新型溫敏性中空纖維膜的制備與表征

莊美玲，劉天慶，宋克東，王樹(shù)萍

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新型溫敏性中空纖維膜的制備與表征

莊美玲，劉天慶，宋克東，王樹(shù)萍

（大連理工大學(xué)化工與環(huán)境生命學(xué)部干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧大連 116024）

采用自由基聚合方法對(duì)中空纖維膜（hollow fiber membranes, HFMs）進(jìn)行了-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）的接枝聚合，制備了一系列PNIPAAm--HFMs，同時(shí)考察了成纖維細(xì)胞在PNIPAAm--HFMs表面的培養(yǎng)與降溫脫附情況。傅里葉紅外光譜和元素分析結(jié)果表明PNIPAAm成功地在中空纖維膜上接枝聚合。動(dòng)態(tài)接觸角分析結(jié)果顯示，當(dāng)溫度降至LCST以下，PNIPAAm--HFMs表面接觸角明顯降低；蛋白黏附測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了當(dāng)溫度發(fā)生改變時(shí)，PNIPAAm--HFMs表面呈現(xiàn)親疏水性質(zhì)變化，即具有溫敏性。37℃時(shí)，成纖維細(xì)胞在HFMs-0.005, HFMs-0.01和HFMs-0.05表面均能正常黏附、鋪展與增殖；而HFMs-0.2不適宜細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)。降溫孵育后，黏附于PNIPAAm--HFMs表面的細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化并從其表面發(fā)生脫附，細(xì)胞脫附率高達(dá)90%以上。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PNIPAAm--HFMs具有良好的溫敏性，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的降溫脫附，可與生物反應(yīng)器相結(jié)合用于貼壁型細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增與降溫收獲。

聚-異丙基丙烯酰胺；中空纖維膜；接枝聚合；溫敏性；細(xì)胞脫附

引 言

組織工程和細(xì)胞移植等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域需要大量的種子細(xì)胞（109～1011）[1-2]，但是來(lái)源于人或者動(dòng)物組織或體液中的原始種子細(xì)胞數(shù)量不足，因此體外擴(kuò)增并收獲大量保持生物學(xué)特性的種子細(xì)胞對(duì)再生醫(yī)學(xué)具有重要的意義。由于具有較大的比表面積，中空纖維膜（hollow fiber membranes，HFMs）可為細(xì)胞黏附提供較大的面積，因此其常與生物反應(yīng)器相結(jié)合用于體外細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)與擴(kuò)增[3-4]。然而對(duì)于貼壁型細(xì)胞而言，如何有效并快速地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的收獲是一個(gè)重要的問(wèn)題。胰酶消化法是目前最常用的細(xì)胞收獲方法。胰酶消化是通過(guò)選擇性水解蛋白質(zhì)肽鏈的方式切斷貼壁細(xì)胞與培養(yǎng)基底之間的連接從而使細(xì)胞脫附[5]。該方法不僅會(huì)破壞細(xì)胞間的連接蛋白導(dǎo)致細(xì)胞的各自解離，更會(huì)切斷整聯(lián)蛋白與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白之間的連接，導(dǎo)致細(xì)胞膜蛋白的損傷，進(jìn)而破壞了細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞功能的損失[6-7]。

溫敏性材料聚-異丙基丙烯酰胺[poly(-isopropylacrylamide)，PNIPAAm]的研發(fā)為上述問(wèn)題的解決提供了新思路。1990年，日本東京女子醫(yī)科大學(xué)的Okano等[8]首次利用PNIPAAm制備了溫敏表面，用于細(xì)胞的培養(yǎng)與降溫非損傷性收獲。PNIPAAm及其衍生物水溶液會(huì)隨溫度的改變發(fā)生可逆的相轉(zhuǎn)變過(guò)程，發(fā)生相轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度為最低臨界溶解溫度（LCST，一般在32℃左右）。以PNIPAAm為主的溫敏表面可根據(jù)溫度的改變呈現(xiàn)完全不同的構(gòu)型和表面潤(rùn)濕性；在37℃時(shí)，溫敏表面呈弱疏水性，適于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)；當(dāng)溫度低于LCST時(shí)，表面呈親水性并發(fā)生溶脹，從而使細(xì)胞脫附。此后大量的研究結(jié)果均表明以PNIPAAm為主體的溫敏表面可以有效地替代傳統(tǒng)酶解法進(jìn)行細(xì)胞的回收[9-11]。

關(guān)于溫敏性中空纖維膜的制備并用于細(xì)胞培養(yǎng)與收獲目前尚鮮有報(bào)道。Wang 等[12]采用過(guò)硫酸鉀作為引發(fā)劑，在經(jīng)過(guò)堿處理的PVDF中空纖維膜表面進(jìn)行PNIPAAm的聚合修飾，制備了溫敏性中空纖維膜。純水動(dòng)態(tài)流量實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)PNIPAAm的接枝率為11%和36%時(shí)，該膜的純水通量隨溫度發(fā)生改變，即當(dāng)純水溫度低于PNIPAAm的LCST（約33℃），膜表面的PNIPAAm修飾層處于溶脹狀態(tài)，導(dǎo)致PVDF中空纖維膜表面的孔被封閉，因而純水的通量較低，當(dāng)溫度高于PNIPAAm的LCST時(shí)，PNIPAAm修飾層發(fā)生皺縮，膜表面的孔被釋放，因而純水的通量升高；此外他們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)該溫敏性PVDF膜在低溫時(shí)具有很好的抗蛋白質(zhì)污染性。然而，該研究的應(yīng)用背景并不是細(xì)胞培養(yǎng)與收獲方面。

基于上述分析，本研究采用硝酸鈰銨作為引發(fā)劑，在經(jīng)堿處理后的HFMs表面氧化產(chǎn)生自由基，進(jìn)而進(jìn)行PNIPAAm的接枝聚合，從而制備具有溫敏特性的PNIPAAm--HFMs；并考察了成纖維細(xì)胞在PNIPAAm--HFMs表面的降溫脫附行為。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試劑與儀器

-異丙基丙烯酰胺（-isopropylacrylamide，NIPAAm），純度99%，百靈威科技有限公司；醋酸纖維素中空纖維膜（cellulose acetate hollow fiber membrane，HFM），外徑175 μm, 內(nèi)徑149 μm，日本KAWASUMI；硝酸鈰銨（ceric ammonium nitrate，CAN），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HNO3和無(wú)水乙醇，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國(guó)ScienCell；低糖培養(yǎng)基（low glucose-dulbecco’s modified eagle’s medium，LG-DMEM），美國(guó)Gibco。

傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet Instrument Inc；元素分析儀，德國(guó)VarioELⅢ；DCA-322動(dòng)態(tài)接觸角分析儀，美國(guó)Cahn公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS OPTICAL CO. LTD。

1.2 PNIPAAm--HFMs的制備

將醋酸纖維素中空纖維膜在乙醇中浸泡清洗2 h后，置于0.05 mol·L-1NaOH 溶液中室溫水解24 h，然后用大量的去離子水進(jìn)行沖洗，25℃真空干燥備用。NIPAAm接枝改性中空纖維膜的過(guò)程參考文獻(xiàn)[13-14]。將總長(zhǎng)度為2000 cm的中空纖維膜置于三口燒瓶中，加入25 ml 0.1 mol·L-1的HNO3溶液，密封后通入氮?dú)?，同時(shí)置于水浴中加熱至 60℃，氮?dú)猸h(huán)境下加入0.137 g CAN；30 min后加入一定質(zhì)量的NIPAAm （NIPAAm的濃度分別為0、0.005、0.01、0.05、0.1 和0.2 mol·L-1），置于25℃水浴、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，用大量去離子水沖洗PNIPAAm--HFMs（分別記為HFMs-0、HFMs-0.005、HFMs-0.01、HFMs-0.05、HFMs-0.1和HFMs-0.2），后置于去離子水中高壓蒸汽滅菌，密封備用。

1.3 PNIPAAm--HFMs的表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀考察接枝PNIPAAm后中空纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用元素分析儀對(duì)中空纖維膜進(jìn)行元素分析，并通過(guò)式（1）計(jì)算其PNIPAAm接枝量[15-16]。采用動(dòng)態(tài)接觸角分析儀，通過(guò)Wilhelmy吊片法分別測(cè)定20℃和37℃時(shí)PNIPAAm接枝改性后中空纖維膜的動(dòng)態(tài)接觸角。采用Bicinchoninic Acid （BCA）蛋白定量試劑盒測(cè)定接枝PNIPAAm后中空纖維膜在20℃和37℃時(shí)蛋白吸附量（μg·cm-2）。

grafted amount(1)

式中，p和0分別為PNIPAAm--HFMs和未接枝PNIPAAm的HFMs中N元素含量，%；p,theor為PNIPAAm聚合物N元素含量理論值；為HFMs的比表面積，1116 cm2·g-1。

1.4 PNIPAAm接枝改性中空纖維膜用于細(xì)胞的收獲

將高壓蒸汽滅菌后的PNIPAAm--HFMs平鋪于培養(yǎng)皿中，PBS清洗3次，每次20 min；加入10% FBS+LG-DMEM，37℃下無(wú)菌孵育過(guò)夜。吸除培養(yǎng)基后，滴加50 μl 5×105cells·ml-1的SD大鼠新生鼠皮膚成纖維細(xì)胞，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，二次接種，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，將中空纖維膜-細(xì)胞復(fù)合物移至新的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)2 d后，用37℃的PBS清洗兩次，以去除未黏附至中空纖維膜上的細(xì)胞，然后加入新鮮無(wú)血清的冷LG-DMEM，在顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

降溫孵育至細(xì)胞變?yōu)閳A形后，輕輕吹打中空纖維膜，收集脫附下來(lái)的細(xì)胞，未脫附的細(xì)胞采用胰酶消化法進(jìn)行收獲。采用血球計(jì)數(shù)儀對(duì)各組脫附下來(lái)的細(xì)胞及未脫附的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過(guò)式（2）計(jì)算細(xì)胞的脫附率。

式中，1和2分別為脫附和未脫附的細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以“means±SD”表示，組間比較采用單因素方差分析和檢驗(yàn)。＜0.05時(shí)具有顯著性差異（*），＜0.01時(shí)具有非常顯著性差異（**）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PNIPAAm--HFMs的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

圖1顯示了中空纖維膜的衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜。羥基（OH）的伸縮振動(dòng)吸收峰和亞甲基（CH2）的伸縮振動(dòng)吸收峰分別出現(xiàn)在3350和2900 cm-1附近；與糖苷鍵伸縮振動(dòng)有關(guān)的連續(xù)特征吸收峰出現(xiàn)在1020～1450 cm-1處，這些是典型的纖維素類(lèi)特征峰。與未接枝PNIPAAm的中空纖維膜的紅外光譜對(duì)比， PNIPAAm接枝修飾后的中空纖維膜在1650 cm-1處的羰基（CO）和1371 cm-1處的甲基（CH3）的伸縮振動(dòng)吸收峰的強(qiáng)度增強(qiáng)，這主要是由于PNIPAAm中含有大量的羰基和甲基。此外在1550 cm-1處出現(xiàn)了新的酰胺鍵II（NH）的彎曲振動(dòng)吸收峰，這說(shuō)明PNIPAAm成功地接枝修飾到中空纖維膜上。

圖1 HFMs的ATR-FTIR譜圖

a—ungrafted HFMs; b—PNIPAAm--HFMs

表1展示出所制備的一系列溫敏性中空纖維膜的N元素含量及PNIPAAm的接枝量。經(jīng)過(guò)PNIPAAm修飾后，中空纖維膜中N元素的含量有所增加，且隨著NIPAAm濃度增加，N元素的含量呈增加趨勢(shì)，PNIPAAm的接枝量也相應(yīng)增加，這也證實(shí)了PNIPAAm可成功在中空纖維膜上接枝聚合。然而，與理論接枝量相比，PNIPAAm在HFMs上的接枝量很少。這是由于在接枝聚合過(guò)程中，NIPAAm也會(huì)發(fā)生自聚反應(yīng)，從而使實(shí)際接枝量小于理論值；此外，反應(yīng)過(guò)程中無(wú)氧環(huán)境有可能受到破壞，氧氣進(jìn)入反應(yīng)體系，導(dǎo)致了自由基淬滅，接枝聚合反應(yīng)終止，進(jìn)一步降低了PNIPAAm接枝量。

表1 HFMs氮元素含量及PNIPAAm接枝量

2.2 PNIPAAm--HFMs的溫敏性

在調(diào)控細(xì)胞黏附與脫附時(shí)，PNIPAAm修飾后的表面在溫度發(fā)生變化時(shí)所表現(xiàn)出的親疏水性質(zhì)的變化是一項(xiàng)重要的表面特性[17]。因此，本研究采用威廉吊片法和BCA法對(duì)中空纖維膜表面的潤(rùn)濕性與蛋白吸附能力分別進(jìn)行了測(cè)定。

采用威廉吊片法，在20℃和37℃下分別對(duì)中空纖維膜表面的動(dòng)態(tài)接觸角進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。當(dāng)溫度由20℃升至37℃時(shí)，PNIPAAm修飾的中空纖維膜表面動(dòng)態(tài)接觸角增加，即中空纖維膜表面疏水性增強(qiáng)。這與PNIPAAm所具有的特性是一致的，即當(dāng)溫度低于LCST（32℃）時(shí)，親水性基團(tuán)（酰胺基）通過(guò)氫鍵作用與水分子相結(jié)合，PNIPAAm鏈呈舒展?fàn)顟B(tài)，從而導(dǎo)致溫敏性表面呈現(xiàn)親水性；當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，親水性基團(tuán)與水分子間的氫鍵作用減弱，疏水性基團(tuán)（異丙基）之間的疏水締合作用增強(qiáng)，PNIPAAm鏈呈蜷縮狀態(tài)，從而導(dǎo)致溫敏性表面呈現(xiàn)疏水性[18-19]。與此同時(shí)對(duì)比不同組的動(dòng)態(tài)接觸角后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PNIPAAm接枝量增大時(shí)，表面的接觸角會(huì)有所下降，這可能是由于當(dāng)中空纖維膜表面PNIPAAm接枝量增加時(shí)，中空纖維膜表面PNIPAAm層相應(yīng)變厚，導(dǎo)致其表面在37℃和20℃時(shí)均呈現(xiàn)高度水合狀態(tài)，因而動(dòng)態(tài)接觸角有所減小，表面親水性增強(qiáng)[20-21]。

表2 中空纖維膜的動(dòng)態(tài)接觸角

此外表2還表明了溫敏性中空纖維膜表面的PNIPAAm接枝量與不同溫度間動(dòng)態(tài)接觸角的差值之間的關(guān)系。即當(dāng)PNIPAAm接枝量由2.65 μg·cm-2增加至44.09、50.65、62.58 μg·cm-2時(shí)，37℃和20℃間的動(dòng)態(tài)接觸角差值呈下降趨勢(shì)。這可能與溫敏性表面的PNIPAAm層厚度和構(gòu)象有關(guān)[20]。當(dāng)溫度從37℃降至20℃時(shí)，位于表面最外層的PNIPAAm鏈發(fā)生快速的疏水締合，進(jìn)而在最外層形成較致密層，阻止了內(nèi)部水分子的排出。因此PNIPAAm層較厚時(shí)，其構(gòu)象改變程度較小，動(dòng)態(tài)接觸角的變化差值相應(yīng)會(huì)比較小。

與細(xì)胞黏附有關(guān)的蛋白在基底表面的黏附是細(xì)胞在材料表面黏附的重要過(guò)程，也是用來(lái)評(píng)價(jià)材料表面溫敏性的重要指標(biāo)，因而本研究測(cè)定了37℃和20℃時(shí)胎牛血清蛋白在溫敏性中空纖維膜表面的黏附量。胎牛血清是去除血漿中的纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜的混合物，其包含多種蛋白質(zhì)，如與細(xì)胞黏附息息相關(guān)的層粘連蛋白和纖維連接蛋白，以及促進(jìn)細(xì)胞間相互聯(lián)系和生長(zhǎng)的膠原蛋白等。胎牛血清是體外培養(yǎng)細(xì)胞重要的組成部分，因此本研究選用胎牛血清作為模型蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)中空纖維膜的表面蛋白黏附能力進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)PNIPAAm修飾后的中空纖維膜在20℃和37℃下的蛋白黏附量大多小于未經(jīng)PNIPAAm修飾的中空纖維膜表面的蛋白黏附量。有研究表明當(dāng)含有親水性基團(tuán)的聚合物在基底表面的接枝量致密時(shí)，由于空間位阻效應(yīng)，蛋白黏附量較低[17,22]。因此，當(dāng)PNIPAAm接枝量由2.65 μg·cm-2增加至44.09、50.65和62.58 μg·cm-2時(shí)，表面的蛋白黏附量呈下降趨勢(shì)。此外，經(jīng)PNIPAAm修飾后的中空纖維膜在20℃時(shí)的蛋白黏附量明顯小于37℃時(shí)的蛋白黏附量；當(dāng)溫度為20℃時(shí)，中空纖維膜表面由于呈現(xiàn)親水性，導(dǎo)致胎牛血清中的疏水性蛋白（纖維連接蛋白和層粘連蛋白）不易黏附到其表面；當(dāng)溫度升至37℃時(shí)，由于PNIPAAm鏈的疏水締合作用，使其PNIPAAm層結(jié)構(gòu)由舒展?fàn)顟B(tài)變化為蜷縮狀態(tài)，從而使中空纖維膜表面呈現(xiàn)出疏水性，進(jìn)而利于疏水性的蛋白的黏附[23-24]。因此，溫敏性中空纖維膜表面的蛋白黏附能力不僅與溫度有關(guān)，還與PNIPAAm的接枝量有關(guān)。

圖2 20℃和37℃時(shí)PNIPAAm-g-HFMs表面蛋白吸附量

NS—not significant; *—＜0.05; **—＜0.01

2.3 成纖維細(xì)胞在PNIPAAm--HFMs表面的培養(yǎng)與降溫脫附

將成纖維細(xì)胞接種到PNIPAAM--HFMs表面上進(jìn)行培養(yǎng)，12 h和48 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞可在HFMs-0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05表面黏附并呈鋪展?fàn)顟B(tài)，與對(duì)照組HFMs-0相比，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異。而HFMs-0.2組不適宜細(xì)胞的黏附，細(xì)胞多呈圓形。培養(yǎng)48 h后，HFMs-0.2組只有少量的細(xì)胞黏附，大量的細(xì)胞遷移至培養(yǎng)皿底部生長(zhǎng)增殖；其他組HFMs表面上細(xì)胞鋪滿(mǎn)中空纖維膜表面，表現(xiàn)出良好的增殖能力。與此同時(shí)，HFMs之間細(xì)胞出現(xiàn)了搭橋的現(xiàn)象。

圖3 成纖維細(xì)胞在中空纖維膜表面的生長(zhǎng)形態(tài)

培養(yǎng)2 d后，對(duì)成纖維細(xì)胞在HFMs-0、HFMs- 0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05表面降溫脫附過(guò)程進(jìn)行考察。圖4展示了降溫脫附過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化。降溫孵育過(guò)程中，HFMs-0表面的細(xì)胞一直處于黏附鋪展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化[圖4(a)]。而PNIPAAm--HFMs組的細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生了明顯的變化。如圖4(b)所示，加入20℃培養(yǎng)基孵育40 min后，HFMs-0.005表面黏附的細(xì)胞由鋪展?fàn)顟B(tài)變?yōu)閳A形皺縮狀。HFMs-0.01表面細(xì)胞的形態(tài)變化較快，孵育20 min后，鋪展?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞便完全皺縮變圓[圖4(c)]。而HFMs-0.05表面上細(xì)胞完全皺縮變圓需要降溫孵育30 min[圖4(d)]。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變圓后，輕輕吹打中空纖維膜，細(xì)胞團(tuán)簇便可從溫敏膜表面完全脫附下來(lái)。上述結(jié)果與Okano等[25]報(bào)道的細(xì)胞在溫敏材料表面降溫脫附時(shí)首先發(fā)生細(xì)胞形態(tài)的變化、隨后從材料表面脫附的過(guò)程相一致。此外，各組PNIPAAm--HFMs降溫收獲細(xì)胞效率均達(dá)90%以上，而未經(jīng)過(guò)PNIPAAm修飾的HFMs-0組細(xì)胞脫附率僅為4.27%±1.64%。即PNIPAAm--HFMs可有效地通過(guò)降溫處理收獲細(xì)胞。

圖4 降低溫度后HFMs表面成纖維細(xì)胞的形態(tài)變化

在細(xì)胞降溫脫附過(guò)程中，PNIPAAm接枝量不同，細(xì)胞形態(tài)完全皺縮變圓所需要的時(shí)間也不相同。當(dāng)PNIPAAm接枝量由0.8 μg·cm-2增加至2.65μg·cm-2時(shí)，細(xì)胞發(fā)生明顯形態(tài)變化所需要的時(shí)間縮短，而當(dāng)接枝量繼續(xù)增加至44.09 μg·cm-2時(shí)，脫附過(guò)程耗時(shí)增加。這與溫敏性中空纖維膜表面的親疏水性質(zhì)的變化程度有關(guān)。接枝量過(guò)低或者過(guò)高時(shí)，溫敏表面的親疏水性質(zhì)變化程度較弱，因此細(xì)胞受到的脫附推動(dòng)力也就較弱，細(xì)胞脫附過(guò)程所需要的時(shí)間也就較長(zhǎng)。

Knazek等[26]于1972年首次報(bào)道了將中空纖維膜用于細(xì)胞培養(yǎng)。由于具有較大的比表面積，中空纖維膜可為黏附型細(xì)胞提供高達(dá)200 cm2·ml-1的黏附表面，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度（108cells·ml-1）的培養(yǎng)；此外中空纖維膜的多孔結(jié)構(gòu)也可加速營(yíng)養(yǎng)代謝物質(zhì)的傳遞、有利于細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子的相互作用，可更真實(shí)地模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境[27]。因此，利用中空纖維膜生物反應(yīng)器可以進(jìn)行細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)與擴(kuò)增。對(duì)中空纖維膜進(jìn)行PNIPAAm接枝修飾后，中空纖維膜不僅可保持其原有優(yōu)勢(shì)，而且具有了溫敏特性。這種溫敏性中空纖維膜用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可通過(guò)改變培養(yǎng)基的溫度來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附與脫附，即當(dāng)培養(yǎng)液溫度高于LCST（約32℃）時(shí)，中空纖維膜表面呈弱疏水性，由疏水性蛋白（如纖維連接蛋白、層粘連蛋白）介導(dǎo)的細(xì)胞黏附過(guò)程可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在中空纖維膜上黏附與生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)液溫度降至20℃時(shí)，中空纖維膜表面變?yōu)槿跤H水性，疏水性蛋白與中空纖維膜間的錨定作用減弱，此時(shí)細(xì)胞在細(xì)胞骨架重建作用下發(fā)生形態(tài)變化（由鋪展?fàn)顟B(tài)變?yōu)閳A形）進(jìn)而從其表面脫附下來(lái)。綜上所述，溫敏性中空纖維膜可用于黏附型細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)與非酶解收獲。

表3 成纖維細(xì)胞在HFMs表面的降溫脫附率

3 結(jié) 論

（1）ATR-FTIR圖譜分析及元素分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明PNIPAAm能接枝聚合到HFMs上。單體溶液中NIPAAm溶度增大，會(huì)使HFMs上的PNIPAAm接枝量增加。

（2）動(dòng)態(tài)接觸角和BCA蛋白定量測(cè)定結(jié)果均證實(shí)PNIPAAm--HFMs可隨溫度改變發(fā)生親疏水性變化，即具有溫敏性。

（3）細(xì)胞生長(zhǎng)與脫附實(shí)驗(yàn)表明，HFMs-0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05均可用于細(xì)胞的培養(yǎng)與降溫收獲；當(dāng)PNIPAAm接枝量為2.65 μg·cm-2時(shí)，細(xì)胞脫附過(guò)程耗時(shí)最少。

（4）PNIPAAm接枝量在一定程度上影響PNIPAAm--HFMs的溫敏性；接枝量過(guò)高過(guò)低時(shí)，其表面親疏水性變化程度較低，細(xì)胞脫附所需時(shí)間增加。因此，在制備溫敏性中空纖維膜時(shí)，PNIPAAm接枝量一定要控制在適宜的范圍內(nèi)。

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Preparation and characterization of novel thermo-responsive hollow fiber membranes

ZHUANG Meiling, LIU Tianqing, SONG Kedong, WANG Shuping

(Dalian R&D Center for Stem Cell and Tissue Engineering, Faculty of Chemical, Environmental and Biological and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China)

Owing to the large scale area-to-volume ratio involved, hollow fiber membranes (HFMs) provide a tremendous amount of surface area for cell adhesion. Therefore, HFMs are widely used for large-scale expansion of cells. Traditionally, trypsinization is empolyed to harvest adhered cells from the surface of HFMs. However, this proteolytic enzyme treatment will destroy cell viability and function. Therefore, this study prepared a serious poly(-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) grafted HFMs (PNIPAAm--HFMs) with different grafted amounts, and the fibroblasts culture and detachment from PNIPAAm--HFMs with temperature reduction was also investigated. ATR-FTIR and elemental analysis results indicated that the PNIPAAm was covalently grafted on HFMs successfullyfree radical polymerization in the presence of cerium (Ⅳ). Dynamic contact angle measurements showed that the surface contact angle of water on PNIPAAm--HFMs decreased significantly when the temperature dropped below LCST. Additionally, the protein adhesion assay results further confirmed that PNIPAAm--HFMs exhibited thermo-responsive property, namely hydrophilic-hydrophobic phase transition with temperature changed. MEFs adhered, spread and grew well on the surface of PNIPAAm-grafted HFMs except HFMs-0.2 at 37℃. In addition, the experiment of cell detachment showed that the cell can be released from PNIPAAm--HFMs with decreasing temperature and detachment efficiencies were above 90%. In conclusion, the PNIPAAm--HFMs with thermo-responsive property can be an attractive candidate for cell large-scale expansion and cell detachment with temperature reduction.

poly(-isopropylacrylamide); hollow fiber membranes; grafting polymerization; thermo-responsive; cell detachment

2016-05-27.

Prof. LIU Tianqing,liutq@dlut. edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20160723

Q 813.1；TB 381

A

0438—1157（2016）11—4866—07

莊美玲（1988—），女，博士研究生。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170945）。

2016-05-27收到初稿，2016-07-19收到修改稿。

聯(lián)系人：劉天慶。

supported by the National Natural Science Foundation of China (31170945).