1株降解玉米秸稈放線菌的篩選

宋德強(qiáng) 張?chǎng)╂? 張玲 許婷 葛文雪 朱靜 王兆慧

摘要[目的]篩選出能夠降解玉米秸稈的微生物。[方法]以植物園土層下5 cm取得的腐殖質(zhì)土壤為樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，通過(guò)剛果紅染色法進(jìn)行初步篩選，濾紙崩解法進(jìn)行二次篩選；以玉米秸稈粉為唯一碳源，經(jīng)25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，測(cè)定纖維素酶活性；通過(guò)形態(tài)觀察對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。[結(jié)果]篩選出1株纖維素酶活性最大的菌株WZ16，濾紙酶活性為620 U，CMC酶活性為72 U，通過(guò)形態(tài)觀察初步鑒定WZ16為鏈霉菌屬放線菌。[結(jié)論]最終篩選得到1株有較高纖維素酶活性的鏈霉菌屬放線菌，為綜合利用玉米秸稈作為生物質(zhì)能源提供了參考。

關(guān)鍵詞 秸稈；纖維素水解；篩選；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）09-016-03

Abstract[Objective]To screen a strain of actinomycetes that can degrade corn stalk cellulose.[Method]Enrichment culture was carried out with 5 cm humus subsurface soil at botanical garden as the sample. Preliminary screening was carried out by Congo red staining. Secondary screening was conducted by paper disintegration method. With corn stalk powder as the only carbon source， shake cultivation was carried out at 25 ℃ under 180 r/min for 72 h. Cellulase activity was detected. Strains were preliminarily identified by morphological observation.[Result]A strain WZ16 with maximum cellulase activity was obtained. Filter paper enzyme activity was 620 U， CMC enzymes activity was 72 U. Morphologic observation showed that WZ16 was streptomyces actinomycetes.[Conclusion]A streptomyces actinomycetes with relatively high cellulase activity is finally obtained， which provides references for the comprehensive utilization of corn stalk as biomass energy.

Key words Straw； Cellulolysis； Screening； Identification

我國(guó)秸稈年產(chǎn)量達(dá)5.7×108 t，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%，是生物質(zhì)能源的重要組成部分[1-2]。如何充分利用這些資源，國(guó)外已有詳細(xì)研究[3]。但這種寶貴的資源在國(guó)內(nèi)尚未得到充分利用，大部分廢棄秸稈被就地焚燒，不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，威脅人類(lèi)健康，還會(huì)引起火災(zāi)，威脅飛機(jī)起降，影響車(chē)輛安全行駛。因此，國(guó)家有關(guān)部門(mén)做了大量工作，加大研究各種秸稈綜合利用技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外秸稈綜合利用主要有5個(gè)方面：秸稈肥料化利用；通過(guò)物理、化學(xué)及生物等方式將作物秸稈轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)畜牧飼料；秸稈沼氣、固化成型等將秸稈開(kāi)發(fā)為能源物質(zhì)；以秸稈為原料的加工業(yè)利用；秸稈基料的應(yīng)用[4-8]。其中，以秸稈還田、用作飼料和燃燒為主[9-10]。筆者篩選了能夠降解玉米秸稈的微生物，并對(duì)其所產(chǎn)生的酶活性進(jìn)行了測(cè)定，以期為綜合利用玉米秸稈作為生物質(zhì)能源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品。

腐殖質(zhì)土壤：南通大學(xué)植物園玉米地下5 cm的土壤。

玉米秸稈來(lái)自南通大學(xué)植物園。

1.1.2 培養(yǎng)基。

秸稈粉：2 mol/L NaOH 浸泡玉米秸稈12 h，蒸餾水洗至中性，干燥箱80 ℃過(guò)夜，粉碎后200目過(guò)篩[11]。

赫奇遜氏無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2左右[11]。

種子培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20000 g煮汁紗布過(guò)濾去殘?jiān)?，蔗?0.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，固體培養(yǎng)基加18.00 g瓊脂粉[12]。

CMCNa培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMCNa）10.00 g，馬鈴薯20000 g煮汁紗布過(guò)濾去殘?jiān)傊?8.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然[11]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：赫奇遜氏無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 1 000 mL，秸稈粉20.00 g[11]。

高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.00 g，KNO3 1.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO4 0.50 g，MgSO4 0.50 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，瓊脂20.00 g，水 1 000 mL，pH 7.2～74[12]。

1.1.3 試劑。

0.1%剛果紅，3，5二硝基水楊酸（DNS）顯色試劑，檸檬酸緩沖液[13]，1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng)。

1.2.1.1 富集。

將取得的樣品土壤和玉米秸稈混合，置于20 ℃左右培養(yǎng)，定時(shí)向土壤撒水以保持土壤的濕潤(rùn)。培養(yǎng)7 d左右，觀察秸稈是否長(zhǎng)出菌斑或菌絲，若無(wú)則繼續(xù)培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌斑或菌絲。

1.2.1.2 分離培養(yǎng)。

取出長(zhǎng)有菌斑或菌絲的秸稈，連同秸稈上附著的土壤一起放入裝有無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩30 min后靜置得到菌懸液。用無(wú)菌水稀釋?zhuān)?×10-3、1×10-4、1×10-5 這3個(gè)稀釋梯度溶液各0.2 mL，分別涂布于PDA平板，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。

觀察各個(gè)平板，挑出形態(tài)不同的菌株，用PDA平板分離純化得到單菌落并命名，斜面保種。

1.2.2 初篩。

將純化得到的單菌落分別接種于CMC平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。將剛果紅染料倒入平板中，為了便于觀察，可在染色前將霉菌菌絲刮去。 染色30 min后棄染液，用1 mol/L NaCl脫色1 h。棄去NaCl后觀察菌落透明圈大小，挑出具有明顯透明圈的菌落，測(cè)量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。

1.2.3 復(fù)篩。

在裝有50 mL赫奇遜氏無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的三角瓶中放入1 cm×5 cm的無(wú)菌濾紙，分別接入篩選得到的菌株（放線菌和霉菌孢子1×106個(gè)/mL、酵母菌1×109個(gè)/mL），25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每天觀察記錄濾紙崩解的情況，無(wú)變化記為（-），濾紙邊緣模糊記為（+），濾紙彎曲記為（++），濾紙變成碎片記為（+++），濾紙整體崩解，變成紙漿記為（++++）[11]。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)。

挑選出濾紙崩解較嚴(yán)重的菌株，以放線菌和霉菌1×106個(gè)/mL、酵母1×109個(gè)/mL接入發(fā)酵培養(yǎng)基（每250 mL錐形瓶接入100 mL），25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h。

1.2.5 酶活性測(cè)定。

1.2.5.1 制備粗酶液。

從發(fā)酵培養(yǎng)基中取樣用2層紗布過(guò)濾，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，所得上清液為粗酶液。

1.2.5.2 測(cè)定酶活性。

①葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

取6支試管，編號(hào)，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，蒸餾水1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL，向6支試管分別加入DNS試劑2.0 mL，沸水浴加熱5 min，冷卻后定容至120 mL，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

②濾紙酶活（FPase）的測(cè)定：

參見(jiàn)劉爽的方法[11]。③內(nèi)切酶活力（CMCase）的測(cè)定：

參見(jiàn)劉爽的方法[11]。

設(shè)定每小時(shí)1 mL酶液催化1 μg的葡萄糖為1個(gè)酶活單位。

1.2.6 菌株的初步鑒定。

分別用插片培養(yǎng)法接種菌株孢子于高氏I號(hào)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7 d。用鑷子取出蓋玻片，輕輕擦去外側(cè)下部沾有的培養(yǎng)基，將其帶有菌絲的面向下，輕放于載玻片中央，在顯微鏡下觀察自然生長(zhǎng)的菌株形態(tài)特征，及其基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的結(jié)構(gòu)和顏色。根據(jù)菌株的菌落特征、菌絲及孢子顯微攝影圖片對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集培養(yǎng)結(jié)果

共得到16種不同形態(tài)的菌株，分別命名為WZ1～WZ16。

2.2 初篩結(jié)果

用剛果紅染液對(duì)16種菌株進(jìn)行染色，挑出具有明顯透明圈的菌落，測(cè)量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。由表1可知，透明圈較大的4株菌透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）由大到小依次為WZ14、WZ12、WZ16、WZ15。

2.3 復(fù)篩結(jié)果

由表2可知，WZ15號(hào)菌株在初篩中D/d值最小，復(fù)篩中濾紙崩解情況最差，5 d濾紙條才碎裂成大塊，與另外3種菌株差距較大，WZ15被淘汰，而WZ12、WZ14、WZ16號(hào)菌株在復(fù)篩中結(jié)果相似，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵試驗(yàn)。

2.4 粗酶活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖1可知，葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=1.276 9x，R2為0.999 1，符合數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.2 纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果。

由圖2可知，各菌株濾紙酶活性大小順序是WZ16、WZ12、WZ14，CMC酶活性大小順序是WZ14、WZ12、WZ16。而初篩時(shí)該3株菌透明圈大小順序是WZ14、WZ12、WZ16。

濾紙酶活性測(cè)定法不但可排除外切β1，4葡聚糖苷酶的干擾，而且可測(cè)定到具有真正纖維素分解能力的 Cx（內(nèi)切β1，4葡聚糖酶）[14]。因此，以濾紙酶活性作為主要篩選標(biāo)準(zhǔn)，另外2種酶活性只作為參考。選出濾紙酶活性最大的菌株WZ16作為后續(xù)試驗(yàn)的菌株，并對(duì)其進(jìn)行菌種初步鑒定。

2.5 菌株初步鑒定結(jié)果

觀察菌株WZ16在固體平板上的形態(tài)特征，菌落較小、干燥、不透明，與培養(yǎng)基連接緊密，接種針不易挑取，表面有干粉狀孢子（圖3）。顯微鏡下觀察菌絲分為基質(zhì)菌絲、氣生菌絲及孢子絲，孢子絲螺旋狀排列（圖4），參照《放線菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定菌株WZ16為一株鏈霉菌屬放線菌。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)最終篩選得到1株有較高纖維素酶活性的鏈霉菌屬放線菌菌株WZ16，但比較其初篩與復(fù)篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)不完全一致，主要是由于剛果紅染色和濾紙崩解都是定性試驗(yàn)，只能找出具有降解纖維素能力的菌株，無(wú)法準(zhǔn)確地定量計(jì)算試驗(yàn)菌株降解纖維素的能力。只有測(cè)定試驗(yàn)菌的纖維素酶活才能確定其降解能力的大小。在試驗(yàn)中，經(jīng)計(jì)算WZ16的酶活最大，經(jīng)72 h培養(yǎng)后，濾紙酶活為620 U，CMC酶活為72 U，與灰略紅鏈霉菌 C5相比[15]，濾紙酶活高出12.7%，CMC酶活低91.8%，由此可見(jiàn)，WZ16濾紙酶活較高，但CMC酶活很低，這很可能影響降解秸稈的速度。對(duì)此，可采用復(fù)合菌系[16]，將幾種降解秸稈纖維素的菌株混合培養(yǎng)，利用它們對(duì)纖維素不同的降解能力產(chǎn)生不同種類(lèi)的纖維素酶，做到快速高效降解秸稈。

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