春雷霉素與葉枯唑?qū)S瓜細(xì)菌性角斑病菌的聯(lián)合毒力

姜珊珊 辛志梅 吳斌 張眉 王升吉 辛相啟

摘要：為明確春雷霉素（Kasugamycin）與葉枯唑（Bismerthiazol）混配對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌（Pseudomonas syringe pv.lachrymanas）的增效作用及最佳配比，采用渾濁度法測定了春雷霉素與葉枯唑混配對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的毒力。結(jié)果表明：春雷霉素、葉枯唑?qū)S瓜細(xì)菌性角斑病菌的EC50分別為8.739、39.227 mg·L-1，春雷霉素對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)生物活性明顯高于葉枯唑；春雷霉素與葉枯唑混配對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌表現(xiàn)為增效作用，5個配比中，1∶5配比的SR為1.71，增效作用最明顯。

關(guān)鍵詞：春雷霉素；葉枯唑；黃瓜細(xì)菌性角斑病菌；聯(lián)合毒力；增效作用

中圖分類號：S482.2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）09-0103-04

AbstractIn order to clarify the synergistic effects of kasugamycin and bismerthiazol to Pseudomonas syringae pv. lachrymans， and to find the best mixture ratio of two preparations， the toxicities of kasugamycin and bismerthiazol and their mixtures at five different ratios against P. syringae were tested by turbidity method. The results showed that the EC50 of P. syringae were 8.739 mg·L-1 and 39.227 mg·L-1，respectively， when affected by kasugamycin and bismerthiazol， and the indoor toxicity of kasugamycin was obviously higher than that of bismerthiazol. There was synergism between kasugamycin and bismerthiazol. In the 5 different mixture ratios， the ratio of 1∶5 with the synergistic coefficient as 1.71 had the strongest synergistic effect.

KeywordsKasugamycin； Bismerthiazol； Pseudomonas syringae； Combined toxicity； Synergistic effect

黃瓜細(xì)菌性角斑?。≒seudomonas syringe pv. lachrymanas）是黃瓜生產(chǎn)中的重要病害之一，可為害葉、葉柄、瓜蔓及果實(shí)，在適宜條件下，可迅速擴(kuò)展蔓延，造成葉片干枯、果實(shí)腐爛，一般減產(chǎn)30%～50%，嚴(yán)重時損失高達(dá)50%～60%，甚至絕收。保護(hù)地栽培環(huán)境條件有利于黃瓜細(xì)菌性角斑病的發(fā)生與流行[1，3]，隨著保護(hù)地面積的擴(kuò)大，該病害造成的經(jīng)濟(jì)損失日益加重。

當(dāng)前我國針對黃瓜細(xì)菌性角斑病的高抗品種及種質(zhì)資源比較缺乏[4，5]，藥劑防治是控制該病害的重要措施。目前已經(jīng)登記的用于防治該病害的藥劑主要有琥膠肥酸銅（Copper）、中生菌素（Zhongshengmycin）等7種單劑，且防效一般[6，7]。面對日益嚴(yán)峻的防治壓力，探索和研究高效低毒的復(fù)配藥劑成為一種途徑。據(jù)報道，辛菌胺醋酸鹽、中生菌素、春雷霉素、甲磺酰菌唑等與其他殺菌活性物組合的復(fù)配藥劑的防效皆高于單劑。

結(jié)構(gòu)類型不同的殺菌劑復(fù)配使用是提高防效、延緩抗藥性發(fā)展、降低用藥成本的重要途徑[8]。藥劑之間不同配比的聯(lián)合作用效果評價是殺菌劑復(fù)配的基礎(chǔ)研究工作。鑒于此，本研究測定了春雷霉素與葉枯唑單劑及其5種復(fù)配組合對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的毒力，明確不同配比對該病菌的聯(lián)合作用類型，以期為復(fù)配藥劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試病原菌

黃瓜細(xì)菌性角斑病病葉采自山東省泰安市，在山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室經(jīng)NA（nutrient agar）培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)組織分離法分離、純化、鑒定獲得供試菌株，按照柯赫氏法則（Kochs Rule）[9]進(jìn)行致病性測定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試藥劑

65%春雷霉素原藥、90%葉枯唑原藥，由山東海立信農(nóng)化有限公司提供。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1藥液的配制春雷霉素原藥直接用水稀釋；葉枯唑原藥先用二甲基甲酰胺溶解，后用含0.1%吐溫-80的水溶液稀釋。采用逐級稀釋法配制各質(zhì)量濃度的藥液。春雷霉素和葉枯唑2種單劑及5種混劑組合（春雷霉素∶葉枯唑?yàn)?∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7）均設(shè)7個系列質(zhì)量濃度，其中春雷霉素單劑及5種混配組合質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg·L-1，葉枯唑單劑質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 mg·L-1。以藥劑有效成分在培養(yǎng)基中的濃度為測試濃度[10]，藥液濃度為測試濃度的25倍。

1.3.2菌液的配制將供試病菌菌株活化培養(yǎng)24 h，用無菌水稀釋成107 cfu·mL-1的菌液。

1.3.3菌懸液的配制將NB（nutrient broth）培養(yǎng)基定量（24.0 mL）分裝于玻璃瓶中，高溫滅菌。在無菌條件下，用微量移液器從低濃度到高濃度依次向每瓶內(nèi)注入1.0 mL藥液?？瞻讓φ兆⑷?.0 mL 0.1%吐溫-80無菌水。用滅菌吸管取0.1 mL菌液，接種到上述培養(yǎng)基中，充分搖勻。每處理重復(fù)4次。

1.3.4細(xì)菌生長量測定取空白滅菌培養(yǎng)液一瓶，注入1.0 mL 0.1%吐溫-80無菌水，做標(biāo)準(zhǔn)樣品用于校正分光光度計零點(diǎn)，調(diào)零后該培養(yǎng)液置于1～3℃冰箱內(nèi)保存。

用752型分光光度計測定各處理菌懸液初始OD600值（600 nm光密度值），記為“培養(yǎng)前OD600值”。然后置于24℃條件下振蕩培養(yǎng)（120 r/min），待空白對照處理達(dá)到對數(shù)生長期（培養(yǎng)24 h）時，測定并記載各處理菌懸液OD600值，記為“培養(yǎng)后OD600值”。

調(diào)查方法參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1156.16—2008《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第16部分：抑制細(xì)菌生長量試驗(yàn)渾濁度法》[11]。

按式（1）、（2）計算生長抑制率：

OD600增加值=培養(yǎng)后OD600值-培養(yǎng)前OD600值（1）

生長抑制率（%）=（1- 藥劑處理OD600增加值/空白對照OD600增加值）×100（2）

1.4統(tǒng)計分析

以藥劑濃度對數(shù)值為自變量x、以生長抑制率的幾率值為因變量y作回歸分析，求出毒力回歸方程（y=a+bx）和相關(guān)系數(shù)（r），計算各藥劑的EC50及其95%置信限。

按Wadley法，計算增效系數(shù)（SR）；根據(jù)SR值評價藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用，公式如式（3）、（4）。

SR=EC50（th）EC50（ob）（3）

EC50（th）=a+baEC（A）50+bEC（B）50（4）

式中：A、B分別為春雷霉素、葉枯唑單劑，a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，EC50（th）為混劑EC50理論值，EC50（ob）為混劑EC50實(shí)測值。

2結(jié)果與分析

2.1春雷霉素、葉枯唑單劑對靶標(biāo)病菌生長的影響

春雷霉素濃度為0.1～100.0 mg·L-1時，對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的生長抑制率為7.48%～78.55%；葉枯唑濃度為0.5～200.0 mg·L-1時，對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的生長抑制率為7.25%～62.38%，詳見表1。

2.3對靶標(biāo)病菌的毒力及聯(lián)合作用類型

表3數(shù)據(jù)表明，春雷霉素和葉枯唑?qū)S瓜細(xì)菌性角斑病菌的EC50分別為8.739 mg·L-1、39.227 mg·L-1，春雷霉素對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)生物活性明顯高于葉枯唑。春雷霉素與葉枯唑的配比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的SR值分別為1.60、1.65、1.71、1.67、1.66，均大于1.5，表明上述5種混配組合對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌都表現(xiàn)為增效作用，二者比例為1∶5時，SR值最大，增效作用最明顯。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，葉枯唑?qū)S瓜細(xì)菌性角斑病菌的EC50值為春雷霉素的4倍多，說明春雷霉素抑制黃瓜細(xì)菌性角斑病菌生長的作用明顯強(qiáng)于葉枯唑。關(guān)于藥劑對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌室內(nèi)毒力測定研究少見報道，本研究可為篩選防治該病害的高效低毒藥劑提供參考。

從春雷霉素和葉枯唑以及二者不同配比混配對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌抑制率的回歸方程可以看出，b值都小于1，表明相對于抑菌率的增加，藥劑濃度的增加速度更快，從而導(dǎo)致EC90值會較大。據(jù)此推測，當(dāng)田間病害大發(fā)生時用藥，防治效果欠佳。因此，應(yīng)用春雷霉素和葉枯唑及其混配藥劑防治黃瓜細(xì)菌性角斑病菌時，要注意合理選擇用藥時機(jī)，應(yīng)在病害初發(fā)生時及時施藥。

從春雷霉素與葉枯唑不同比例混配對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的聯(lián)合作用類型結(jié)果可以看出，春雷霉素和葉枯唑以1∶5配比混配，SR值1.71，增效作用最明顯。張少武等[12]也進(jìn)行了春雷霉素與葉枯唑?qū)S瓜細(xì)菌性角斑病菌的聯(lián)合作用研究，春雷霉素與葉枯唑以5∶1、4∶6.25、3∶12.5、2∶18.75、1∶25五種配比混合，SR值分別為1.22、1.35、1.47、1.45、1.35，與本文結(jié)果基本一致，但由于配比設(shè)置跨度大，使確定最優(yōu)配比的參考價值不足。本研究對配比進(jìn)一步細(xì)化，同時獲取各混配比例的防效，為復(fù)配制劑的研發(fā)提供依據(jù)。

不同作用位點(diǎn)的藥劑混配能增強(qiáng)對病菌生長的干擾而具有增效作用，是藥劑復(fù)配的基本原則之一。春雷霉素是由春雷鏈霉素產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，主要干擾氨基酸的代謝酯酶系統(tǒng)，從而影響蛋白質(zhì)合成，抑制菌絲伸長和造成細(xì)胞顆?；?，作用位點(diǎn)在細(xì)胞30S核糖體亞單位的16S rRNA解碼區(qū)的A部位[13]。葉枯唑?qū)汆缍蝾悆?nèi)吸性殺菌劑，在細(xì)菌體內(nèi)對細(xì)胞代謝過程中的煙酰胺產(chǎn)生拮抗作用，抑制病菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成而不能進(jìn)行正常的代謝活動，作用機(jī)理是由于取代了輔酶Ⅰ（COI）中的煙酰胺而造成輔酶Ⅰ的合成和利用失調(diào)，最終影響了DNA和RNA的合成[14]。春雷霉素與葉枯唑作用位點(diǎn)不同，符合藥劑復(fù)配的基本原則。

春雷霉素與葉枯唑均低毒，兼具保護(hù)和治療作用，具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性，尤其是春雷霉素能被植物主動吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，具有優(yōu)良特性[15]，應(yīng)用前景廣闊。但是葉枯唑不穩(wěn)定，見光易分解，代謝產(chǎn)物有致畸作用和甲狀腺毒性，存在潛在風(fēng)險[16]。因此，選用葉枯唑及含有該成分的復(fù)配劑防治細(xì)菌病害時，應(yīng)控制施藥劑量并嚴(yán)格執(zhí)行安全間隔期制度。同時，提高葉枯唑穩(wěn)定性可作為未來研究的方向。

在自然條件下，由于藥劑對病害的作用效果還要受田間環(huán)境因素和其他害蟲發(fā)生情況等因素的影響，室內(nèi)測定結(jié)果與田間實(shí)際防治效果可能存在一定差異，本研究為田間實(shí)際防效提供了參考，田間防效還需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)一步驗(yàn)證。

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