益生菌乳酸發(fā)酵提高低聚果糖含量生產(chǎn)的新方法

許宏賢，張曉萍，段鋼

（杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部，江蘇無錫214028）

益生菌乳酸發(fā)酵提高低聚果糖含量生產(chǎn)的新方法

許宏賢，張曉萍，段鋼*

（杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部，江蘇無錫214028）

研究報(bào)告了一種新的提高低聚果糖（FOS）含量的生產(chǎn)方法。以市售低聚果糖為原料，通過添加甜菜堿進(jìn)行益生菌乳酸發(fā)酵，將原料中可發(fā)酵性糖葡萄糖、果糖轉(zhuǎn)化為乳酸，蔗糖部分轉(zhuǎn)化為乳酸，使原料中低聚果糖的含量由51%提高到84%，而發(fā)酵液無需進(jìn)行菌體分離即可用于食品加工，為低聚果糖的生產(chǎn)提供了一種低成本、高效率的純化方法。

低聚果糖；乳酸；益生菌；甜菜堿

低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，是指2～5個(gè)果糖基為鏈節(jié)，以一個(gè)葡萄糖基為鏈的端基，以果糖基→果糖連接鍵為主體骨架連結(jié)形成的碳水化合物，即是指1～4個(gè)果糖基以β-1，2鍵連接在蔗糖的D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）和蔗果六糖（GF5）的混合物。作為商品的低聚果糖主要有兩種來源［1］：一是中國(guó)乃至于亞洲地區(qū)普遍生產(chǎn)的以蔗糖為原料的低聚果糖；二是主要產(chǎn)于歐洲的以菊苣為原料的低聚果糖。相對(duì)而言從菊苣生產(chǎn)的低聚果糖的聚合度（degree of polymerization，DP）（DP＜9）比用蔗糖生產(chǎn)的聚合度（DP＜4）高。聚合度的高低對(duì)FOS在腸內(nèi)的發(fā)酵有著要影響［2-3］。

以蔗糖為底物制備低聚果糖時(shí)［4］，由于受到產(chǎn)物葡萄糖和未反應(yīng)蔗糖的抑制作用，其最大得率只能達(dá)到55%～60%，進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的濃度需采用其他方法，如采用固定化黑曲霉細(xì)胞和葡萄糖異構(gòu)酶［5］；或采用一種由葡萄糖氧化酶和過氧化物酶組成的雙酶系的酶處理方法［6］；或者采用模擬移動(dòng)床的離子交換法等。蔡健等［7］發(fā)明了一種高純度低聚果糖的生產(chǎn)方法，以55%的普通級(jí)低聚果糖為原料，利用生物轉(zhuǎn)化原理，采用酵母消化葡萄糖，使低聚果糖的含量達(dá)到75%以上；再利用離子交換色譜和膜分離技術(shù)相結(jié)合，去除其他成份，使產(chǎn)品中的低聚果糖含量達(dá)到95%以上；但是該方法中殘余酒精可能會(huì)影響產(chǎn)品的風(fēng)味。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一群形態(tài)代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌總稱，它的自然宿主是人類、動(dòng)物和植物［8］。益生菌是指通過攝入適量從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物［9-10］。最常見的益生菌主要有雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳桿菌屬（Lactobacillus）［11］。

低聚果糖具有特殊的生物活性功能，其甜度低、熱值低、抗齲齒，促進(jìn)人體腸道內(nèi)雙歧桿菌大量繁殖，明顯抑制腸道內(nèi)有害菌的繁殖及腐敗物質(zhì)的生成，具有防止便秘、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低血脂、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等功效，具有間接抗癌、間接生成各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用，不升高血糖［12-17］。利用發(fā)酵法去除可發(fā)酵性糖從而提高功能性低聚糖含量的研究近年開始見諸報(bào)道［18-20］，但是利用市售含50%低聚果糖的糖漿，通過乳酸菌發(fā)酵從而提升FOS含量的研究尚未見報(bào)道，F(xiàn)OS濃縮糖漿的高滲透壓可能是影響乳酸發(fā)酵的技術(shù)障礙之一。本研究以市售含50%低聚果糖的糖漿為底物，通過添加甜菜堿進(jìn)行益生菌乳酸發(fā)酵，將葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為乳酸，從而提高FOS含量，該技術(shù)無需進(jìn)行發(fā)酵液菌體分離，有著廣泛的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)潛力。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

50%FOS糖漿（QHTFOS-G50L，批號(hào)：101016067）：量子高科（中國(guó)）生物股份有限公司；甜菜堿（BP20）：杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）CGMCC 1.2446：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

乳酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；醋酸鈉：美國(guó)Fisher公司；氨水、氫氧化鈣、NaOH（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO42 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，葡萄糖20 g/L，Tween-80 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO320 g/L，蒸餾水配制，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿40g/L，酪蛋白10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏10 g/L，Tween 80 1.5 g/L，MnSO4·H2O 0.3 g/L，CaCO320 g/L，用FOS原漿加水稀釋至30°Bx配制，pH 6.5，21℃滅菌20 min。根據(jù)試驗(yàn)條件不同添加甜菜堿。

1.2儀器與設(shè)備

NBS 2L發(fā)酵罐、NBS Innova R43搖床：美國(guó)Eppendorf NBS公司；0.5～5000μL移液槍：熱電（上海）儀器有限公司；405-60-T酸度計(jì)：瑞士梅特勒-多利托儀器有限公司；LDZM-80KCS滅菌柜：上海申安醫(yī)療器械有限公司；AC2-6S1超凈工作臺(tái)：日立（中國(guó)）有限公司；KBF115培養(yǎng)箱：德國(guó)Binder公司；Agilent1100高壓液相色譜：美國(guó)Agilent公司；ICS-5000型離子色譜：美國(guó)Dionex公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1乳酸菌活化與擴(kuò)培

從斜面上取一環(huán)乳酸菌，轉(zhuǎn)移到裝有100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)12～18 h。

1.3.2乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

配制發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量每個(gè)發(fā)酵罐1 000 mL。打開Bio-Command Plus軟件，控制溫度45℃；根據(jù)試驗(yàn)條件不同用氨水或氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH 6.5。按接種量10%接入培養(yǎng)好的液體種子，開始發(fā)酵，過程中控制pH溫度穩(wěn)定。發(fā)酵過程中取樣分析乳酸含量，發(fā)酵結(jié)束取樣分析FOS含量。

1.3.3發(fā)酵液成分含量分析

依據(jù)參考文獻(xiàn)［24］采用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法分析檢測(cè)發(fā)酵液中乳酸含量。

1.3.4低聚果糖含量分析

采用離子色譜（ion chromatography，IC）法分析低聚果糖含量。離子色譜條件：CarboPakTM PA200色譜柱（250mm×4mm），CarboPakTMPA10保護(hù)柱（50mm×4mm）；柱溫30℃；流速1 mL/min，進(jìn)樣量25 μL。梯度洗脫條件：0～5 min，100 mmol/L氫氧化鈉，0～120 mmol/L醋酸鈉；5～50 min，100 mmol/L氫氧化鈉，0～120 mmol/L醋酸鈉；10～50 min，100 mmol/L氫氧化鈉，120～320 mmol/L醋酸鈉；50～55 min，100 mmol/L氫氧化鈉，320 mmol/L醋酸鈉；55～65 min，100 mmol/L氫氧化鈉。

2　結(jié)果與分析

2.1原料糖漿低聚果糖含量分析

考慮到原料低聚果糖的濃度達(dá)到75°Bx，屬于極高滲透壓環(huán)境，故而加水稀釋至30°Bx，采用離子色譜（IC）法分析低聚果糖的組成。結(jié)果如表1所示。

表1　原料糖漿中各種糖含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of all kinds of sugars content in raw material syrup

由表1可知，市售的低聚果糖糖漿中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）含量在51%左右，仍然含有接近50%的可發(fā)酵性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖），這些可發(fā)酵性糖的存在會(huì)限制低聚果糖的使用范圍，如糖尿病人、肥胖病人、減肥人士的服用等，提高低聚果糖的含量以便擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

2.2不同添加量甜菜堿對(duì)發(fā)酵的影響

相關(guān)研究表明［19］，在高滲環(huán)境下細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和酶活會(huì)大幅下降，甜菜堿作為一種外源性的滲透保護(hù)劑，可以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，從而提高微生物對(duì)高滲環(huán)境的耐受性；對(duì)于乳酸菌（Lactobacillus）［20］，甜菜堿通過提高L-鼠乳酸脫氫酶的活性和細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)滲透壓的耐受性從而提高乳酸產(chǎn)量。本試驗(yàn)將不同含量的甜菜堿加入到鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20%氨水調(diào)節(jié)pH，定期取樣，采用HPLC測(cè)定發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。發(fā)酵結(jié)束采用IC法分析FOS組成。結(jié)果如表2所示。

圖1　不同甜菜堿添加量對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different betaine addition on lactic acid yield

表2　發(fā)酵結(jié)束后糖漿中各種糖含量Table 2 Contents of all kinds of sugars in syrup after the fermentation

由圖1可知，盡管在發(fā)酵的前6 h看不出乳酸含量上的差別，但從22 h起，添加甜菜堿乳酸產(chǎn)量明顯高于不添加甜菜堿的乳酸產(chǎn)量；并且不管是否添加甜菜堿，乳酸產(chǎn)量在發(fā)酵46～54 h幾乎沒有變化，說明乳酸發(fā)酵基本結(jié)束。綜合圖1表2可知，添加甜菜堿發(fā)酵起始的95.1 g/L葡萄糖和15.9 g/L果糖全部被轉(zhuǎn)化成乳酸，33 g/L蔗糖中有6.1 g/L被轉(zhuǎn)化成乳酸，殘余26.9 g/L；發(fā)酵前后蔗果三糖分別是79.3 g/L和79.0 g/L、蔗果四糖65.8 g/L和59.3 g/L、蔗果五糖9.6 g/L和8.0 g/L；僅略有降低；而不添加甜菜堿的一組盡管相關(guān)數(shù)據(jù)未能顯示，但殘余葡萄糖仍有24 g/L，說明殘余的可發(fā)酵性糖依然很高?？傮w來講，通過添加3 g/L甜菜堿進(jìn)行益生菌乳酸發(fā)酵，發(fā)酵前總糖為298.7 g/L，發(fā)酵后為167.1 g/L，有131.6 g/L的糖通過鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）轉(zhuǎn)化為130 g/L的乳酸；發(fā)酵液的糖成分為84%低聚果糖、16%蔗糖，另外還含有乳酸、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）等可食用成分。

3　結(jié)論

本研究利用益生乳酸菌進(jìn)行市售低聚果糖乳酸發(fā)酵，將原料中可發(fā)酵性糖葡萄糖、果糖轉(zhuǎn)化為乳酸，蔗糖部分轉(zhuǎn)化為乳酸，使原料中低聚果糖的含量由51%提高至84%，發(fā)酵液無需進(jìn)行菌體分離即可用于食品加工，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了低聚果糖在各類功能食品、健康食品中的應(yīng)用。當(dāng)然有關(guān)成品的劑型、應(yīng)用仍需要感興趣的企業(yè)進(jìn)行拓展，相信隨著人們健康意識(shí)的不斷提高，新型的富含益生菌和乳酸的低聚果糖的應(yīng)用必將走入我們的日常生活。

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XU Hongxian，ZHANG Xiaoping，DUAN Gang*
（Genencor（China）Bioproduct Co.，Ltd.，DuPont Industrial Biosciences，Wuxi 214028，China）

A new production method of improving fructooligosaccharides（FOS）content was reported.Using the FOS sold on the market as the raw material，the probiotic lactic acid fermentation was conducted with addition of the betaine.The fermentable sugars（such as glucose and fructose）in the raw material were translated into lactic acid，the sucrose was translated into lactic acid partly，and the FOS content in the raw material was increased from 51%to 84%.The fermentation liquor without bacterium separation could be used to food processing，which provided a purification method with low cost and high efficiency for fructooligosaccharides production.

fructooligosaccharides；lactic acid；probiotics；betaine

Q815

0254-5071（2016）06-0143-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.030

2016-03-29

許宏賢（1970-），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称放c發(fā)酵。

段鋼（1966-），男，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)酶的應(yīng)用。