蘭州百合多糖硫酸酯的制備及其抗氧化活性的測定

黃玉龍，趙保堂，宋珅，李偉綺，龐中存，張繼*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；3.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

蘭州百合多糖硫酸酯的制備及其抗氧化活性的測定

黃玉龍1，2，3，趙保堂2，3，宋珅2，3，李偉綺1，龐中存1，張繼2，3*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；3.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

從蘭州百合鱗莖中提取百合多糖（LPs），用氯磺酸-吡啶法制備百合多糖硫酸酯（LPsS）。以百合多糖硫酸酯的硫含量為評價(jià)指標(biāo)，依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)對反應(yīng)溫度、時(shí)間和酯化劑比例（氯磺酸∶吡啶）三個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化。得出最佳條件為反應(yīng)時(shí)間1.5 h，反應(yīng)溫度43℃，氯磺酸與吡啶的體積比為1∶1。在此條件下，百合多糖硫酸酯中硫含量可達(dá)到10.98%。傅里葉紅外光譜掃描顯示在波數(shù)1 236 cm-1、813 cm-1處出現(xiàn)新吸收峰，說明百合多糖已被硫酸化。氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析百合多糖硫酸酯由甘露糖、葡萄糖、半乳糖3種單糖組成，其摩爾比為18：14：1。體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明百合多糖硫酸酯具有較好的清除DPPH自由基能力，并且抗氧化活性比未酯化前有所提高。

蘭州百合；多糖；硫酸酯化；抗氧化活性

蘭州百合（Lilium davidii）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）川百合的一個(gè)變種，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，以后歷代本草均有記載［1］。蘭州百合含有蛋白質(zhì)、多種維生素、總類胡蘿卜素、8種人體必需氨基酸和12種人體必需微量元素等成分［2］，其中總糖含量占13%，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，百合多糖（Lilium davidiipolysaccharides，LPs）具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗疲勞、抑菌等作用［3］。近年來對百合多糖的可能作用機(jī)制、提取條件優(yōu)化、分離純化方面研究較多，但對其構(gòu)效關(guān)系和生理活性機(jī)理的研究還不夠深入。

多糖分子修飾或功能化可提高其生物活性與生物相容性。多糖硫酸化修飾是用硫酸基團(tuán)取代大分子鏈糖基單元的羥基，形成半合成酸性多糖，導(dǎo)致其物理化學(xué)性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)形貌發(fā)生改變，使某些活性較低或不具活性的多糖產(chǎn)生新活性［4］。如小分子質(zhì)量的牛膝多糖具有增強(qiáng)免疫力作用而無抗病毒活性，在引入一定量的硫酸基團(tuán)后，其抗乙肝病毒的活性增強(qiáng)；香菇多糖經(jīng)硫酸化修飾后，其人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的活性也明顯增強(qiáng)［5-6］。研究百合多糖構(gòu)效關(guān)系，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，有利于百合多糖的抗氧化、抗突變、抗病毒等藥理活性的增強(qiáng)［7-8］。

本研究采用氯磺酸-吡啶修飾工藝，對百合多糖進(jìn)行修飾，制備百合多糖硫酸酯（Lilium davidiipolysaccharides sulfate，LPsS），采用氣質(zhì)聯(lián)用（gas-chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）儀分析其單糖組成，并初步測定了其抗氧化活性，以期為蘭州百合高活性多糖的制備及其在食品醫(yī)藥行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蘭州百合：蘭州金德百合商貿(mào)有限公司。

吡啶：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯磺酸、乙酸酐、無水乙醇：天津光復(fù)精細(xì)化工公司；甲酰胺、二甲基甲酰胺：天津市化學(xué)試劑一廠；三氟乙酸：上海晶純試劑公司；溴化鉀：Adamas試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)單糖鼠李糖、來蘇糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖：北京索萊寶公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DF-101B恒溫磁力攪拌器：浙江樂清市樂成電器廠；JRA-6型恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器公司；BSA224S型電子天平：德國賽多利斯公司；LGJ-18S冷凍干燥機(jī)：北京松源華興公司；EA3000型元素分析儀：意大利Euro Vector公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜（Fourier transforminfrared spectrum，F(xiàn)T-IR）儀、Polaris-Q氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1LPs的制備［9］

稱取適量的蘭州百合，干燥后經(jīng)100目篩粉碎，在50℃條件下超聲波輔助提取，抽濾后將濾液4 000 r/min離心15 min取上清，減壓濃縮，采用Sevage法脫蛋白，加入4倍體積無水乙醇沉淀24 h，4 000 r/min離心15 min，沉淀于-60℃冷凍干燥得到蘭州百合多糖。

1.3.2蘭州百合硫酸酯化多糖（LPsS）的制備

影響氯磺酸-吡啶方法制備LPsS的主要因素包括氯磺酸（chlorosulfonic acid，CSA）與吡啶（pyridine，Py）體積比、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間［10］。以硫含量（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)了3因素3水平試驗(yàn)，各Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3硫含量測定

在氧化爐溫度980℃，載氣流速125 mL/min，載氣壓力80kPa，熱導(dǎo)檢測器與色譜柱溫度115℃，氧氣壓力50 kPa，加氧量20 mL條件下，分析時(shí)間320 s，采用元素分析儀測定硫含量（%）［11］。

1.3.4LPsS的FT-IR分析

將干燥充分的多糖樣品加溴化鉀（KBr）進(jìn)行壓片，在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍用紅外光譜儀掃描16次，分辨率為4 cm-1。

1.3.5LPsS的GC-MS分析

稱取10 mg LPsS加入4 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）4 mL，120℃條件下氮?dú)獗Ｗo(hù)水解10 h后減壓蒸餾，去除三氟乙酸。添加0.5 mL吡啶及10 mg的鹽酸羥胺在90℃條件下反應(yīng)0.5 h，待冷卻后再加入500 μL的乙酸酐，90℃條件下乙?；磻?yīng)0.5 h，減壓蒸干。

反應(yīng)物經(jīng)氯仿萃取，0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜（GC）條件：TR-5ms SQC色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm），升溫條件為：從120℃（保持3 min）開始，以5℃/min升溫至250℃保持5 min。載氣為高純氦氣（He），柱流量為1.0 mL/min，分流比為1∶50，進(jìn)樣口溫度250℃［12］，進(jìn)樣量0.2 μL。

質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度250℃，四極桿150℃，掃描質(zhì)量范圍為33～550 m/z，無溶劑延遲。

標(biāo)準(zhǔn)單糖和標(biāo)品處理方法和色譜條件同上。

1.3.6LPs和LPsS對DPPH自由基清除能力的測定［13］

用蒸餾水分別準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的LPs和LPsS溶液，使其溶解充分，并各自分別稀釋為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的溶液。配制DPPH溶液濃度為0.2 mmol/L。以丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）溶液作為陽性對照，其質(zhì)量濃度與多糖溶液系列質(zhì)量濃度相同。

以上配制的LPs、LPsS和BHT溶液分別量取2 mL，加入DPPH溶液0.5 mL后混勻，置于暗處0.5 h，在波長517 nm處以蒸餾水為對照測定吸光度值A(chǔ)i。量取不同質(zhì)量濃度的LPs、LPsS和BHT溶液各2 mL，分別與相對應(yīng)的溶劑各0.5 mL混合均勻后，在波長517 nm處以蒸餾水為對照測定吸光度值A(chǔ)j。量取DPPH溶液和蒸餾水各0.5 mL混合，在波長517 nm處以蒸餾水為對照測定吸光度值A(chǔ)0。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1蘭州百合多糖硫酸化修飾的單因素試驗(yàn)

2.1.1反應(yīng)時(shí)間對百合多糖硫酸酯硫含量的影響

在反應(yīng)溫度為40℃，CSA/Py 1∶1（V/V）的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）對LPsS硫含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　硫含量隨反應(yīng)時(shí)間的影響變化Fig.1 Effect of reaction time on the sulfur content

由圖1可知，在反應(yīng)時(shí)間0.5～1.5 h的范圍內(nèi)，硫酸化反應(yīng)時(shí)間與LPsS硫含量呈正相關(guān)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1.5 h時(shí)，硫含量最高，為10.22%；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間＞1.5 h之后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，硫含量開始下降，該現(xiàn)象主要?dú)w因于多糖與酯化試劑形成的多糖硫酸酯長時(shí)間在酸性環(huán)境中所發(fā)生的水解與多糖自身的降解［14］。因此，優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間為1.5 h。

2.1.2反應(yīng)溫度對百合多糖硫酸酯硫含量的影響

在反應(yīng)時(shí)間為1.5 h、CSA/Py 1∶1（V/V）時(shí)，考察反應(yīng)溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）對LPsS硫含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　硫含量隨反應(yīng)溫度的影響變化Fig.2 Effect of reaction temperature on the sulfur content

由圖2可知，硫含量在反應(yīng)溫度30～40℃范圍內(nèi)迅速升高；當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，硫含量最高，為10.76%；當(dāng)反應(yīng)溫度＞40℃時(shí)，硫含量開始降低。這個(gè)結(jié)果表明，硫酸化反應(yīng)宜在一個(gè)相對溫和條件下進(jìn)行［15］。因此，選擇40℃作為最適反應(yīng)溫度。

2.1.3氯磺酸與吡啶配比對百合多糖硫酸酯硫含量的影響

在反應(yīng)時(shí)間為1.5 h、反應(yīng)溫度為40℃的條件下，考察CSA/Py（1∶3、1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、3∶1）體積比對LPsS硫含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　硫含量隨酯化劑配比的影響變化Fig.3 Effect of esterification reagent ratio on the sulfur content

由圖3可知，在CSA/Py為1∶3～1∶1（V/V）變化時(shí)，硫含量迅速升高；當(dāng)CSA/Py為1∶1（V/V）時(shí)，LPsS硫含量最高，為10.45%；在CSA/Py為1∶1～3∶1（V/V）時(shí)，硫含量顯著下降。這是由于氯磺酸含量過高，反應(yīng)體系處于強(qiáng)酸性條件下易產(chǎn)生板結(jié)，導(dǎo)致反應(yīng)不均勻，降低硫酸化效果［16］。因此，選擇CSA/Py1∶1（V/V）為最佳。

2.2LPsS制備工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

通過Box-Benhnhen試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對影響LPsS中硫含量（Y）的酯化劑配比（CSA/Py）、反應(yīng)溫度和時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行回歸分析，Box-Benhnhen試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　Box-Benhnhen試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box-Benhnhen experiments

2.2.2模型建立與方差分析

對表2的數(shù)據(jù)采用SAS分析軟件處理，得出回歸模型方程：Y=10.96+0.26X1+0.57X2+0.18X3+0.51X1X2-0.26X1X3+ 0.25X2X3-3.19X12-1.36X22-0.94X32，方差分析結(jié)果見表3。

表3　回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

由表3可知，作用溫度X2與二次項(xiàng)X12、X22、X32都極其顯著（P＜0.01）；作用時(shí)間X1、酯化試劑比例X3及交互項(xiàng)X1X2、X2X3達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.995 7，說明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型適合于模擬LPsS的硫含量。

2.2.3提取條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)LPsS硫含量模型作出的響應(yīng)面見圖4。

由圖4A可知，當(dāng)CSA/Py為1∶1（V/V）時(shí)，LPsS硫含量隨反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的變化而變化。然而當(dāng)溫度升高到一個(gè)臨界值時(shí)，硫含量開始緩慢減小。這和多糖硫酸酯的合成與水解有關(guān)，低溫不利于酯化反應(yīng)進(jìn)行，而高溫又會(huì)導(dǎo)致酯的水解，因此選擇一個(gè)適合的溫度，對于多糖硫酸化反應(yīng)極為重要。由圖4B可知，LPsS硫含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，在特定的時(shí)間內(nèi)，硫含量不會(huì)隨溫度的升高而增大，反應(yīng)時(shí)間延長雖然有利于酯化，但強(qiáng)酸性條件下酯化時(shí)間過長，會(huì)使部分多糖水解；反應(yīng)中CSA的含量少，酯化不完全，導(dǎo)致硫酸化多糖中的硫含量低。由圖4C可知，隨著反應(yīng)溫度逐漸升高，酯化反應(yīng)進(jìn)一步增加，與此同時(shí)多糖的降解也隨溫度升高而加劇，因此，溫度過高、酸性太強(qiáng)均不利于LPsS的酯化反應(yīng)進(jìn)行。

圖4　CSA/Py、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對百合多糖硫酸酯的硫含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between esterifying reagent ratio，reaction temperature and time on sulfur content of LPsS

2.2.4參數(shù)優(yōu)化和模型驗(yàn)證

從回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果中得出的LPs硫酸化最優(yōu)條件為：酯化劑（CSA/Py）體積比1∶1.07、反應(yīng)溫度43.28℃、反應(yīng)時(shí)間1.53h，硫含量預(yù)測值可達(dá)11.032%。采用最優(yōu)工藝條件進(jìn)行，考慮在實(shí)際生產(chǎn)和操作中的方便快捷，在驗(yàn)證最佳參數(shù)的試驗(yàn)中將參數(shù)值修訂為：酯化劑（CSA/Py）體積比1∶1、反應(yīng)溫度43℃、反應(yīng)時(shí)間1.5 h，重復(fù)3次，該條件下LPsS硫含量達(dá)到（10.98%±0.216）%，與預(yù)測值接近。所以該方案優(yōu)化的LPsS制備最佳工藝參數(shù)具有應(yīng)用參考價(jià)值。

2.3蘭州百合多糖硫酸酯的紅外光譜掃描

LPs和LPsS的紅外光譜掃描結(jié)果見圖5。

由圖5可知，LPs在波數(shù)為3426.38cm-1處為O-H伸縮振動(dòng)，波數(shù)為1 053.14 cm-1處為一級O-H的變角振動(dòng)，波數(shù)為2916.75cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)。LPsS圖譜顯示其多糖特征吸收未發(fā)生變化，而在波數(shù)為813 cm-1和1 236 cm-1處出現(xiàn)了新吸收峰。其中，波數(shù)為813 cm-1為C-O-S的伸縮振動(dòng)，波數(shù)為1236cm-1為S=O的不對稱伸縮振動(dòng)。另外，波數(shù)為2 927 cm-1處C-H吸收峰減弱，說明LPsS的-OH在一定程度上被取代。

圖5　百合多糖和百合多糖硫酸酯的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectrum of LPs and LPsS

2.4蘭州百合多糖硫酸酯的GC-MS分析

LPs和LPsS的水解衍生物GC-MS分析見圖6。

圖6　單糖混標(biāo)（A），百合多糖（B）和百合多糖硫酸酯（C）的GC-MS分析的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of monosaccharide mixed standard（A），LPs（B）and LPsS（C）analysis by GC-MS

由圖6可知，未修飾的百合多糖其單糖組成及摩爾比為甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=17∶15∶1；硫酸化修飾后百合多糖硫酸酯的單糖組成未發(fā)生改變，而其摩爾比變?yōu)楦事短恰闷咸烟恰冒肴樘?18∶14∶1，其修飾后的百合多糖摩爾比發(fā)生改變，主要是由于甘露糖與葡萄糖之間相互轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的。

2.5LPs和LPsS清除DPPH自由基能力

由圖7可知，在0.02～2.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LPs和LPsS對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)增長趨勢。在該有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LPs糖鏈結(jié)構(gòu)中引入了硫酸基，分子鏈的極性增強(qiáng)，黏度下降，溶解性增加，提高了糖鏈分子結(jié)合DPPH自由基的能力［12］，使LPsS對DPPH自由基的清除能力遠(yuǎn)高于LPs，但低于陽性對照BHT。

圖7　LPs和LPsS清除DPPH自由基的能力Fig.7 Scavenging capacity of LPs and LPsS on DPPH free radical

3　結(jié)論

采用氯磺酸-吡啶方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，確定了蘭州百合多糖硫酸酯制備最優(yōu)工藝條件：反應(yīng)溫度43℃、反應(yīng)時(shí)間1.5 h、酯化劑（氯磺酸：吡啶）體積比1∶1，該條件下可制備出硫含量可達(dá)10.98%的蘭州百合多糖酸酯。該制備方法條件溫和、簡便可行、修飾效果好、硫酸化多糖回收方便，適用于百合多糖的硫酸化修飾。

研究了蘭州百合多糖硫酸酯（LPsS）的單糖組成，與蘭州百合多糖（LPs）相比，其單糖組分未發(fā)生變化，但單糖摩爾比有所變化，甘露糖比例增加而葡萄糖比例降低。

LPs對DPPH自由基具有一定的清除能力，但經(jīng)過硫酸化修飾所得的LPsS，對DPPH自由基的清除能力大幅提升。因此LPsS具有較好的抗氧化活性，具有一定的食品藥品行業(yè)功能性開發(fā)利用的價(jià)值。

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HUANG Yulong1，2，3，ZHAO Baotang2，3，SONG Shen2，3，LI Weiqi1，PANG Zhongcun1，ZHANG Ji2，3*
（1.Agricultural Product Storage and Processing Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China；3.Bioactive Products Engineering Research Center for Gansu Distinctive Plants，Lanzhou 730070，China）

Lily polysaccharide（LPs）was extracted from Lanzhou lily and lily polysaccharide sulfated（LPsS）was prepared by by chlorosulfonic acid-pyridine.Using the sulfur content in LPsS as evaluation indexes，based on response surface methodology（RSM），the combination of three factors：reaction temperature，time and esterification reagent ratio（chlorosulfonic acid：pyridine）were optimized.The optimum conditions were obtained as followed：reaction time 1.5 h，temperature 43℃and esterification reagent（chlorosulfonic acid：pyridine）ratio 1∶1（V/V）.Under the condition，the sulfur content in LPsS was up to 10.98%.The fourier transform-infrared spectrum（FT-IR）scanning showed that that new absorption peak appeared at 1 236 cm-1and 813 cm-1，which indicated that the sulfation was successful.Its monosaccharide composition was analysed by GC-MS，which showed that LPsS was composed of mannose，glucose and galactose，and the molar ratio was 18∶14∶1.Thein vitroantioxidant activity tests showed that LPsS had good scavenging capacity on DPPH·，and its antioxidant activity had improved than the unesterified ones before.

Lanzhou lily；polysaccharides；sulfation；antioxidant activity

O658

0254-5071（2016）06-0122-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.026

2016-03-10

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD36B04）；甘肅省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目“蘭州百合產(chǎn)業(yè)能力提升關(guān)鍵技術(shù)的集成與示范”

黃玉龍（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏加工。

張繼（1963-），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。