利用重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ舶被丁酸的研究

張六六 毛連山

摘要[目的]構建一株高產(chǎn)L谷氨酸脫羧酶的重組枯芽孢桿菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH。[方法]以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為宿主細胞，將大腸桿菌脫羧酶基因（gadA）與其輔酶磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH）在質(zhì)粒pHT01上串聯(lián)表達，構建一株高產(chǎn)L谷氨酸脫羧酶的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH。[結果]帶有pdxH基因的重組菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH催化谷氨酸生成γ氨基丁酸（GABA）的效率明顯高于B.subtilis 168/pHT01gadA。催化反應24 h時，生成的GABA濃度達252 g/L，較對照菌株提高了61 g/L。進一步對重組菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH全細胞轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA的條件進行了優(yōu)化，其最優(yōu)條件：轉(zhuǎn)化緩沖液為pH 5.0的0.1 mol/L TrisHCl，轉(zhuǎn)化溫度40 ℃，激活劑為5 mmol/L Ca2+與5 mmol/L Mg2+。在上述最優(yōu)條件下，催化24 h生成的GABA濃度達327 g/L。[結論]所獲得的重組菌轉(zhuǎn)化效率較高，具有一定的工業(yè)化應用前景。

關鍵詞 枯草芽孢桿菌；L谷氨酸脫羧酶；磷酸吡哆醛的再生；L谷氨酸；γ氨基丁酸

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-171-03

Abstract[Objective]The aim was to construct a recombinant B.subtilis 168/pHT01gadApdxH for producing high yield of Lglutamate decarboxylase.[Method]The gadA and pdxH gene from E.coli was cloned to the plasmid pHT01， resulted in the two recombinant plasmids pHT01gadA and pHT01 gadApdxH， and then separately transformed to Bacillus subtilis 168.[Result]The recombinant B.subtilis 168/pHT01gadApdxH can produce 252 g/L γaminobutyric acid （GABA） after catalytic reaction 24 h， compared with the B.subtilis 168/pHT01gadA increased by about 61 g/L. The whole cell transformation glutamate to GABA conditions were optimized， and the optimum conditions were 0.1 mol/L TrisHCl pH 5.0 buffer， 40 ℃， 5 mmol/L Ca2+ and 5 mmol/L Mg2+. Under optimum conditions， the GABA concentration reached 327 g/L by the recombinant B.subtilis 168/pHT01gadApdxH.[Conclusion]The obtained recombinant bacteria has higher transformation efficiency， with a certain industrialization prospect.

Key words Bacillus subtilis； Lglutamate decarboxylase； Regeneration of pyridoxal phosphate； L glutamic acid； γ aminobutyric acid

γ氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，在日本和美國等國家已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品和畜牧行業(yè)中[1-2]。2009年9月27日，國家衛(wèi)生部第十二號公告已批準GABA為新資源食品，其相關保健制品也在國內(nèi)保健品市場上快速成長。目前，國內(nèi)GABA的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、分離提取法和生物發(fā)酵法?；瘜W法生產(chǎn)的GABA不能用于食品行業(yè)，而分離提取法生產(chǎn)GABA受到技術和原材料的限制，雖然可以小規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但價格一直高居不下，限制了其應用[3]。

發(fā)酵法生產(chǎn)GABA主要是通過谷氨酸脫羧酶對谷氨酸脫羧而生成，其轉(zhuǎn)化過程需要磷酸吡哆醛作為其輔酶。發(fā)酵法生產(chǎn)GABA的菌株主要有大腸桿菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、紅曲和霉葡萄汁酵母等[4-6]。乳酸菌、紅曲和霉葡萄汁酵母等野生菌株的轉(zhuǎn)化率均較低，雖然大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率較高，但生產(chǎn)過程抗生素的添加及后處理過程中內(nèi)毒素的出去限制了其應用。莫征杰等[7]嘗試運用安全的宿主細胞枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化GABA，但由于枯草芽孢桿菌中無磷酸吡哆醛的再生途徑使得轉(zhuǎn)化效率較低。

筆者采用枯草芽孢桿菌為宿主細胞，基于基因工程手段將大腸桿菌脫羧酶基因（gadA）與其輔酶磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH）在質(zhì)粒pHT01上串聯(lián)，構建重組菌枯草芽孢桿菌宿主菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH，通過增加輔酶磷酸吡哆醛的量而加強菌株對谷氨酸的轉(zhuǎn)化效率，并對其催化過程進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和主要試劑。

所構建的重組枯草芽孢桿菌為江蘇納克生物工程有限公司自主研發(fā)和構建的工程菌，枯草芽孢桿菌宿主菌Bacillus Subtillis 168、大腸桿菌DH5α、表達載體pHT01均由江蘇納克生物工程有限公司保藏。

細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI、XbaI和XmaI、T4連接酶、氨芐青霉素、氯霉素、IPTG、xgal、pUCmT載體等均購自上海生工生物工程有限公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。引物合成和重組質(zhì)粒的測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.2 培養(yǎng)基。①液體LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

②固體LB 培養(yǎng)基：在液體LB 中加入1.5%（W/V）的瓊脂粉。

③發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸銨2.5 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，磷酸氫二鉀1.0 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 重組枯草芽孢桿菌基因工程菌的構建。

1.2.1.1 大腸桿菌gadA和pdxH基因的克隆。

采用細菌基因組DNA提取試劑盒，提取大腸桿菌DH5α基因組DNA。以該基因組DNA為模板，P1（GGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA）和P2（TCTAGATTATCAGGTGTGTTTAAAGCTGT）為引物，PCR擴增gadA基因，以引物P3（TCTAGACCAATTAAAGGAGGAAGGATCAATGTCTGATAACGACGA AT TGCA）和P4（CCCGGGTTATCAGGGTGCAAGACGATCA）為引物擴增pdxH基因。利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒，純化PCR擴增產(chǎn)物gadA基因片段和pdxH基因片段。將純化PCR產(chǎn)物與pUCmT載體連接，連接反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。涂布藍白斑篩選平板，選取平板上的白色菌落，提取其中的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，篩選得到重組菌DH5α/pUCmTgadA和DH5α/pUCmTpdxH。提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.1.2 表達載體pHT01gadA和pHT01gadApdxH的構建。

采用BamHI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pUCmTgadA和pHT01，回收gadA基因片段和pHT01片段，T4連接酶連接回收的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選重組菌DH5α/pHT01gadA，送上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。

采用XbaI和XmaI雙酶切質(zhì)粒pUCmTpdxH和pHT01gadA，回收pdxH基因片段和pHT01gadA片段，T4連接酶連接回收的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選重組菌DH5α/pHT01gadApdxH，送上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。

1.2.1.3 枯草芽孢桿菌B.subtilis 168的轉(zhuǎn)化。

參照Zhang[8]的兩步法，將重組質(zhì)粒pHT01gadA和pHT01gadApdxH分別轉(zhuǎn)化B.subtilis 168。

1.2.1.4 工程菌B.subtilis/pHT01gadA和B.subtilis 168/pHT01gadApdxH的表達。

將工程菌B.subtilis/pHT01gadA、B.subtilis 168/pHT01gadApdxH和B.subtilis 168/pHT01分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min下振搖培養(yǎng)至對數(shù)中期，加入終濃度1 mmol/L IPTG誘導6 h，離心收集菌體，測定gadA的酶活。同時取等量的菌體進行工程菌的催化過程分析，考察B.subtilis/pHT01gadA和B.subtilis 168/pHT01gadApdxH催化性能的差異。

1.2.2 gadA酶活測定。

取0.5 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心5 min，去上清液，加0.2 mol/L的谷氨酸溶液（pH 4.6）10 mL，于37 ℃恒溫水浴中，200 r/min振蕩反應10 min后，立即沸水浴10 min終止反應，10 000 r/min離心5 min，收集上清液；取1.0 mL上清液于三角瓶中，加入39.0 mL蒸餾水，混勻，吸取1.0 mL于帶塞試管中，加入1 mL質(zhì)量分數(shù)6%的苯酚和0.4 mL次氯酸鈉（活性氯質(zhì)量分數(shù)≥5.2%），充分混勻，沸水浴10 min后冰水浴20 min，再加入3.1 mL蒸餾水，然后于630 nm處測定吸光度；制作GABA含量與吸光度的標準曲線，根據(jù)標準曲線和所測吸光度，計算酶活。酶活力單位定義：在反應液中，1 min催化底物生成1 μmol GABA所需的酶量為1個活力單位（U）。

1.2.3 重組枯草芽孢桿菌的催化過程優(yōu)化。

將重組菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min下培養(yǎng)24～30 h，至gadA酶活不再增加，8 000 r/min離心收集菌體備用。

1.2.3.1 催化反應體系緩沖液。

分別用pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的0.1 mol/L TrisHCl及0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮菌體至體積與離心前發(fā)酵液體積相等，考察其對谷氨酸轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.3.2 催化反應溫度。

將pH 7.0的0.1 mol/L TrisHCl催化反應體系分別在25、30、35、40、45 ℃下進行谷氨酸轉(zhuǎn)化試驗，考察其對谷氨酸轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.3.3 金屬離子。

在pH 7.0的0.1 mol/L TrisHCl催化反應體系中分別加入Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等離子，考察其對谷氨酸轉(zhuǎn)化的影響。