二氧化硅/殼聚糖大孔復合材料固定化漆酶及其對2,4-二氯苯酚的降解

劉曉貞, 李 云, 梁云霄, 張瑞豐

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二氧化硅/殼聚糖大孔復合材料固定化漆酶及其對2,4-二氯苯酚的降解

劉曉貞, 李 云, 梁云霄, 張瑞豐

(寧波大學 材料科學與化學工程學院, 浙江 寧波 315211)

通過殼聚糖在塊體SiO2大孔材料孔壁上的吸附，制備二氧化硅/殼聚糖大孔復合材料(SiO2/CS)，經(jīng)戊二醛交聯(lián)后用于固定諾維信工業(yè)漆酶。優(yōu)化漆酶固定化的實驗條件并對比了游離漆酶和固定化漆酶的酶學性質(zhì)。實驗結(jié)果表明：在pH值為4.5、漆酶初始濃度為40 mg×mL-1的條件下，固定化4 h效果最佳，固定化酶酶活回收率為85.5%；相對于游離漆酶，固定化漆酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均得到明顯提高，且具有良好的操作穩(wěn)定性。應用固定化漆酶去除2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)，研究了降解時間、pH、溫度和2,4-DCP初始濃度對其去除率的影響。在優(yōu)化條件下，固定化漆酶對2,4-DCP×L-1)的去除率為83.2%，固定化漆酶可重復使用，并且便于從反應體系中分離出來。

SiO2大孔材料；殼聚糖；固定化；漆酶；2,4-二氯苯酚

1 前 言

含酚廢水的污染已經(jīng)成為全球性的問題，然而，傳統(tǒng)方法對含酚廢水的處理效果差，去除率低[1]。[2]，能催化氧化酚類化合物、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等難降解有機污染物，為水體中有機污染物的治理和修復提供了一種有效途徑。與其它方法相比，漆酶催化氧化法能耗低、易操作、降解效率高、使用范圍寬，是一項前景廣闊的生物處理技術(shù)[3~5]。

純漆酶生產(chǎn)成本高、易溶于水、難以回收且不穩(wěn)定，在實際應用中有一定的局限性。通過對漆酶固定化，可以提高其重復利用率、穩(wěn)定性并降低酶催化成本。漆酶固定化的關(guān)鍵在于所選擇的載體，它對漆酶的活性和對環(huán)境的耐受性等方面有著決定性的作用。近年來國內(nèi)外學者對漆酶的固定化進行了較為廣泛的研究，常用載體主要有納米材料、介孔材料、殼聚糖、硅膠、親水性微濾膜等[6~9]。納米材料和介孔材料具有比表面積大、酶的固載量高等優(yōu)點，但納米材料不易從反應體系中分離和回收[8]，而介孔材料在酶的固定化及固定化酶催化底物反應過程中常存在傳質(zhì)阻力，甚至孔徑較小時酶只能固定在載體表面[9]。相對于介孔材料，大孔材料由于具有較大的孔徑從而減小了酶固定過程中的傳質(zhì)阻力，而且大孔材料更易于引入功能化基團[10]。Li等[11]研究聚苯乙烯微球孔徑大小對脂肪酶固定的影響時發(fā)現(xiàn)，當載體的孔徑遠遠大于脂肪酶分子尺寸時，固定化脂肪酶表現(xiàn)出更高的活性。

殼聚糖分子中含有大量的氨基和羥基，具有較強的吸附絡合能力、生物相容性好，且易于成膜、無毒無害，但作為酶的固定化載體單獨使用時存在吸附容量小、吸濕性強、機械性能差等缺點[12~14]。Kalkan[15]等研究表明由殼聚糖和無機材料組成的復合材料是一種良好的載體，可改善殼聚糖單獨作載體的不足，并很好地保持酶的活性。

本課題組在前期工作中制備了一種由SiO2納米薄膜構(gòu)筑的新型大孔材料，該大孔材料具有三維連續(xù)貫通的孔道、比表面積可達130 m2×g-1、孔隙率93%[16,17]。本文通過在SiO2大孔材料孔壁表面吸附殼聚糖并用戊二醛交聯(lián)，制備了二氧化硅/殼聚糖(SiO2/CS)復合大孔材料，以SiO2/CS為載體，系統(tǒng)研究漆酶固定化的條件，對比游離漆酶和固定化漆酶的相關(guān)性質(zhì)；并研究固定化漆酶對2,4-DCP的催化降解作用，考察降解時間、pH值、溫度、2,4-DCP的初始濃度對降解效果的影響。

2 實驗材料和方法

2.1 試劑

諾維信單麗來漆酶(活性約為40 U×g-1)，工業(yè)級，廣州市海諾生物工程有限公司；殼聚糖，AR，脫乙酰度為95%，上海阿拉丁試劑有限公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，BS，西安熱默爾生物科技有限公司；2,4-二氯苯酚，AR，上海阿拉丁試劑有限公司；戊二醛和4-氨基安替比林，AR，國藥集團化學試劑有限公司；鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，AR，天津博迪化工股份有限公司。

2.2 儀器

傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，PEOTEGE460 E.S.P型，美國Nicolet公司；掃描電鏡(SEM)，SU70型，美國AMETEK公司；能譜儀(EDX)，EDAX型，美國AMETEK公司；紫外可見分光光度計，T6新世紀型，北京普析通用。

2.3 SiO2/CS的制備

以具有三維骨架結(jié)構(gòu)的環(huán)氧樹脂大孔聚合物為整體型模板，利用硅酸酯原位水解和高溫燒結(jié)制備尺寸為0.3~0.4 cm的塊狀SiO2大孔材料[17]。

用2% 的乙酸溶液配制質(zhì)量濃度為1% 的殼聚糖溶液。稱取1 g塊狀SiO2大孔材料于80℃下干燥2 h，置于含殼聚糖溶液的磨口錐形瓶中，在25℃、轉(zhuǎn)速為50 r×min-1的搖床中振蕩6 h、濾出，將大孔材料在50℃真空干燥2 h。將上述干燥后的大孔材料浸入戊二醛質(zhì)量濃度為0.1% 的溶液中振蕩反應6 h，濾出大孔材料、用蒸餾水反復沖洗、真空干燥，即得二氧化硅/殼聚糖塊體大孔復合材料(SiO2/CS)。殼聚糖的吸附量用稱重法確定。

2.4 漆酶的固定化

取0.1 g SiO2/CS置于10 mL用PBS緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在25℃、轉(zhuǎn)速為50 r×min-1的搖床中振蕩一定時間，將大孔材料濾出后，用緩沖溶液洗滌至上清液中檢測不到酶活。

2.5 酶活的測定

用分光光度法，以ABTS為底物測定漆酶的活性。定義每分鐘使1μmol的ABTS 氧化所需的酶量為一個酶活單位。游離漆酶酶活的測定：取定量稀釋后的酶液和1.0 mmol×L-1ABTS進行等體積反應，所用介質(zhì)均為適當pH值的緩沖溶液。測定反應體系3 min內(nèi)在420 nm處的吸光度變化。固定化漆酶酶活的測定：取0.1 g固定化漆酶，加2 mL相應pH 值的緩沖液和1 mL濃度為1.0 mmol×L-1ABTS溶液，反應3 min，測上清液在420 nm處的吸光度變化。比酶活用每克固定化漆酶的酶活(U×g-1) 表示。為便于考察變量對酶固定化條件以及固定化酶性質(zhì)的影響，以同組實驗中酶活最高值或處理前的酶活性為100%進行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)固定化酶與固定化前總游離酶的活性比計算固定化酶的活性回收率。

2.6 固定化漆酶對2,4-DCP的降解

稱取0.1 g固定化漆酶置于50 mL用PBS緩沖溶液配制的2,4-DCP溶液中，在一定溫度下，轉(zhuǎn)速為50 r×min-1的搖床中反應一定時間，將固定化漆酶濾出后，檢測2,4-DCP的濃度，計算去除率。用0.1 g 經(jīng)滅活后的固定化漆酶在相同條件下重復上述實驗，測定2,4-DCP的濃度，計算載體對2,4-DCP的吸附率。

2.6.1 去除率、吸附率和降解率的計算

2,4-DCP的去除率、吸附率及降解率的計算公式如下：

式中，0為2,4-DCP的初始濃度，1為固定化漆酶去除2,4-DCP后的剩余濃度，2為載體吸附2,4-DCP后剩余的濃度。

2.6.2 2,4-DCP濃度的測定

采用分光光度法對2,4-DCP的濃度進行測定。在pH = 10±0.2的反應體系中，酚類化合物在鐵氰化鉀存在的情況下與4-氨基安替比林反應生成橙紅色的吲哚酚安替比林染料，該染料的水溶液在510 nm 處有最大吸收波長。

固定化漆酶降解2,4-DCP一定時間后，將固定化漆酶濾出，用0.5 mol×L-1的NH3·H2O溶液將2,4-DCP溶液的pH調(diào)節(jié)至10±0.2，然后依次加入1 mL 80 g×L-1的鐵氰化鉀溶液和1 mL 2% 的4-氨基安替比林溶液，混合均勻后反應15 min，以蒸餾水作為參比液，紫外-可見分光光度計測定510 nm處的吸光度值?？鄢瞻字担嬎?,4-DCP的去除率。

3 結(jié)果和討論

3.1 SiO2/CS復合大孔材料的表征

3.1.1 掃描電鏡

圖1為SiO2大孔材料(a)和SiO2/CS復合大孔材料(b)的掃描電鏡圖。從圖中可以看出SiO2大孔材料具有三維連續(xù)的超薄膜結(jié)構(gòu)，在孔徑為300~500 nm和1~2 μm有兩套連續(xù)貫通的孔道。對比圖1(a)和圖1(b)，可以發(fā)現(xiàn)負載殼聚糖的大孔復合材料，孔道仍然相互貫通，保持了原有的骨架結(jié)構(gòu)，不存在殼聚糖堵塞孔道現(xiàn)象。

3.1.2 能譜(EDX)分析

EDX分析SiO2和SiO2/CS復合大孔材料所含元素的結(jié)果如圖2。由圖2a可知，對于SiO2大孔材料，只檢測到O和Si元素的存在。圖2b和2c是隨機檢測SiO2/CS表面和內(nèi)部的元素譜圖，均檢測到C和N元素的存在，從圖中可以看出，SiO2/CS表面和內(nèi)部的C、N元素含量百分比相近。通過稱重法測得SiO2大孔材料吸附殼聚糖后質(zhì)量增加約為5%，結(jié)合掃描電鏡分析可知，殼聚糖均勻地負載在SiO2大孔材料的孔壁上。

3.1.3 FT-IR表征

圖3為SiO2大孔材料負載殼聚糖前后的紅外光譜。圖3(a)中3446 cm-1出現(xiàn)的寬峰為大孔SiO2表面硅羥基的吸收峰，1639 cm-1處出現(xiàn)的微弱的峰為大孔SiO2的自由吸附水H-O-H彎曲伸縮振動峰，1090 cm-1處為Si-O-Si的反對稱伸縮振動，804和466 cm-1處為Si-O的對稱伸縮振動。負載殼聚糖后(圖3(b))，3446 cm-1處出現(xiàn)的峰變強，這是SiO2大孔材料表面硅羥基的伸縮振動吸收峰與殼聚糖的-NH2的疊加效果；2920 cm-1出現(xiàn)較弱的峰為亞甲基的吸收峰；殼聚糖酰胺I帶吸收峰和SiO2上硅羥基的彎曲振動吸收峰重合，導致1639 cm-1出的吸收峰變強。分析表明，殼聚糖已成功引入到SiO2大孔材料中，形成了SiO2/CS復合材料。

3.2 漆酶固定化條件的優(yōu)化

3.2.1 固定化時間的選擇

固定化酶的酶活隨固定化時間的變化曲線如圖4所示，隨著漆酶在SiO2/CS載體上固定化時間的增加，相對酶活先呈上升趨勢，當固定化時間達到4 h時，相對酶活達到最大，繼續(xù)延長固定化時間酶活不再升高，反而略有下降，可能是酶在該固定化環(huán)境中隨著時間的延長失活比例增高[18]，所以固定化時間增加，酶活卻不增加。

3.2.2 pH對漆酶固定化的影響

固定化過程中，溶液的pH值影響著載體和漆酶的離子化狀態(tài)，從而影響著載體與酶的結(jié)合程度，造成固定化酶活力的差別。這是因為載體與漆酶之間具有一定的靜電作用，溶液的酸堿性影響載體帶電基團的電性，也對漆酶所帶電荷有一定影響。同時酶作為一種蛋白質(zhì)，當溶液的pH值超過一定范圍時，微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，引起酶的失活。從圖5可見，固定漆酶的最佳pH值為4.5，制得的固定化酶的活力最大。

3.2.3 初始酶濃度對漆酶固定化的影響

漆酶初始濃度對固定化酶活性的影響如圖6所示，隨著酶液濃度的增大，活性先逐漸增加；當酶初始濃度為40 mg×mL-1時，固定化酶達到最大活力136.8 U×g-1；但酶濃度超過40 mg×mL-1后，酶活性開始降低。酶液濃度增大，載體結(jié)合酶蛋白的總量增加，比活力增加，但酶的結(jié)合量繼續(xù)增大時，造成酶分子擁擠，并非每個酶分子都有機會與底物結(jié)合，整體表現(xiàn)為固定化酶活性呈下降趨勢，這與用納米SiO2改性殼聚糖載體固定化酶的情況類似[19]。當固定化酶達到最大酶活力時，酶活回收率為85.5%，高于一些用純漆酶制備的固定化酶的酶活回收率[20]。

3.3 酶學性質(zhì)

3.3.1 pH穩(wěn)定性

在不同pH的PBS緩沖溶液中保存2 h后測定游離漆酶和固定化漆酶的酶活，結(jié)果如圖7所示，漆酶在偏酸性的條件下放置較穩(wěn)定，隨著pH 值的升高，酶的活性受到了極大的抑制，而固定化后漆酶的相對活性遠高于游離酶。由于固定化酶載體孔道內(nèi)部的微環(huán)境與外部環(huán)境存在一定的差異，對孔道內(nèi)的pH起到了緩沖作用，與游離酶相比，固定化酶的pH穩(wěn)定性要高。

3.3.2 熱穩(wěn)定性

將固定化漆酶和游離漆酶置于不同溫度下保溫2 h測定它們的酶活，如圖8所示，固定化漆酶的熱穩(wěn)定性遠遠優(yōu)于游離漆酶的熱穩(wěn)定性。在20~60℃，固定化漆酶表現(xiàn)出較高的相對酶活。這說明漆酶通過吸附作用固定在SiO2/CS復合材料上，漆酶分子結(jié)構(gòu)剛性增強，構(gòu)象發(fā)生變化不易被破壞，導致游離漆酶和固定化漆酶對溫度的敏感性不一樣。

3.3.3 操作穩(wěn)定性

固定化漆酶與ABTS在室溫下連續(xù)反應10批次的結(jié)果如圖9所示。經(jīng)過7批次反應后，固定化漆酶活性變化較小，循環(huán)操作10批次后，固定化漆酶的剩余酶活還能保持在68.4%，說明漆酶經(jīng)固定化具有良好的操作穩(wěn)定性，優(yōu)于漆酶固定在聚超細纖維上(10批次后剩余酶活為50%)[21]。

3.3.4m值

米氏常數(shù)m是酶的特征性常數(shù)，其值等于酶促反應的速度達到最大反應速度一半時酶的濃度，只與酶的性質(zhì)、酶促反應的底物以及反應條件有關(guān)，是衡量底物與酶之間親和力大小的依據(jù)[22]。配置濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol×L-1的ABTS溶液，0.1 g固定化漆酶和1 mL游離漆酶在PBS緩沖體系中分別與ABTS反應5 min，測定420 nm處吸光度變化值，計算酶促反應的初速度，由Lineweaver?Burk雙倒數(shù)法處理得圖10。通過計算求得游離漆酶的m為0.370 mmol×L-1，固定化漆酶的m值為0.699 mmol×L-1。漆酶固定化后米氏常數(shù)變大，表明漆酶與底物間的親和力降低，這是因為漆酶被固定化后，空間位阻增大，底物與漆酶活性中心的接觸幾率變小[23]。

3.4 固定化漆酶降解2,4-DCP

3.4.1 pH對2,4-DCP去除效果的影響

分別將0.1 g固定化漆酶置于50 mL不同pH值、初始濃度為20 mg×L-1的2,4-DCP溶液中，在30℃下反應6 h。pH對2,4-DCP去除效率如圖11所示，固定化漆酶對2,4-DCP的去除率隨pH的增加呈先上升后下降的趨勢，在pH為3時，去除率達到最大，為63.1%，此時，降解率為45.5%。對比固定化漆酶的酶學性質(zhì)，底物為ABTS時固定化漆酶的最適合pH值也為3。

3.4.2 降解時間對2,4-DCP去除效果的影響

固定化漆酶對2,4-DCP的去除率、降解率以及載體對2,4-DCP的吸附率隨時間的變化如圖12所示。由圖可知，在0~8 h，固定化漆酶對2,4-DCP的去除率線性上升，溶液中2,4-DCP濃度迅速降低，8~10 h，降解速率減緩，這是由于在固定化漆酶對2,4-DCP降解的過程中，底物濃度減少導致降解速率減緩，降解產(chǎn)物的積累也會使2,4-DCP的氧化受到抑制[24]。反應8 h后，固定化漆酶對2,4-DCP的降解率達61.5%，此時去除率為80.3%，其中吸附率為18.8%。

3.4.3 初始濃度對2,4-DCP去除效果的影響

如圖13所示，固定化漆酶對2,4-DCP的去除率和載體對2,4-DCP的吸附率均隨濃度的增大而減小，可能是隨著底物濃度的增大，固定化漆酶催化氧化2,4-DCP時，生成的中間產(chǎn)物逐漸增多并造成累積[25]，固定化漆酶部分失活，降解率下降；還可能是2,4-DCP濃度的增大，會對固定化酶產(chǎn)生較大的毒性使部分漆酶失活[26,27]。由圖可知，固定化漆酶去除初始濃度為50 mg×L-12,4-DCP，降解率為26.5%，此時，去除率和吸附率分別為33.1% 和6.6%。

3.4.4 溫度對2,4-DCP去除效果的影響

溫度對固定化漆酶去除2,4-DCP(50 mL、20 mg×L-1)的影響如圖14所示，在30~50℃，固定化漆酶對2,4-DCP的去除率呈上升趨勢。在溫度為50℃時，去除率和降解率達到最大值，分別為83.2% 和65.6%。由圖14可知，固定化漆酶對2,4-DCP催化氧化反應可以在較寬的溫度范圍內(nèi)進行，這是因為漆酶被固定化之后，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溫度的變化對固定化漆酶影響變?nèi)鮗28]。盡管高溫會使漆酶活性變高，但是長時間在高溫下，會導致酶蛋白變性失活，因此固定化漆酶去除2,4-DCP的最佳溫度為50℃。

3.4.5 重復使用性

稱取0.1 g固定化漆酶，置于50 mL、pH為3的20 mg×L-1的2,4-DCP溶液中，在轉(zhuǎn)速為50 r×min-1的搖床上，30℃下反應8 h后，濾出固定化漆酶，測定溶液的吸光度。固定化漆酶用緩沖溶液多次洗滌后，重復上述操作，循環(huán)6次。如圖15所示，隨著反應批次的增加，固定化漆酶對2,4-DCP的去除率、降解率和載體對2,4-DCP的吸附率均下降。反應6次后，去除率由79.3% 降到36.8%，降解率由61.1% 降到29.4%。Nelson[29]等研究發(fā)現(xiàn)固定化漆酶降解廢水中的酚類污染物時，使用效率主要受到兩方面的影響，一是反應過程中有色產(chǎn)物吸附在載體表面，二是漆酶催化氧化酚類化合物產(chǎn)生不溶物。氧化產(chǎn)物吸附在固定化載體表面阻止了載體和酶分子與氯酚分子的進一步接觸，造成在反復使用過程中降解率和吸附率的下降。

4 結(jié) 論

以具有三維超薄膜結(jié)構(gòu)的塊體SiO2大孔材料作為基質(zhì)，通過殼聚糖在其孔壁上的吸附，制備了SiO2/CS大孔復合材料，采用物理吸附法將其用于固定化漆酶，系統(tǒng)研究了固定化條件，對比了固定化漆酶和游離漆酶的酶學性質(zhì)，并將固定化酶應用于降解水中的2,4-DCP。研究結(jié)果表明：漆酶固定化后，耐酸堿性和熱穩(wěn)定性都得到明顯提高；應用塊體大孔材料固定化酶克服了使用微納米材料不易從反應體系中分離出來的缺點，同時，由于孔徑大降低了傳質(zhì)阻力，提高了固定化酶的使用效率，使其在降解有機污染物方面有良好的應用前景。在后續(xù)工作中我們將通過合理修飾該塊體SiO2大孔材料，采用共價結(jié)合法或離子親和法進一步提高固定化漆酶的比酶活和操作穩(wěn)定性。

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Laccase Immobilization with Silica/Chitosan Macroporous Composites and itsin 2,4-Dichlorophenol Degradation

LIU Xiao-zhen, LI Yun, LIANG Yun-xiao, ZHANG Rui-feng

(Faculty of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

A new macroporous silica/chitosan (SiO2/CS) composite was prepared by adsorbing CS on pore wall of a large-sized macroporous silica, and it was employed as the support for the immobilization of commercial Novozymes laccase by using glutaraldehyde as the crosslinking agent. The best activity recovery of the immobilized laccase is 85.5% under conditions of buffer solution pH 4.5, initial laccase concentration 40 mg×mL-1and immobilizing time of 4 h. The pH and thermal stabilities of the immobilized laccase are significantly improved comparing to free laccase. Moreover, the immobilized laccase has good operational stability.was used to remove 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP), and the effects of degradation time, pH value, temperature and initial concentration of 2,4-DCP onremoval rate were investigated. Up to 83.2% of 2,4-DCP (20 mg×L-1) was removed under optimized conditions. The immobilized laccase has good reusability and can be easily recovered from the reaction system.

macroporous silica; chitosan; immobilized; laccase; 2,4-dichlorophenol

1003-9015(2016)01-0201-09

Q814.2

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.01.030

2015-01-16；

2015-05-04。

浙江省自然科學基金(LY12B01004)；寧波市社會發(fā)展項目(2011C50052)；寧波大學王寬城基金(XKL072)。

劉曉貞(1989-)，女，內(nèi)蒙古四子王旗人，寧波大學碩士生。通訊聯(lián)系人：梁云霄，E-mail：liangyunxiao@nbu.edu.cn