一株石韋內(nèi)生真菌S-34的鑒定及其代謝物檢測與分析

李　姝，李寧浙，陳　沖，齊盼盼，宋麗菊，吳道艷，劉明棟，汪學閣，趙　建

（四川大學生命科學學院資源微生物及生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610064）

一株石韋內(nèi)生真菌S-34的鑒定及其代謝物檢測與分析

李姝，李寧浙，陳沖，齊盼盼，宋麗菊，吳道艷，劉明棟，汪學閣，趙建

（四川大學生命科學學院資源微生物及生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610064）

以藥用植物有柄石韋葉為材料，采用組織塊法與微量稀釋法分離并篩選出一株具有抑菌活性的內(nèi)生真菌S-34。經(jīng)形態(tài)學觀察、ITS測序與序列比對鑒定內(nèi)生真菌S-34為鏈格孢屬（Alternaria sp.）。進一步利用GC-MS對其代謝物進行檢測與分析，結(jié)果顯示：內(nèi)生真菌S-34發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的抑菌成分主要為氟苯甲酸（20.86%）、苯乙醇（4.89%）、2，3-丁二醇（3.64%），菌體乙酸乙酯提取物的抑菌成分主要為苯甲醛（2.27%）、亞麻醇（2.53%）、亞油酸單甘油酯（1.69%）、亞麻酰氯（9.28%）、反式角鯊烯（7.26%）、麥角甾醇（2.78%）。研究表明，有柄石韋內(nèi)生真菌S-34的代謝物中蘊藏著較為豐富的抑菌活性物質(zhì)，是開發(fā)天然藥物的潛在資源。

有柄石韋；內(nèi)生真菌；抑菌活性；代謝物；GC-MS

0　引　言

植物內(nèi)生真菌是指普遍存在于健康植物組織的內(nèi)部，但一般不引起植物病害的真菌，其與宿主協(xié)同進化形成穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，可產(chǎn)生與宿主植物相同或不同的生物活性物質(zhì)［1］，在抗腫瘤、抗氧化、抗菌、殺蟲等方面有一定的應(yīng)用前景。錢一鑫等［2］研究發(fā)現(xiàn)白苞蒿內(nèi)生真菌鏈格孢屬GYBH47的粗提物具有較好的抗腫瘤活性。Tao等［3］從植物taxus chinensis var.mairei內(nèi)生真菌Phomopsis sp.A240的代謝物中分離出一種具有抗氧化活性的內(nèi)酯類物質(zhì)。于淼等［4］對紅豆杉內(nèi)生真菌Xylariales sp.的代謝物進行分離純化，并從乙酸乙酯相中分離出2種具有抑菌活性的化合物。由此可見，植物內(nèi)生真菌的代謝物十分豐富。因此，從植物中分離內(nèi)生真菌是獲得新天然產(chǎn)物與新藥開發(fā)的潛在資源，同時也為替代有限的藥用植物資源提供了新的思路和方法。

中藥石韋為水龍骨科（Polypodiaceae）石韋屬（Pyrrosia）多種植物，其主要的植物來源包括有柄石韋（P.petiolosa）、廬山石韋（Pyrrosia sheareri）、氈毛石韋（Pyrrosia drakeana）等［5］。作為我國常用的中藥，石韋具有利水通淋、清肺泄熱、涼血止血等功效，石韋提取物同樣具有抗炎利尿、抑菌、抗病毒、增強免疫力等作用［6］。目前，對于石韋主要化學活性成分研究較多，但對于石韋內(nèi)生真菌代謝物的研究還未見報道。本文從有柄石韋中分離并篩選出具有抑菌活性的內(nèi)生真菌S-34，并通過GC-MS對其代謝物的有效成分進行初步研究，以期為進一步利用石韋內(nèi)生真菌代謝物獲得新的天然產(chǎn)物及開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物

有柄石韋葉采自四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣，經(jīng)鑒定后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試病原菌

供試病原細菌6種，其中革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus），耐久腸球菌（Enterococcus durans），藤黃微球菌（Micrococcus luteus）；革蘭氏陰性菌為大腸桿菌（Escherichia coli），腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis），志賀氏桿菌（Shigella sonnei）。所有菌株均為本實驗室保藏菌種。

1.1.3試劑與儀器

無水乙醇、次氯酸鈉、乙酸乙酯、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉均為國產(chǎn)分析純；氯霉素（Amersco公司）；真菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA公司）；Premix TaqTM（TaKaRa公司）；ITS1、ITS4引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）。

恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司，THZ-98C）；顯微鏡（OLYMPUS，DP73）；PCR儀（Analytik Jena，Easy Cycler 96）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司，R-201）；氣相色譜質(zhì)譜儀（SHIMADZU，QP2010 Plus）。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制

真菌PDA培養(yǎng)基與細菌LB培養(yǎng)基的配制參照文獻［7］。

1.2.2內(nèi)生真菌的分離純化

取新鮮有柄石韋葉用自來水沖洗2h，經(jīng)無菌水漂洗3遍后，用無菌濾紙吸干表面的水分。按無菌操作依次進行表面消毒：75%乙醇浸泡1 min，5.2%次氯酸鈉浸泡5min，75%乙醇浸泡0.5min，無菌水漂洗5次，無菌濾紙吸干表面水分。將處理后葉片剪成0.6cm×0.6cm的小塊貼于含氯霉素（34μg/mL）的PDA培養(yǎng)基表面，每個平板放置4片，于28℃條件下培養(yǎng)3～15d，以最后一次消毒所用無菌水涂布平板作為對照。待葉片周圍長出菌絲后，挑取菌絲頂端部分轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基（含氯霉素）中逐步純化，即得有柄石韋內(nèi)生真菌，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3內(nèi)生真菌S-34的形態(tài)觀察

將內(nèi)生真菌S-34點接于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別觀察菌落形態(tài)及菌絲體顯微形態(tài)。

1.2.4內(nèi)生真菌S-34的分子鑒定

按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取S-34的基因組DNA，以ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3＇、ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇為通用引物［8］分別擴增內(nèi)生真菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列。PCR反應(yīng)體系為DNA模板4μL、上下游引物各2μL、Premix Taq 25μL、ddH2O 17μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行測序。測序結(jié)果拼接后通過NCBI的BLAST平臺進行序列同源性分析，選取相似度高的序列進行Clustal W多重序列比對，采用軟件MEGA 6通過N-J法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展值（Bootstrap）為1000。

1.2.5內(nèi)生真菌S-34提取物的制備

取2塊直徑約6 mm的內(nèi)生真菌S-34菌餅接種于裝有150 mL PDA培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，120r/min，28℃搖床培養(yǎng)8d。培養(yǎng)物以4層紗布過濾，得內(nèi)生真菌發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液與乙酸乙酯等體積混合24 h后萃取3次，合并萃取液，乙酸乙酯相40℃減壓旋蒸濃縮至2mL，得發(fā)酵液乙酸乙酯提取物A；菌絲體經(jīng)液氮充分研磨后用乙酸乙酯浸泡24 h，乙酸乙酯相40℃減壓旋蒸濃縮至2 mL，得菌絲體乙酸乙酯提取物B；酯提液分別經(jīng)微孔膜（0.22μm）過濾除菌后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6內(nèi)生真菌S-34提取物抑菌活性的測定

采用微量稀釋法測定提取物的抑菌活性。先將已活化的各供試病原細菌轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用LB液體培養(yǎng)基稀釋至108CFU/mL。向96孔板中分別加入0，25，50，100 μL的提取物，用LB液體培養(yǎng)基補齊各孔至190μL，混勻后取10μL菌懸液加入各孔，37℃培養(yǎng)12h。將各孔培養(yǎng)物適當稀釋，取100 μL涂布平板，37℃培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)，重復(fù)3次。以乙酸乙酯作為提取物的陰性對照，以不加任何提取物作為空白對照。抑制率計算方法如下：

抑制率=（陰性對照菌落數(shù)-實驗組菌落數(shù)）/

空白對照菌落數(shù)×100%

1.2.7內(nèi)生真菌S-34提取物的GC-MS檢測

采用GC-MS分別對內(nèi)生真菌S-34提取物A與提取物B進行檢測，并初步分析其主要成分。GC-MS條件：載氣為氦氣，柱流量1.0 mL/min，進樣溫度290℃，進樣壓力49.5kPa，進樣體積1μL，分流比：10∶1。柱箱程序：初始溫度40℃，保持5min；以10℃/min升至100℃，保持5 min；以5℃/min升至200℃，保持5min；以10℃/min升至280℃，保持5min；以5℃/min升至300℃，保持5 min。離子源與接口溫度分別為200℃，220℃。電子能量70eV。全掃描范圍22～600m/z。溶劑延遲時間3.5min。

檢測時以PDA培養(yǎng)基乙酸乙酯提取物作為空白對照。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌S-34的形態(tài)特征

有柄石韋葉經(jīng)表面消毒，最后一次清洗所用無菌水涂布平板無雜菌長出，表明消毒徹底，分離到的真菌為有柄石韋的內(nèi)生真菌。內(nèi)生真菌S-34在PDA培養(yǎng)基上初期菌落為白色，后期逐漸變?yōu)榛液稚?，絨毛狀，菌落邊緣較整齊，背面呈深墨綠色（見圖1（a））。S-34菌絲細長，有橫膈，末端有分支（見圖1（b），圖1（c））。

圖1　S-34菌落形態(tài)與顯微形態(tài)

2.2內(nèi)生真菌S-34的ITS序列測定及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

內(nèi)生真菌S-34的ITS序列大小為566 bp。經(jīng)BLAST比對顯示，S-34與鏈格孢屬（Alternaria sp.）具有較高同源性，其中與Alternaria brassicae W3（JF439450.1）相似性達99%。篩選與S-34同源性較高的序列通過N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（見圖2），結(jié)果顯示S-34與Alternaria brassicae W3處于同一分支，1000次自展分析完全支持該分支。

2.3內(nèi)生真菌S-34提取物的抑菌活性測定

內(nèi)生真菌S-34提取物對不同病原菌的抑制結(jié)果見表1、表2。提取物A與提取物B對6種供試病原細菌均有較好的抑菌效果，并隨提取物加入量的增加，抑菌效果增強。在提取物加入量為25 μL時，提取物A對藤黃微球菌的抑菌效果最好，抑菌率達71.02%，提取物B對志賀氏桿菌的抑菌效果最好，抑菌率達73.76%。對于革蘭氏陰性菌而言，提取物B的抑菌效果普遍強于提取物A，對于革蘭氏陽性菌而言，提取物A的抑菌效果普遍強于提取物B。

2.4內(nèi)生真菌S-34提取物的GC-MS檢測與分析

根據(jù)GC-MS的分析結(jié)果，對比去除空白對照后，內(nèi)生真菌S-34提取物A與提取物B分別檢測出26種、34種化合物，主要成分見表3、表4，各類物質(zhì)所含化合物的數(shù)量與相對含量見圖3。由圖可知，提取物A主要包含5類物質(zhì)，其中以烴類、醇類所含化合物種類最為豐富，分別檢測到8種烴類物質(zhì)、6種醇類物質(zhì)，以酸類、烴類、醇類的含量較高，分別占提取物A的21.24%、17.24%、13.34%。提取物B主要包含8類物質(zhì)，其中以烴類、酯類所含化合物種類最為豐富，分別檢測到8種烴類物質(zhì)、7種酯類物質(zhì)，以酯類、烴類、脂類的含量較高，分別占提取物B的18.10%、16.91%、12.56%。

圖2　內(nèi)生真菌S-34的系統(tǒng)進化樹

表1　內(nèi)生真菌S-34提取物對病原菌的抑菌作用　CFU/mL

表2　內(nèi)生真菌S-34提取物對病原菌的抑制率

表3　內(nèi)生真菌S-34提取物A化學成分檢測結(jié)果

3　結(jié)束語

本文對新鮮有柄石韋的內(nèi)生真菌進行分離純化，篩選出一株具有抑菌活性的內(nèi)生真菌S-34，經(jīng)形態(tài)學與分子學的方法，并結(jié)合ITS序列比對與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，鑒定其為鏈格孢屬（Alternaria sp.）。Ge［9］、田仁鵬［10］等分別從北方、南方紅豆杉中分離出產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌鏈格孢屬。劉艷等［11］從海南粗榧中分離出產(chǎn)抗癌活性物質(zhì)高三尖杉酯堿的內(nèi)生真菌細極鏈格孢。蔡慶秀等［12］從藥用植物辣木中分離出一株內(nèi)生真菌鏈格孢屬，其發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的主要抑菌成分為鏈格苝醇。張弘馳等［13］從無花果內(nèi)生真菌鏈格孢屬FL24的發(fā)酵液粗提物中分離出具有抗菌活性的麥角甾醇，與本研究的結(jié)果有相似之處。這表明鏈格孢屬作為植物的內(nèi)生真菌，其代謝物中的活性成分十分豐富。

表4　內(nèi)生真菌S-34提取物B化學成分檢測結(jié)果

圖3　內(nèi)生真菌S-34提取物種類數(shù)量與相對含量

內(nèi)生真菌S-34發(fā)酵上清液與菌體經(jīng)乙酸乙酯提取后，對6種常見的供試病原細菌均具有明顯的抑制作用。利用GC-MS對兩種酯提物進行分析，結(jié)果表明其發(fā)酵上清液乙酸乙酯提取物的成分主要為酸類、烴類、醇類，這幾種物質(zhì)所含化合物種類也相對較多，而菌體乙酸乙酯提取物的成分主要為酯類、烴類、脂類。兩種酯提物所含成分的不同可能導(dǎo)致其對不同病原菌的作用效果不同。

目前已有研究報道，有機酸類、醇類、脂類（甾醇等）具有抑菌效應(yīng)。李舜等［14］利用苯甲酸與中藥抽提液進行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)其抑菌效果顯著且優(yōu)于單純中藥提取液。沈生強等［15］以氟苯甲酸為原料合成的化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌均具有較好的抑菌效果。梁海燕等［16］研究證明了苯乙醇的抗真菌能力。李玉珍等［17］從小麥中分離的抗毒素有效成分2，3-丁二醇對小麥赤霉具有較好的抑菌效力。本實驗所研究的內(nèi)生真菌S-34發(fā)酵上清液乙酸乙酯提取物中也含有抑菌物質(zhì)氟苯甲酸（20.86%）、苯乙醇（4.89%）與2，3-丁二醇（3.64%）。此外，內(nèi)生真菌S-34菌體乙酸乙酯提取物中也檢測出6種具有抑菌活性的物質(zhì)，分別是苯甲醛、亞麻醇、亞油酸單甘油酯、亞麻酰氯、反式角鯊烯、麥角甾醇［18-19］，其抑菌成分的總相對含量較高，達26.35%。這表明有柄石韋內(nèi)生真菌S-34提取物中存在豐富的抑菌活性成分，可望與藥用植物研究相結(jié)合以推動藥用植物的可持續(xù)性開發(fā)利用。

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（編輯：莫婕）

Identification of an endophytic fungus S-34 isolated from Pyrrosia petiolosa and analysis of its metabolites

LI Shu，LI Ningzhe，CHEN Chong，QI Panpan，SONG Liju，WU Daoyan，LIU Mingdong，WANG Xuege，ZHAO Jian
（Key Laboratory of Microbiological Resource and Technology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

An endophytic fungus S-34 which has antimicrobial activity was isolated from the leaves of the Chinese medicinal plant P.petiolosa through a tissue separating method and a microdilution method.The endophytic fungus S-34 was identified as Alternaria sp.according to the morphologic observation and ITS sequence analysis.Its metabolites were further studied with GC-MS.The findings show that the main antibacterial components of the fermentation liquid of S-34 extracted with ethyl acetate were fluorobenzoic acid（20.86%），phenylethyl alcohol（4.89%），2，3-butanediol（3.64%）.Besides，the main antibacterial components of the mycelia ethyl acetate extract were benzaldehyde（2.27%），linoleny alcohol（2.53%），9，12-octadecadienoicacid（Z，Z）-2，3-dihydroxypropyl ester（1.69%），9，12-octadecadienoylchloride，（Z，Z）-（9.28%），2，6，10，14，18，22-tetracosahexaene，2，6，10，15，19，23-hexamethyl-，（all-E）-（7.26%），neoergosterol（2.78%）.As indicated in the study above，the endophytic fungus S-34 of P.petiolosa contains plenty of antibacterial substances as potential resources for the development of natural medicines.

P.petiolosa；endophytic fungi；antimicrobial activities；metabolite；GC-MS

A

1674-5124（2016）05-0061-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.013

2016-01-15；

2016-02-13

國家自然科學基金（31270175）；教育部新世紀人才和川大優(yōu)秀青年學者項目（NCET-13-0397，2013SCU04B14）

李姝（1991-），女，湖北宜昌市人，碩士研究生，專業(yè)方向為資源微生物應(yīng)用。

趙建（1976-），男，江蘇揚州市人，教授，博士，主要從事資源微生物及微生物天然免疫研究。