2.2.3進樣量的選擇通常，熒光物質(zhì)的熒光強度隨其濃度的升高而下降，甚至發(fā)生猝滅。實驗分別考察了進樣量5 μL和10 μL條件下熒光增白劑的熒光強度。發(fā)現(xiàn)當進樣量為10 μL時，CBS 351、FWA378、FWA 184的熒光信號顯著下降。故選擇進樣量為5 μL。

2.3 工作曲線、檢出限與定量限

在已確定的實驗條件下，對不同質(zhì)量濃度的7種熒光增白劑系列混合標準工作液進行測定，繪制標準曲線，見表2。實驗表明，F(xiàn)WA 85和FWA 71以及其他5種熒光增白劑分別在5～35 mg/L和0.025～4 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)均大于0.991。以信噪比(S/N)=3及S/N=10所對應的被測化合物的含量作為方法的檢出限(LOD)及定量限(LOQ)，7種熒光增白劑的儀器檢出限為0.00071～0.18 mg/L，定量限為0.12～12.24 μg/g。方法具有較高的靈敏度。

表2 7種熒光增白劑的線性方程、線性相關系數(shù)、方法的檢出限和定量限

2.4 準確度及精密度

方法的準確度用樣品的標準加入回收率進行評價。取陰性美白面膜樣品進行3個水平的加標回收試驗，每個水平平行測定6次，加入回收率和相對標準偏差(RSD)結果見表3。結果顯示，7種熒光增白劑的加標平均回收率在93.62%～115.87%之間，RSD為0.43%～5.40%。表明方法具有良好的準確度與精密度。

表3 7種熒光增白劑的方法回收率和精密度(n=6)

2.5 實際樣品測定

應用本方法對市售的8種品牌美白面膜進行了測定，上述7種熒光增白劑均未檢出。

3 結論

本文根據(jù)美白面膜樣品的特性，建立了以超聲萃取技術為主的前處理方法，7種目標化合物獲得了較高的提取效率；并通過優(yōu)化色譜條件，建立了同時測定美白面膜中7種熒光增白劑的高效液相色譜-熒光分析法。該方法前處理簡單、結果準確、靈敏度高，能夠滿足7種目標化合物的定性定量分析，可為化妝品中熒光增白劑的分析測定提供科學參考。