牛至油對尖孢鐮刀菌的超顯微結(jié)構(gòu)和侵染黃瓜植株體內(nèi)酶活力的影響

高磊

摘要[目的]探討天然植物提取物牛至油對黃瓜植株蔬菜致病真菌的抗菌作用及機(jī)制。[方法]利用透射電鏡觀察牛至油對尖孢鐮刀菌的超顯微結(jié)構(gòu)的影響，并根據(jù)4種酶不同的活性，采用不同的方法測定噴灑牛至油的黃瓜葉片內(nèi)4種酶活力。[結(jié)果]在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)牛至油處理后尖孢鐮刀菌絲體和分生孢子結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化。牛至油處理7～28 d 4種酶活性逐漸增大，28 d后酶的活性逐漸降低。[結(jié)論]牛至油具有促進(jìn)黃瓜植株體內(nèi)酶活性以及抑制植物病原菌生長的作用。

關(guān)鍵詞 牛至油；蔬菜；致病真菌；抑菌作用；酶活力

中圖分類號 S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-013-03

Abstract[Objective]To investigate the natural plant extracts oregano oil on the antibacterial effect of cucumber plant vegetables and mechanism of pathogenic fungi.[Method]Effects of oregano oil on the ultramicroscopic structure of Fusarium oxysporum were studied. According to four kinds of enzyme activities， different methods were used to determine the cucumber leaf spraying oregano oil in four kinds of enzyme activities.[Result]Observation under transmission electron microscope showed that mycelium and conidium structures of Fusarium oxysporum changed obviously. After treated by oregano oil for 7-28 d， the four kinds of enzyme activities gradually increased， and then decreased after 28 d.[Conclusion]Oregano oil promotes the in vivo enzyme activity of infected cucumber， and restricts the growth of plant pathogen.

Key words Oregano oil； Vegetables； Pathogenic fungi； Bacteriostatic action； Enzymatic activity

近些年，化學(xué)藥品的大量運(yùn)用給環(huán)境帶來很大的壓力，但是植物源農(nóng)藥有低毒、易降解、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，所以植物源農(nóng)藥對植物病害的研究已成為當(dāng)前農(nóng)藥研究與科學(xué)的熱點(diǎn)話題之一[1]。由于大多數(shù)植物提取物都具有抑菌作用，大量研究也表明植物提取物具有明顯的抗植物病原真菌、細(xì)菌和蟲害的作用。目前，國外已開發(fā)出許多植物源殺菌劑，國內(nèi)對植物源提取物對植物病原真菌的抑制作用方面的報道較多，但在植物源殺菌劑的開發(fā)應(yīng)用方面的報道較少[2]。筆者從植物體內(nèi)酶活力和真菌細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)2個方面研究牛至油對侵染植株的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品。

15 mol/L蛋氨酸（Met）緩沖液、0.1 mmol/L核黃素（VB2）溶液、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液、008%H2O2、pH 8.8的硼酸緩沖液、pH 6.8的磷酸緩沖液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.1 mol/L鄰苯三酚、0003 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、0.05 mol/L pH 5.5的醋酸、戊二醛、磷酸緩沖液、丙酮、醋酸異戊酯、氯化鈉、PDA培養(yǎng)基、005%Tween 80、pH 7.8的磷酸緩沖液、0.1 mol/L氮藍(lán)四唑（NBT）[3]。

1.1.2 主要儀器。

研缽、分光光度計(jì)、剪刀、水浴鍋、離心機(jī)、試管、離心管、YX280手提式壓力蒸氣滅菌鍋、超凈工作臺、GHP9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱、血球計(jì)數(shù)板等。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌的電鏡觀察。

制備含3.125 mg/L牛至油的培養(yǎng)基下培養(yǎng)96 h的尖孢鐮刀菌菌塊數(shù)塊，用3%的戊二醛在室溫下固定4～6 h，磷酸緩沖液（pH 6.8）沖洗數(shù)次，每次間隔30 min，然后經(jīng)過一系列丙酮脫水，每次30 min，其中100%丙酮脫水3次，純醋酸異戊酯置換2次，每次30 min，CO2臨界點(diǎn)干燥、黏樣、鍍膜后，在掃描電鏡下觀察其超顯微結(jié)構(gòu)[4-5]。

1.2.2 4種酶活性的測定。

3株噴灑過牛至油的黃瓜，從噴灑藥物后的第1天起，每7 d噴灑1次藥物溶液，取1次材料，共取6次，每次取材的部位都要相近，將取回的材料帶回實(shí)驗(yàn)室，備用；然后，再選幾棵未感病的植株和感病的植株，分別取一定量的葉片作為試驗(yàn)材料，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

4種酶反應(yīng)體系及其吸收峰如表1所示。取0.29 g葉片在冰浴條件下分別提取4種酶的粗提液，分別取4種酶的反應(yīng)體系和對照組在分光光度計(jì)下測定吸光度[3，6-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至油對尖孢鐮刀菌超顯微結(jié)構(gòu)的影響[11]

從圖1可以看出，對照組中可以看到大小型分生孢子結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁均勻完整，顏色較深；厚垣孢子呈較大的球形；菌絲和孢子切面的細(xì)胞壁完整，厚薄均勻，質(zhì)地致密，細(xì)胞基質(zhì)也均勻（圖1A）。處理組，可以看到菌絲形態(tài)完全改變，多數(shù)菌絲干癟，細(xì)胞壁變薄，菌體表面皺褶消失，大部分菌絲己無正常結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)多處破壞和斷裂，菌體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)容物流失，大小分生孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜嚴(yán)重破壞，細(xì)胞壁剝脫和破裂，細(xì)胞膜大部分消失；厚垣孢子明顯縮小，細(xì)胞壁變?。▓D1a）[4-5，11-14]。

從圖1可以看出，在分生孢子放大圖中，對照組大小分生孢子細(xì)胞壁完整，厚薄均勻，質(zhì)地致密，顏色深；小型分生孢子呈單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔，清晰可見（圖1B）。在處理組中，可以看到細(xì)胞壁邊緣模糊，細(xì)胞器明顯減少，大部分溶解消失，在細(xì)胞內(nèi)可見較大的空泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞基質(zhì)變淡，可能由于胞內(nèi)原生質(zhì)大量外泄，外部物質(zhì)也滲進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，形成較大且大量的空腔，基本不能清楚觀察到分生孢子的結(jié)構(gòu)（圖1b）。

從圖1可以看出，厚垣孢子放大后，對照組細(xì)胞密度較大，細(xì)胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)清晰可見細(xì)胞核、囊泡和脂滴，并分布在細(xì)胞膜附近（圖1C）；在處理組中，由于藥物的作用，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變薄，不均勻，出現(xiàn)分層破裂，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的液泡，且呈彌散性分布，顏色變淺，說明細(xì)胞膜破壞，大量的細(xì)胞外物質(zhì)進(jìn)入（圖1c）。由于藥物為脂溶性，可溶解細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜的部分破壞，細(xì)胞內(nèi)容物流出，大量的胞外物質(zhì)進(jìn)入，導(dǎo)致細(xì)胞顏色變淺，出現(xiàn)液泡數(shù)量增加、變大。

2.2 牛至油對侵染黃瓜植株體內(nèi)酶活力的影響 由于黃瓜植株本身就具有一定的抗病性，所以感病植株體內(nèi)酶活力高于無病植株的酶活力。從圖2～5可以看出，在感病的黃瓜植株上噴灑牛至油后，黃瓜植株體在牛至油的誘導(dǎo)下酶的活性顯著增加，28 d酶的活性達(dá)到最大值，此后酶的活力逐漸降低[15-16]。

3 結(jié)論

該研究結(jié)果表明，牛至油處理后4～28 d 4種酶活性逐漸增大，28 d后酶的活性逐漸降低。噴灑牛至油溶液的黃瓜植株體內(nèi)酶的OD值迅速升高，明顯高于患灰霉病植株體內(nèi)的酶的OD值，更高于正常植株的酶的OD值。

牛至油作用于尖孢鐮刀菌后，在透射電鏡下觀察表明尖孢鐮刀菌菌絲體和分生孢子結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化。厚垣孢子明顯縮小，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞壁邊緣模糊，細(xì)胞器明顯減少，大部分溶解消失，在細(xì)胞內(nèi)可見較大的空泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞基質(zhì)變淡。這可能是因?yàn)榘麅?nèi)原生質(zhì)大量外泄，外部物質(zhì)也滲進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，形成比較大且多的空腔。 究其原因，牛至油會導(dǎo)致尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)完全改變，多數(shù)菌絲干癟細(xì)胞壁變薄，菌體表面皺褶消失，并出現(xiàn)多處破壞和斷裂，菌體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)容物消失，大小分生孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜嚴(yán)重破壞，細(xì)胞壁剝脫和破壞，細(xì)胞膜大部分消失，大量的胞外物質(zhì)進(jìn)入，導(dǎo)致細(xì)胞顏色變淺，出現(xiàn)液泡數(shù)量增加、變大。

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