固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶中9種性激素殘留

尤亮亮，魏　巍，劉海燕，王欣璐，曾麗萍，張玲琳，聶遠(yuǎn)洋

（1.新希望乳業(yè)控股有限公司技術(shù)中心，四川 成都 610016；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150006）

固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶中9種性激素殘留

尤亮亮1，魏巍2，劉海燕1，王欣璐1，曾麗萍1，張玲琳1，聶遠(yuǎn)洋1

（1.新希望乳業(yè)控股有限公司技術(shù)中心，四川 成都 610016；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150006）

采用固相萃取-高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（SPE-HPLC/MS），建立牛奶中9種性激素（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、諾龍、甲睪酮、丙酸睪酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮）殘留的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)甲醇提取，過(guò)固相萃取柱凈化，氮?dú)獯蹈?，殘留物甲醇溶解后測(cè)定。其中雌激素（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇）采用負(fù)模式；其余性激素為正模式，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式定性定量分析。雌激素檢出限（LODs）為1.1～1.2μg/L，定量限（LOQs）為3.63～3.96 μg/L；其余性激素檢出限（LODs）為0.1～0.5 μg/L，定量限（LOQs）為0.33～1.65 μg/L；分別在20.0～500.0 μg/L及2.5～100.0μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.9944）。在50.0～100.0μg/L的添加水平上，9種性激素的平均回收率在82.7%～98.2%之間，變異系數(shù)（CV）為4.2%～11.2%。該法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可用于牛奶中9種性激素的測(cè)定。

性激素；牛奶；固相萃??；高效液相色譜-質(zhì)譜法

0　引　言

性激素（sex hormones）是一類(lèi)由動(dòng)物體性腺所產(chǎn)生或人工合成的低分子量、親脂性、具有生物活性的類(lèi)固醇類(lèi)物質(zhì)［1］。它是甾體同化激素中最主要組成部分，這些物質(zhì)具有蛋白質(zhì)同化作用，通過(guò)增強(qiáng)食欲、抑制發(fā)情和提高飼料轉(zhuǎn)化率，達(dá)到大幅度提高動(dòng)物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的目的［2］。畜牧業(yè)濫用這些類(lèi)固醇類(lèi)激素，導(dǎo)致這些激素殘留最終通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，已成為全球性的食品安全問(wèn)題［3］。有研究指出激素殘留人體有“三致”作用，主要是導(dǎo)致體內(nèi)脂肪堆積、兒童性早熟以及自身激素分泌失調(diào)，長(zhǎng)期攝入可造成內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)腫瘤、生長(zhǎng)發(fā)育障礙、出生缺陷、生育缺陷及不孕不育等，給人體健康帶來(lái)不良影響［4-5］。

關(guān)于牛奶中的性激素殘留測(cè)定方法有很多，目前國(guó)內(nèi)外最普遍的檢測(cè)方法為儀器法和免疫法。儀器分析法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC/MS）［6］、超高效液相-質(zhì)譜法（UPLC/MS）［7-8］和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）［9］，隨著酶聯(lián)免疫技術(shù)的迅速推廣，被企業(yè)等普遍采用。樣品前處理方式也較多，如固相萃取、分散固相萃取［9］、中空纖維棒液液萃取［10］等。要達(dá)到高靈敏度和檢出限，就需要采用液質(zhì)聯(lián)用的方法；因此，近年來(lái)采用液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定牛奶中激素含量成為了研究熱點(diǎn)。調(diào)查表明牛乳和初乳中有大量類(lèi)固醇激素［11］，但目前關(guān)于牛奶奶源的激素情況普查較少。本文在這些研究基礎(chǔ)上，選取了固相萃取柱凈化的方法，建立了高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC/MS）測(cè)定牛奶中常見(jiàn)的9種性激素殘留的方法，并從奶源入手，應(yīng)用所建立的方法檢測(cè)了四川某牧場(chǎng)的原料奶檢測(cè)了其性激素殘留狀況。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、諾龍、甲睪酮、丙酸睪酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮）均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于97.5%。甲酸（色譜級(jí)），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水（優(yōu)級(jí)純），成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈（色譜級(jí)），美國(guó)Tedia公司；超純水；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Agilent 1260）-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent 6410）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg 6 mL）；DIKMA ProElut C18固相萃取柱（500mg 6mL）；Agilent Bond Elut PLEXA固相萃取柱（500mg 6mL）；離心機(jī)（蜀科LG10-2.4A）；旋渦混勻器（Ika MS3）；電子天平（龍騰ESJ-200-4B）；12位水浴型氮吹儀（華盛譜信QF-3800）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器KQ-5200E）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（亞榮生化儀器RE-52AA）。

1.3標(biāo)準(zhǔn)液配制

分別稱(chēng)取每種性激素標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用甲醇定容至10mL棕色容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為1000mg/L的母液，于-20℃冰箱避光保存，放置時(shí)間不宜超過(guò)半年。再用甲醇將其稀釋成質(zhì)量濃度為1mg/L的中間儲(chǔ)備液。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)際操作要求，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4儀器參數(shù)

1.4.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1mm×150mm，5μm），柱溫：40℃，進(jìn)樣體積：10 μL，流量：0.3 mL/min。按表1和表2進(jìn)行梯度洗脫。

表1　雌激素梯度洗脫條件1）～2）

表2　其余6種性激素梯度洗脫條件1）～2）

1.4.2質(zhì)譜條件

多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，電噴霧離子源（ESI）；干燥氣流量：10 mL/min；干燥氣溫度：350℃；霧化器壓力：35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛細(xì)管電壓：正模式4000V，負(fù)模式3500V；其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。

表3　9種性激素質(zhì)譜MRM采集參數(shù)

1.5樣品處理

1.5.1提取

稱(chēng)取5.0g的牛奶試樣，置于50mL離心管中，加入25mL甲醇，旋渦混勻1 min，超聲振蕩15min，于7000r/min條件下離心15min，將上清液置于雞心瓶中，加入20mL正己烷萃取兩次，去掉正己烷層后于45℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)? mL甲醇和20mL水充分溶解，溶液用于固相萃取。

1.5.2凈化

Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化后，將試樣溶液過(guò)柱，再用5 mL水淋洗，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈桑尤?mL甲醇，旋渦振蕩1min，過(guò)0.22μm濾膜，濾液置于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)進(jìn)行LC/MS分析。

2　結(jié)果與分析

2.1提取液的選擇

常用提取劑有水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等［12-13］，近年來(lái)研究以甲醇和乙腈為提取劑效果顯著［14］。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯提取后乳化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，7 000 r/min離心15min后仍無(wú)明顯效果；乙腈和甲醇提取的峰面積無(wú)顯著差異，綜合考慮到試劑毒性等因素，最終選擇甲醇作為提取液。

2.2流動(dòng)相的選擇

質(zhì)譜測(cè)定性激素常用流動(dòng)相為甲醇和水或者乙腈和水，本文中除雌激素外的其他性激素的流動(dòng)相為甲醇和水，由于甲醇為流動(dòng)相各激素的響應(yīng)信號(hào)要高于乙腈，故選擇甲醇和水。其中添加甲酸的目的是有利于目標(biāo)物質(zhì)的離子化，本文對(duì)比了不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%和0.3%），從各激素的響應(yīng)值得出最適的甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從0.05%～0.1%時(shí)，各激素的響應(yīng)值逐漸增加，從0.1%～0.3%時(shí)，各激素的響應(yīng)值不斷降低，所以當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值最適。檢測(cè)雌激素的流動(dòng)相為乙腈和水（0.1%的氨水），實(shí)驗(yàn)表明，0.1%氨水有效地提高了雌激素的質(zhì)譜響應(yīng)。

2.3固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用固相萃?。⊿PE）方式凈化樣品，實(shí)驗(yàn)中選擇了Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut C18及Agilent Bond Elut PLEXA 3種SPE小柱，通過(guò)加標(biāo)回收率來(lái)選擇合適的小柱，加標(biāo)濃度為100μg/L，結(jié)果3種固相萃取柱對(duì)于9種性激素的加標(biāo)回收率范圍分別為70.4%～96%，30%～60.2%和34.5%～71.8%。因此，最終選擇Waters Oasis HLB小柱。

2.4加標(biāo)回收率和檢出限（LODs）線性關(guān)系、方法回收率與精密度

按上述處理方法，配制各激素系列的混標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度為2.5～500μg/L，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)均大于0.9944，表明各激素在質(zhì)量濃度為2.5～500μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如表4所示。

表4　線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LODs）和定量限（LOQs）

取牛奶樣品做回收率實(shí)驗(yàn)，在5.0g牛奶中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，性激素添加水平為50，100μg/kg，每個(gè)添加水平平行檢測(cè)6次（n=6）。按上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程處理后，得出各激素的回收率和變異系數(shù)（CV），結(jié)果如表5所示。

表5　9種性激素回收率和變異系數(shù)（CV）

2.5樣品分析

用建立的方法對(duì)四川某牧場(chǎng)隨機(jī)采集的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)選取健康無(wú)抗生素使用、無(wú)激素類(lèi)藥物使用且處在不同泌乳時(shí)期的荷斯坦奶牛90頭，每頭牛分別采集50mL，跟蹤采集10頭牛分娩后1～7d的初乳。采集到的牛奶樣品-20℃密封保存，檢測(cè)時(shí)，解凍即可。檢測(cè)結(jié)果如表6所示。

表6　牛初乳激素組成及含量的變化（xˉ±SD）

由表6可以看出，牛初乳中激素種類(lèi)較多，且隨天數(shù)的增加有下降趨勢(shì)，其中3種內(nèi)源性激素：17α-雌二醇、雌酮、雌三醇到第3天以后均未檢出，丙酸睪酮第4天后也未檢出。初乳中激素種類(lèi)較多且含量較高，這主要來(lái)源于奶牛的人工授精以及自身妊娠期的分泌。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)常乳（共90頭：牛只胎次以1次為主，涵蓋1～4胎次；其中牛只泌乳期涵蓋1～10個(gè)月）中含有3種性激素，3種激素分別為醋酸甲羥孕酮、甲睪酮和諾龍。醋酸甲羥孕酮主要集中在泌乳初期的第1個(gè)月，其中該激素含量的變化范圍為0.25～1.55μg/kg。甲睪酮主要集中在泌乳初期第1～2月，該激素含量的變化范圍為0.22～3.43 μg/kg。諾龍集中在泌乳初期第1個(gè)月，該激素含量變化范圍是0.56～3.74μg/kg。由此可見(jiàn)，牛奶中這3種激素的降解速度較慢。

初乳測(cè)定結(jié)果與范志影等［15］關(guān)于內(nèi)源性激素的報(bào)道一致，雌酮：3220 ng/kg，17α-雌二醇：727ng/kg，雌三醇：167ng/kg。對(duì)常乳的報(bào)道較少，曹勁松等［16］研究表明常乳中存在一定含量的雌激素，其中雌三醇為9～31pg/mL。目前測(cè)定均為市售牛奶樣品，張艷等［17］研究檢測(cè)出孕酮及17α-雌二醇，本研究中常乳經(jīng)檢測(cè)并未檢出此類(lèi)激素。

3　結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中9種性激素多殘留的方法。其中3種雌激素和其余性激素分別采用不同離子模式均得到較好分離。應(yīng)用建立的方法對(duì)四川某牧場(chǎng)牛初乳以及常乳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到3種性激素，并主要存在于泌乳期前2個(gè)月，結(jié)果表明并未檢測(cè)出常見(jiàn)的內(nèi)源性雌激素，可能是方法檢出限略高的原因［18］。由于牛奶是激素?cái)z入的主要來(lái)源之一，因此加強(qiáng)對(duì)牛奶中激素的檢測(cè)十分必要。經(jīng)驗(yàn)證該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，可作為牛奶中性激素測(cè)定的檢測(cè)方法，也可為其他乳制品中性激素的檢測(cè)提供方法參考。

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（編輯：徐柳）

Solid-phase extraction followed by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the determination of 9 hormones residues in milk

YOU Liangliang1，WEI Wei2，LIU Haiyan1，WANG Xinlu1，ZENG Liping1，ZHANG Linglin1，NIE Yuanyang1
（1.Technology Center，New Hope Dairy Holdings Co.，Ltd.，Chengdu 610016，China；2.Institute of Chemical Industry，Harbin Institute of Technology，Harbin 150006，China）

A sensitive solid-phase extration/high-performance liquid chromatography-mass spectrometry method was established to determine 9 hormones residues（E1，E3，αE2，NT，MTS，PTS，CMA，MA，MPA）in milk.Milk samples were extracted first and then further purified on a solid-phase extraction column.After that，the purified solution was dried through nitrogen and the residues were dissolved in the mixture of methanol before LC-MS/MS analysis.Negative ion modes were adopted for 3 estrogens（E1，E3，αE2）while positive ion modes for all the other sex hormones. A multiple-reaction monitoring（MRM）mode was used for analysis.For the estrogens，the limits of detection（LODs）ranged from 1.1μg/L to 1.2 μg/L whereas the limits of quantification（LOQs）were between 3.63μg/L and 3.96μg/L.For the other sex hormones，the LODs ranged from 0.1μg/L to 0.5μg/L whilst the LOQs were between 0.33μg/L and 1.65μg/L.Regression equations of these hormones had a good linear relationship（r2greater than 0.9944）within 20.0-500.0μg/L and 2.5-100.0 μg/L.The average recoveries of 9 hormones were from 82.7%to 98.2%with the coefficients of variation（CV）between 4.2%and 11.2%（n=6）at the spiked levels of 50.0-100.0 μg/L.The method is simple，sensitive and therefore can be used to determine the residues of all the 9 hormones in cow milk.

sex hormone；milk；solid-phase extraction（SPE）；high-performance liquid chromatographymass spectrometry（HPLC/MS）

A

1674-5124（2016）05-0046-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.010

2015-12-29；

2016-02-02

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD12B04）

尤亮亮（1988-），男，黑龍江綏化市人，碩士，主要從事乳品科學(xué)方面的研究。

聶遠(yuǎn)洋（1986-），男，重慶市人，博士，主要從事乳品微生物方面的研究。