多壁碳納米管/十六烷基三甲基溴化銨修飾絲印電極的制備及大鼠血中雌二醇水平的測定

馬 維，黃泓軻，王玉婷，閔 清，祝曉慶，王 詩*

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100；2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，四川樂山 614000；3.武漢市普愛醫(yī)院，湖北武漢 430072)

雌二醇(E2)是育齡婦女體內(nèi)卵巢或黃體分泌的受體水平活性最高的雌激素，其濃度的過高或過低都會導(dǎo)致生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，因此準(zhǔn)確地測定E2濃度對于相關(guān)疾病的診斷和治療具有極其重要的意義[1,2]。目前用于E2測定的方法以免疫分析法[3]和高效液相色譜[4]最為常用，但免疫法由于靈敏度、選擇性以及試劑污染、假陽性等因素制約了其應(yīng)用；而色譜法則對技術(shù)要求高，預(yù)處理繁瑣。近年來研究者利用傳感器對E2進行測定，如蛋白A與聯(lián)硫基二(琥珀酰亞胺丙酸鹽)修飾電化學(xué)免疫傳感器[5]、蛋白A-納米金-絲網(wǎng)印刷免疫傳感器[5]、納米金/巰基蛋白G修飾金電極免疫傳感器[7]，以及在絲印碳電極上固定抗體(兔抗小鼠IgG和單克隆小鼠抗-E2)[8]檢測E2。然而免疫傳感器制備工藝比較復(fù)雜，影響穩(wěn)定性和一致性的因素較多，會影響檢測導(dǎo)致測量結(jié)果不準(zhǔn)確，臨床使用面臨重現(xiàn)性差的問題。

本研究采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備絲印傳感器，修飾多壁碳納米管(MWCNTs)-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，用于大鼠血樣中E2的直接測定。該電極能夠滿足生物樣本中E2的測定，減少了前處理過程，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量、連續(xù)、便捷的診斷目的，在臨床診斷方面具有應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑及受試動物

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；實驗室用多功能絲網(wǎng)印刷設(shè)備(珠海凱為電子元器件有限公司)；pHS-3E酸度計(上海雷磁)；KQ-100E超聲波清洗器(昆山舒美)；SPM-9500J3掃描探針顯微鏡(Japan,Shimadzu);Quanta200 掃描電鏡(Holland,FEI);JFC1600精鍍儀(Japan,JEOL)。

雌二醇(E2，阿拉丁)；多壁碳納米管(MWCNTs,中國科學(xué)院成都有機化學(xué)研究所)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,Amresco)；血清雌二醇(E2)-放免試劑(RIA)(南京建成)；絲印碳油墨(Acheson)；銀油墨(Acheson)；Ag/AgCl油墨(徐州英劍納米科技有限公司)；絕緣油墨(JUJO)；PVC片材(上海新立醫(yī)療器械有限公司)，其他試劑均為分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。

SPF級雌性KM小鼠，體重17～20 g；雌性SD大鼠，體重180～240 g，購自湖北省疾控中心。

1.2 MWCNTs-CTAB/SPE的制備

利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)于PVC基材表面逐層套印導(dǎo)電銀軌、工作電極、輔助電極、Ag/AgCl參比電極后，置溫度70 ℃烘箱中烘干，最后印刷絕緣層，紫外烘干，得到絲印電極(SPE)[9]。

CTAB溶于蒸餾水中配制成CTAB溶液，再加入MWCNTs，多次超聲分散后使MWCNTs/CTAB修飾液分散均勻。移液器吸取MWCNTs-CTAB修飾液滴涂于工作電極表面，于室溫自然干燥得到MWCNTs-CTAB/SPE，儲存于干燥器中，備用。

1.3 MWCNTs-CTAB/SPE在生物樣本中的應(yīng)用

1.3.1MWCNTs-CTAB/SPE特異性實驗SD大鼠隨機分為空白組(生理鹽水)，E2低劑量(0.18 mg/kg)、中劑量(0.9 mg/kg)及高劑量(4.5 mg/kg)組，每組6只，腹腔給藥后，分別于6、12、18、21、22 、23、26、32及48 h采用眼底靜脈采血，EP管采用EDTA-Na2抗凝處理。將100 μL血樣加入到100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖液(pH=12)中，采用MWCNTs-CTAB/SPE測定血樣中E2含量。48 h后處死大鼠，取出卵巢和子宮，稱重臟器與體重并記錄臟器指數(shù)。

1.3.2不同方法測定血樣中E2KM小鼠摘眼球取血，SD大鼠眼底靜脈采血，EP管采用EDTA-Na2抗凝處理。100 μL血樣加入到100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖液(pH=12)中，采用MWCNTs-CTAB/SPE測定血樣中E2含量。血樣中分別加入1.0×10-10、3.0×10-10和5.0×10-10mol/L的E2，計算加標(biāo)回收率。將E2標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品、標(biāo)記物和抗體按放免試劑盒規(guī)定依次加入試管中，混勻，37 ℃水浴1 h，待反應(yīng)平衡后，加入分離劑，充分混勻，室溫10 min，將各管插入γ放射免疫計數(shù)器上放置10 min，棄掉上清液，測各管沉淀的放射性計數(shù)(CPM)。

1.4 E2的電化學(xué)測定方法

采用電化學(xué)工作站，以MWCNTs-CTAB/SPE測定E2，電解液為含不同濃度E2的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖液(pH=12)。在-1.0～1.0 V(vs.Ag/AgCl)范圍進行循環(huán)伏安法(CV)掃描，在-0.8～0.8 V(vs.Ag/AgCl)范圍進行方波伏安法(SWV)掃描，測定不同濃度的E2，確定峰電流與其濃度的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE表征

通過掃描電鏡(SEM)分別對未修飾電極和修飾電極(MWCNTs-CTAB/SPE)進行表征。未經(jīng)過修飾的工作電極表面的碳墨顆粒相互間關(guān)聯(lián)較少，整體結(jié)構(gòu)疏松，凹凸不平(圖2A)；經(jīng)過修飾后，工作電極表面布滿MWCNTs，由于工作電極表面電化學(xué)特性得到改變，反應(yīng)比表面積也增大，進而有利于電子在工作電極表面?zhèn)鬟f，有利于E2在電極表面富集(圖2B)。MWCNTs-CTAB/SPE在原子力掃描電鏡(AFM)下進行觀察。由圖2C可以看出，未修飾的工作電極表面起伏大，分布不均勻；經(jīng)過修飾的工作電極表面變得平滑，MWCNTs-CTAB在其表面分散良好。

2.2 E2在MWCNTs-CTAB/SPE上的電化學(xué)特性

采用循環(huán)伏安法(CV)考察E2在裸SPE(bare SPE)、MWCNTs修飾SPE(MWCNTs/SPE)、CTAB修飾SPE(CTAB/SPE)和MWCNTs-CTAB修飾SPE(MWCNTs-CTAB/SPE)表面的電化學(xué)響應(yīng)。如圖3所示，未修飾的電極對E2電化學(xué)響應(yīng)較小，在0.166 V附近出現(xiàn)氧化峰，未出現(xiàn)還原峰；相同條件下，MWCNTs修飾的電極，由于MWCNTs由于自身良好的導(dǎo)電性能，大的比表面積，顯著提高了E2的峰電流，加速其電子轉(zhuǎn)移，氧化峰電位移動至0.111 V，在-0.562 V出現(xiàn)還原峰；CTAB修飾的電極，由于CTAB與E2的疏水相互作用，雖然氧化峰電位移動至0.235 V，但E2在電極表面的氧化峰電流也明顯增大；在CTAB的作用下MWCNTs分散均勻，并對MWCNTs起固定作用[10]。MWCNTs起到加快異相界面電子傳遞速率的作用[11]，對E2的催化活性也逐漸增加，導(dǎo)致MWCNTs-CTAB修飾電極上E2的氧化峰電流得到了顯著的提高。

2.3 實驗條件的影響

2.3.1緩沖溶液的影響采用循環(huán)伏安法考察E2分別在NaH2PO4-檸檬酸、Na2CO3-NaHCO3、Na2HPO4-NaH2PO4、HAc-NaAc、NaOH-硼砂等不同種類緩沖液中在MWCNTs-CTAB/SPE表面的電化學(xué)響應(yīng)。在0.1 mol/L 的Na2CO3-硼砂緩沖液中氧化峰峰形較好、峰電流較大。考察不同pH值0.1 mol/L Na2CO3-硼砂緩沖液中E2的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，在堿性條件下，E2氧化峰峰形較好，且無雜峰干擾，當(dāng)緩沖液pH值為7～12時，E2的峰電流隨著緩沖液pH值的增大而增大，電位隨pH升高而向負電位方向移動。當(dāng)緩沖液pH值為12時，峰電流最大，靈敏度最高。故選擇pH值為12的0.1 mol/L Na2CO3-硼砂緩沖液為測定介質(zhì)。

2.3.2掃描速率對E2電化學(xué)響應(yīng)的影響在不同掃描速率下用循環(huán)伏安法測定E2在MWCNTs-CTAB/SPE表面的電化學(xué)響應(yīng)。由圖4可以看出，隨著掃描速度的增加，峰電流增加。在20～300 mV/s 范圍內(nèi)，峰電流與掃描速率成正比；隨掃描速率的增加，峰電位正移，氧化峰電流ip與掃描速度平方根v1/2存在良好的線性關(guān)系，說明E2在電極上的氧化過程受擴散控制。

2.3.3修飾劑用量的影響實驗表明隨MWCNTs-CTAB的濃度逐漸增加，E2的峰電流逐漸增加，但濃度超過0.5 mg/mL時，峰電流反而變小，故本實驗選擇MWCNTs-CTAB的濃度為0.5 mg/mL。同時，0.5 mg/mL MWCNTs-CTAB修飾劑用量從1.0 μL增加到3.0 μL時，E2的峰電流隨著修飾量增加而顯著增大，這是基于電極表面催化活性位點增多。當(dāng)修飾劑量再增加至5.0 μL時，峰電流反而降低。此時，電極表面的膜達到一定的厚度，已超過最佳負載量從而阻礙了E2在電極表面的氧化反應(yīng)。故本實驗的修飾劑選擇為0.5 mg/mL MWCNTs-CTAB，用量2.0 μL。

2.3.4SWV測定條件優(yōu)化采用SWV法進一步探討E2在MWCNTs-CTAB/SPE表面的方波伏安特性。考察了不同掃描頻率(10、15、20、25、30 Hz)下E2的SWV曲線。隨著掃描頻率的增加，E2的峰電流逐漸增大，超過20 Hz，峰電流減小(圖5A)；在不同電位增幅(8，10，12，14，16 mV)下，SWV測定E2，隨著電位增幅的增加，E2峰電流逐漸增大，超過12 mV，峰電流減小(圖5B)。因此SWV法的測定條件經(jīng)過優(yōu)化為起始電位:-0.8 V,終止電位:0.8 V,電位增量：12 mV,振幅:25 mV,頻率：10 Hz。

2.4 工作曲線和檢測限

在0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖溶液(pH=12)中，采用SWV法制作E2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程為：ip(μA)=2.147c(10-8mol/L)+0.0430，R=0.9968。E2的氧化峰電流與其濃度在5.0×10-10～1.0×10-8mol/L時呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，檢測限為5.0×10-11mol/L。

2.5 干擾實驗

E2在0.31 V附近產(chǎn)生一個氧化峰，通過在測定體系中逐步加入雌酮(E1)及雌三醇(E3)，發(fā)現(xiàn)E1和E3均會在附近產(chǎn)生一個疊加的氧化峰，從而對E2的測定產(chǎn)生干擾。由于E1、E2和E3在結(jié)構(gòu)上存在很大的相似性，因此E1和E3對生物樣品中E2的測定產(chǎn)生一定的干擾。但是由于生物血樣中雌激素主要以E2為主，E1和E3的含量相對較低，而且E1主要存在于絕經(jīng)婦女體內(nèi)，E3主要存在于妊娠期婦女體內(nèi)，因而E1和E3對于常規(guī)的血樣中E2的測定不會造成干擾。其他100倍的金屬離子如Zn2+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+無氧化還原峰，基本上不干擾E2的測定(誤差<5%)。

2.6 精密度和穩(wěn)定性

隨機抽取同一批次與不同批次制備的MWCNTs-CTAB/SPE，分別測定1.0×10-10mol/L、5.0×10-10mol/L、10×10-10mol/L E2。同一批次相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=5)分別為4.74%、4.43%、5.26%；不同批次的RSD分別為7.09%、6.35%、6.10%。將制備好的MWCNTs-CTAB/SPE置于干凈無塵的塑料袋中，4 ℃干燥保存，3個月內(nèi)進行測定，E2的測定基本不受影響。

2.7 MWCNTs-CTAB/SPE在生物樣本中的應(yīng)用

2.7.1MWCNTs-CTAB/SPE特異性實驗給予大鼠注射外源性E2后，大鼠體內(nèi)的E2含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化，在22 h附近達到最大吸收峰。分別給予大鼠注射低、中、高劑量的E2后，大鼠體內(nèi)的E2濃度表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，說明MWCNTs-CTAB/SPE能特異性地測定血樣中的E2(圖6A)。通過計算大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同空白對照組大鼠卵巢和子宮臟器(圖6B)相比，給予低劑量E2(0.18 mg/kg)的大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)出現(xiàn)明顯增加，子宮壁明顯增厚，這可能是E2促進了子宮細胞增生；給予中劑量E2(0.9 mg/kg)的大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)略微增長，和對照組無明顯差異；給予高劑量E2(4.5 mg/kg)的大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)反而下降，子宮出現(xiàn)一定程度的萎縮，這可能是高濃度的E2抑制了子宮的機能(圖6C)。

2.7.2MWCNTs/CTAB/SPE測定不同血樣中E2的含量分別利用MWCNTs/CTAB/SPE測定大鼠及小鼠血樣中E2含量，在上述基礎(chǔ)上，繼續(xù)增加E2濃度。隨著E2濃度的升高，峰電流值與濃度呈線性關(guān)系，加樣標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.9941與0.9933。計算得到大鼠血中的E2含量為7.91×10-10mol/L，小鼠血中的雌二醇含量為2.24×10-9mol/L。

2.7.3不同方法測定小鼠血樣中E2的含量采用MWCNTs/CTAB/SPE和RIA法分別測定小鼠血清中E2，再加入不同濃度 E2溶液測定加樣回收率?；厥章蕼y定結(jié)果見表1。

表1 小鼠血樣中E2回收率測定(n=5)

3 結(jié)論

MWCNTs-CTAB/SPE制備簡單，制備工藝容易標(biāo)準(zhǔn)化，便于進行質(zhì)量控制以及長期保存。通過給予大鼠注射外源性E2后，在22 h附近達到最大吸收峰，并且濃度變化曲線與給藥量表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。另外通過計算大鼠子宮和卵巢臟器指數(shù)，發(fā)現(xiàn)低劑量E2能促進子宮壁加厚，高劑量的E2反而導(dǎo)致子宮萎縮。以上結(jié)果表明MWCNTs-CTAB/SPE對生物樣本中的E2具有足夠的靈敏度，能夠直接用于生物樣本的測定，可以成為進行E2相關(guān)性研究和藥物篩選及臨床診斷輔助的有效工具。