超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定植物組織中多種激素

龔明霞，王日升，何龍飛，王 萌， 趙 虎，吳 星，何 志

(1.廣西農(nóng)科院蔬菜研究所，廣西南寧 530007；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004)

植物激素主要包括細胞分裂素、生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸等。它們廣泛分布在植物體內(nèi)，參與植物的生長、發(fā)育及各種生物脅迫和非生物脅迫過程[1,2]。如生長素-赤霉素類在器官生長[3]、生長素和脫落酸在熱誘導(dǎo)的向下生長[4]、生長素、脫落酸、細胞分裂素、赤霉素、水楊酸及茉莉酸在鹽脅迫響應(yīng)[5]等過程中的調(diào)控。因此，對多種植物激素同時進行定量十分必要。

植物激素在植物體內(nèi)的含量極低，通常只有普通植物次生代謝產(chǎn)物的萬分之一甚至更低[6]，因此，需要建立微量植物激素靈敏的測定方法。在對植物激素進行定量分析方面，早期有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜法(GC)[9]、毛細管電泳法(CE)[10]等方法。但這些方法對植物內(nèi)源激素的準(zhǔn)確定性和定量存在某些方面不足。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)靈敏度高，選擇性和特異性好，抗干擾能力強，不需要進行衍生化，可同時檢測植物體內(nèi) 3種以上內(nèi)源激素[11，12]。然而，對植物體內(nèi)幾大類天然存在的、主要作用形式的幾種激素如反式玉米素(Trans-ZT)、吲哚乙酸(IAA)、天然脫落酸(S-ABA)、赤霉素類(GA1、GA3、GA4)和茉莉酸(JA)的同時定量研究還未見報道。本文研究的7種激素的結(jié)構(gòu)見圖1。

近年來，隨著液相色譜柱填充物的不斷發(fā)展，超高效液相色譜(UHPLC)越來越普及，與傳統(tǒng)液相色譜柱相比，在分離效率、分辨率、靈敏度、分析速度和樣品數(shù)量方面均有所改進[13，14]，且有較好的選擇性保留性能，可以將基質(zhì)效應(yīng)降到最小[15]。超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-QqQ-MS/MS)采用選擇性更高的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，能進一步減少或消除基質(zhì)的干擾，即使在復(fù)雜基質(zhì)樣品中也能得到更低的檢測限。本研究擬利用辣椒葉片為基質(zhì)，提取和純化5大類植物內(nèi)源激素中的7種，即ZT、IAA、ABA、GA1、GA3、GA4、JA進行色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化，旨在提出一種能夠?qū)Χ喾N植物激素同時提取和準(zhǔn)確定量的UHPLC-MS/MS方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity色譜系統(tǒng)，Agilent 6460 Triple Quad三重四級桿質(zhì)譜儀(美國)；Eppendorf5430R和5810R型臺式冷凍離心機(德國)；Grant XUB25型超聲波儀(英國)；EYELA旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)儀(日本)；SUPELC 57265型固相萃取裝置(美國)；Martin Christ ALPHA 1-4 LD型冷凍干燥機(德國)。

7種標(biāo)準(zhǔn)品：Trans-玉米素(Trans-TZ)、赤毒素(GA1和GA4)、脫落酸(ABA)、茉莉酸[(±)JA]購于捷克Olchemim Ltd.，赤霉酸(GA3)和吲哚乙酸(IAA)購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。各標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配制成1 mg·mL-1的單標(biāo)儲備液，并置于-40 ℃冰箱中密封保存。采用甲醇逐級稀釋，配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：IAA的濃度梯度為0.4 、5、50、200、500 ng·mL-1，ZT的濃度梯度為0.05、0.5、5、50、200 ng·mL-1，ABA的濃度梯度為15、50、100、200、500 ng·mL-1，GA1、GA3、GA4及JA的濃度梯度均為50、100、200、400、500 ng·mL-1。配制3個加標(biāo)混合液，ZT、IAA的濃度梯度均為2、20、100 ng·mL-1，GA1、GA3、GA4、JA、ABA的濃度梯度均為60、150、300 ng·mL-1。甲醇、乙腈(Merck，德國)，甲酸(TEDIA，美國)均為色譜純。

1.2 樣品處理

1.2.1提取植物組織加液氮研磨后，準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確至0.001 g)于10 mL離心管中，加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的改良型的Bieleski試劑(甲醇∶甲酸∶水=15∶1∶4)，于4 ℃下浸提16 h，期間振蕩多次，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min得上清液，再向殘渣中加入4 mL預(yù)冷的提取液，振蕩提取2 h后離心獲得上清液；重復(fù)提取2次，合并3次上清液；在38 ℃恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至水相，置-20 ℃冰箱中冷凍30 min。

1.2.2純化從-20 ℃冰箱取出解凍，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，棄色素及脂類不溶物；用1 mol/L HCl調(diào)pH值為3.0，過C18-SPE小柱(規(guī)格200 mg/3mL，Agilent)，液體在自然重力下流出。C18-SPE柱使用前采用3 mL 100%甲醇活化和3 mL 0.1 mol/L甲酸水溶液平衡。用3 mL 0.1 mol/L甲酸水溶液淋洗1次，并減壓抽干，接著用3 mL 70%甲醇洗脫，收集洗脫液，38 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至水相后，置冷凍干燥機中進行冷凍干燥，用300 μL甲醇溶解干燥殘渣(低溫下超聲波助溶30～60 s)，然后過0.22 μm有機系濾膜，供UHPLC-QqQ-MS/MS測定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)。以甲醇(A)和含0.1% 甲酸水溶液(B)為流動相。梯度洗脫程序：0～2 min，35%A；2～6 min，35%～45%A；6～9 min，45%～50%A；9～15 min，50%～60%A；15～18 min，60%～100%A；18～20 min，100%～35%A；20～22 min，35%A。流速：0.3 mL/min；上樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為安捷倫6460 QQQ噴射流離子聚焦電噴霧源，采用正、負離子快速切換，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式監(jiān)測；干燥氣體為N2，溫度為300 ℃，流速為10 L/min；霧化氣體為N2，霧化氣壓力為2.8×105Pa；鞘氣氣體為N2，溫度為360 ℃，流速為12 L/min；毛細管電壓為4 000 V(+)或3 500 V(-)，噴嘴電壓為0 V。

1.4 定性與定量分析

對分析樣品溶液進行UHPLC-QqQ-MS/MS測定，以各種激素的保留時間和特征離子對為依據(jù)進行定性，采用外標(biāo)法以定量離子對的峰面積進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

首先，分析目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)和極性，ZT、IAA、GA1、GA3、GA4、ABA、JA這7種植物激素的分子結(jié)構(gòu)中均包含疏水性的基團，所以我們選擇反相C18色譜柱來對它們進行分離。ZT分子中嘌呤環(huán)側(cè)鏈末端帶一個極性羥基，使得整個分子的極性偏強；IAA分子中碳鏈末端帶有一個極性羧基；GAs分子中弱極性的碳環(huán)被極性的羥其、羧基和酯基包圍而使得整個分子具有中等極性；ABA和JA分子中均帶有極性的羥基和羧基?？梢姡?種植物激素的極性存在差異，經(jīng)優(yōu)化選擇了1.3所述的梯度洗脫條件。

7種分析物中大部分是酸性植物激素，為了使它們能夠在反相色譜柱上充分保留，采用0.1% 甲酸水溶液為無機相，分別考察了乙腈、甲醇作為有機相對這7種植物激素的分離效果。結(jié)果表明：以乙腈-0.1% 甲酸水溶液作為流動相，7種激素幾乎在0～3 min內(nèi)出峰，但有些峰重疊，說明不能完全分離；以甲醇-0.1% 甲酸水溶液作為流動相，各激素的出峰時間延遲，但都能在14 min之內(nèi)實現(xiàn)基線分離，沒有重疊峰，無拖尾現(xiàn)象，而且峰形好。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

赤霉素、脫落酸、茉莉酸這三大類化合物分子中均含有羧基，在電離源中易產(chǎn)生[M-H]-離子[15]，因此宜采用負離子模式。對1 μg/mL各激素單標(biāo)溶液進行母離子全掃描，結(jié)果也表明GA1、GA3、GA4、ABA、JA在負離子模式下響應(yīng)值高，而ZT和IAA在正離子模式下響應(yīng)值高；且可以看到對相同質(zhì)量濃度的單標(biāo)溶液，正離子模式下的ZT和IAA的響應(yīng)值遠高于負離子模式下的GA1、GA3、GA4、ABA、JA，充分說明了分子結(jié)構(gòu)不同的7種植物激素的離子化效率也不一樣[16]，F(xiàn)letcher和Mader的研究結(jié)果表明堿性添加物有利于增強分析物在負離子模式下的離子化效率[17]。因此，本研究結(jié)果可進一步推測負離子模式下使用酸性流動相可能會抑制分析物的離子化，正離子模式下使用酸性流動相可能會促進分析物的離子化。

通過對各種激素母離子進行二次碎裂，得到二級質(zhì)譜特征離子譜圖，從中選出各物質(zhì)最強且穩(wěn)定的子離子作為定量子離子。ZT、IAA的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+，GA1、GA3、GA4、ABA、JA的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-。進行正、負離子模式切換多反應(yīng)監(jiān)測時，分別對ZTm/z136.0、IAAm/z130.0、GA1m/z273.1、GA3m/z143.2、GA4m/z257.1、ABAm/z153.1、JAm/z58.9的碎片離子進行監(jiān)測。再優(yōu)化其他質(zhì)譜條件，使準(zhǔn)分子離子→子離子的響應(yīng)強度達到最大。表1為優(yōu)化的源內(nèi)碎裂電壓和碰撞能量。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 C18-SPE柱的萃取效果

盡管植物粗提液中的激素也能被定量檢測，但對其進行純化處理后再檢測可大大提高LC-MS/MS系統(tǒng)中色譜柱的壽命[18]，同時也極大地減少了植物基質(zhì)中雜質(zhì)對分析物離子化的影響[19]。C18柱是使用最為廣泛的一種樣品處理小柱。采用5份相同的含中等濃度7種植物激素的混合標(biāo)樣300 μL，加入與處理0.5 g植物組織相同量的提取液，直接進行旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至水相，用1 mol/L HCl調(diào)pH值為3.0，過C18-SPE小柱(規(guī)格200 mg/3mL，Agilent)，之后的步驟如同前面提到的。如表2所示：7種植物激素的混合標(biāo)樣經(jīng)C18-SPE柱萃取后的回收率為92.2%～99.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為1.1%～2.1%，這說明C18-SPE柱能夠有效吸附這7種激素，5 mL 70%甲醇能夠完全洗脫這7種激素。另外，辣椒葉片樣品粗提液，經(jīng)C18-SPE小柱萃取時，可以見到大部分的有色雜質(zhì)不能保留在柱內(nèi)，直接隨廢液流出，而最終制備得到的檢測液接近無色，這說明C18-SPE柱對糖類、酚類、色素等強極性雜質(zhì)不吸附或弱吸附，使得它們在通過C18-SPE柱時直接流出或在淋洗過程被洗脫，從而能夠有效去除樣本基質(zhì)中大部分的干擾雜質(zhì)。

表2 7種植物激素經(jīng)C18-SPE柱萃取后的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.4 線性關(guān)系、檢出限以及定量限

將系列混合標(biāo)樣溶液過0.22 μm濾膜后進行UHPLC-QqQ-MS/MS分析，每個樣進5針。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，并計算方法的檢出限(LOD)(信噪比S/N=3) 和定量限(LOQ)(信噪比S/N=10)。從表3可以看出，7種植物激素在所采用的濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)范圍為0.9870～0.9990，且該方法檢測的靈敏度高，檢出限在0.01～8.77 ng·mL-1之間，定量限在0.02～29.23 ng·mL-1之間。

表3 7種植物激素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 方法的回收率和精密度

以新鮮辣椒葉片為植物材料。準(zhǔn)確稱取同一辣椒葉片樣品20份，每份0.5 g，其中15份加入低、中、高3個濃度水平的混合標(biāo)樣300 μL，每個水平設(shè)5次平行實驗，另外5份為未加標(biāo)的樣品。所有樣品按照前述的樣品前處理方法進行提取、純化和UHPLC-MS/MS檢測。結(jié)果見表4。采用改良型的Bieleski試劑作為提取液，在3種不同添加水平下，辣椒葉片基質(zhì)中的7種植物激素的回收率在65.8%～90.9%之間，大部分的回收率都較高，如GAs、ABA及JA的回收率均在82%以上，只有ZT的回收率相對偏低，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～5.5%。加標(biāo)的辣椒葉片樣品的MRM提取色譜圖見圖2。

表4 7種植物激素在辣椒葉片組織中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

植物激素回收率的高低與提取液成分有很大的關(guān)系，改良型的Bieleski試劑已被廣泛應(yīng)用于細胞分裂素、脫落酸、赤霉素、生長素等多種植物激素的提取[20]。本研究采用改良型的Bieleski試劑作提取液，冷凍離心結(jié)合C18-SPE柱萃取去雜純化步驟，對大部分植物激素種類而言能獲得較高的回收率，只有ZT的回收率偏低，與前人的研究結(jié)果大體一致，但在回收率上又有很大的提高。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜同時測定五大類植物激素中的7種即ZT、IAA、ABA、GA1、GA3、GA4、JA的分析方法。在優(yōu)化的實驗條件下，7種激素用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱分離后，在QqQ-MS/MSMRM模式下進行定性和定量分析。該方法分析一個樣品只需要14 min，檢測激素種類范圍廣泛，且靈敏度高。植物樣本前處理采用改良型的Bieleski試劑提取，結(jié)合C18-SPE小柱對植物樣品進行富集和純化，降低了基質(zhì)干擾，研究中所分析的大部分植物激素的回收率都較高，適用于對植物組織中多種激素的同時測定。