糯米酒釀造酵母的優(yōu)選

楊子琳，伍時(shí)華，趙東玲，黃翠姬，楊麗峰

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

糯米酒釀造酵母的優(yōu)選

楊子琳，伍時(shí)華，趙東玲*，黃翠姬，楊麗峰

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

為了優(yōu)選酵母菌種，改善液態(tài)發(fā)酵糯米酒的口感，采用釀酒酵母SJ4、扣囊復(fù)膜酵母3-1Y、粟酒裂殖酵母SP單菌種發(fā)酵及釀酒酵母/扣囊復(fù)膜酵母（1∶1）、釀酒酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1）、釀酒酵母/扣囊復(fù)膜酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1∶1）混合菌種發(fā)酵方式釀造糯米酒，通過曲線下面積（AUC）、主成分分析（PCA）對(duì)糯米酒風(fēng)味物質(zhì)及理化指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，扣囊復(fù)膜酵母3-1Y與釀酒酵母SJ4（1∶1）混合發(fā)酵時(shí)AUC值最小，為9 371，相對(duì)貢獻(xiàn)值最大，為3.448 7；糯米酒中總酸和氨基酸態(tài)氮含量有所提高，產(chǎn)品共檢測(cè)了12種風(fēng)味物質(zhì)，總酯含量有增加，甲醇及高級(jí)醇有所降低，感官評(píng)分為7分，最適用于糯米酒的發(fā)酵。

糯米酒；酵母菌；優(yōu)選；主成分分析；風(fēng)味物質(zhì)

糯米酒富含氨基酸、多糖、維生素等營養(yǎng)成分［1］，因液態(tài)釀造糯米酒能有效縮短發(fā)酵周期［2］，解決了傳統(tǒng)發(fā)酵勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)周期長的問題，成為工藝研究的重點(diǎn)。酵母是酒曲中主要的發(fā)酵菌，酵母菌種的優(yōu)劣直接影響糯米酒的品質(zhì)［3］，以往研究的側(cè)重點(diǎn)多是從糯米酒或是酒曲中篩選酵母菌［4］，或是為了保證糯米酒中適當(dāng)?shù)木凭?，片面篩選發(fā)酵能力較強(qiáng)的釀酒酵母，所得糯米酒口味淡薄，風(fēng)味欠佳［5-6］。近年來有關(guān)產(chǎn)香能力較強(qiáng)的非釀酒酵母的研究逐年增多，釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵中酵母之間的相互作用和風(fēng)味物質(zhì)的差異分析也成為研究的熱點(diǎn)［7］。

為了得到適合于糯米酒液態(tài)發(fā)酵的酵母菌，改善糯米酒的口感，本試驗(yàn)選取米根霉8-3M作為唯一的糖化霉菌，采用釀酒酵母SJ4、扣囊復(fù)膜酵母3-1Y、粟酒裂殖酵母SP單菌種發(fā)酵及釀酒酵母/扣囊復(fù)膜酵母（1∶1）、釀酒酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1）、釀酒酵母/扣囊復(fù)膜酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1∶1）混合菌種發(fā)酵方式釀造糯米酒，采用曲線下面積（area under curve，AUC）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等分析手段比較各理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)的差異，優(yōu)選出適用于糯米酒液態(tài)發(fā)酵的酵母菌株，為糯米酒工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料與試劑

糯米：市售。甲醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；高溫α-淀粉酶（20 000 U/mL）：山東隆大生物工程有限公司；無水乙醇（色譜純）：上海展云化工有限公司；白酒成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（色譜純）：貴州省計(jì)量測(cè)試院。

1.1.2發(fā)酵菌株

米根霉（Rhizopus oryzae）8-3M、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）3-1Y、栗酒裂殖酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）SP、釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）SJ4：本課題組實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母菌種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然，在115℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

霉菌種子培養(yǎng)基：200 g糯米加水浸泡4 h，將浸泡好的糯米瀝干后置于水浴鍋中，加水至剛剛浸沒糯米，待溫度上升至60℃時(shí)以10 U/g的接入量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃水浴保溫2 h，冷卻后過濾，加水定容至1 L，分裝成50 mL/瓶，115℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

糯米液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：按照50 g/瓶的量，稱取糯米加水浸泡4 h后瀝干，加水至剛剛浸沒糯米，置于水浴鍋中，待溫度上升至60℃時(shí)以10 U/g的接入量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃保溫2 h，冷卻后加水定量至200 g/瓶，打漿，115℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2儀器與設(shè)備

LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-TB標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)：蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWY-2112恒溫調(diào)速搖床柜：上海智誠分析儀器制造有限公司；SGD-IV還原糖測(cè)定儀：山東省科學(xué)院生物研究所；GC7890-Ⅱ氣相色譜儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液和液態(tài)曲的制備

霉菌孢子、酵母菌懸浮液的制備方法見文獻(xiàn)［8］。

霉菌液態(tài)曲制備：將霉菌孢子懸浮液，按105個(gè)/mL接種量接入霉菌種子培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min培養(yǎng)32 h即為霉菌液態(tài)曲。

1.3.2分析檢測(cè)方法

（1）理化成分分析

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定參照國標(biāo)GB/T 13662—2008《黃酒》［9］的方法進(jìn)行。

（2）風(fēng)味物質(zhì)分析

采用氣相色譜法（內(nèi)標(biāo)法）。氣相色譜條件：TM-930白酒專用毛細(xì)管柱（25 m×0.53 mm×0.1 μm）；載氣為氮?dú)猓∟2）；采用程序升溫：起始溫度45℃保持3 min，以3.5℃/min上升至62℃，以1℃/min上升至67℃，再以25℃/min上升至200℃保持6 min；進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度220℃；采樣結(jié)束時(shí)間30 min。內(nèi)標(biāo)物為乙酸丁酯，含量為34.17 mg/100 mL。1.3.3混合發(fā)酵接種方式

非釀酒酵母SP、3-1Y與釀酒酵母SJ4混合發(fā)酵采用順序接種方式：先分別將粟酒裂殖酵母SP、扣囊復(fù)膜酵母3-1Y按1∶1的混合比接入滅菌后的液態(tài)糯米發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床120 r/min、28℃條件下培養(yǎng)24 h，再以與各非釀酒酵母相同的接種量接入釀酒酵母SJ4（總接種量為106個(gè)/mL），搖床120 r/min，28℃的培養(yǎng)條件繼續(xù)發(fā)酵2.7 d，糯米酒中還原糖含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束。

1.3.4糯米酒釀造工藝流程

糯米→浸米→高溫液化→打漿分裝→滅菌→接種霉菌→糖化→接種酵母→酒精發(fā)酵→酒醪分離→巴氏滅菌→糯米酒

操作要點(diǎn)：

（1）浸米：常溫浸米4 h以上，至米粒能用手指捻碎。（2）高溫液化：用60℃溫水浸沒糯米，以10 U/g的量加入耐高溫α-淀粉酶，水浴鍋中90～95℃保溫2 h。

（3）打漿：按照料水比1∶3（g∶mL）在打漿機(jī)中低速打漿5 min。

（4）分裝滅菌：以200 g/瓶的量分裝糯米漿，115℃蒸汽滅菌30 min。

（5）接種霉菌糖化：將8-3M液態(tài)曲全部接入滅菌冷卻后的糯米發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、搖床120 r/min糖化36 h。

（6）接種酵母發(fā)酵：將酵母菌懸浮液按106個(gè)/mL的總接種量接入糖化好的糯米發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、搖床120r/min的條件下發(fā)酵。

（7）酒醪分離：4 000 r/min離心糯米酒發(fā)酵液5 min。（8）巴氏滅菌：將糯米酒液70℃滅菌30 min后急速冷卻至4℃。

1.3.5統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel、Origin、Graphpad Prism 5和主成分分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒理化性質(zhì)的影響

表1　單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒理化指標(biāo)的影響Table 1 Effects of single and mixed yeasts fermentation on physicochemical indexes of glutinous rice wine

單一及混合酵母發(fā)酵糯米酒的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可知，單一和混合酵母發(fā)酵糯米酒的理化性質(zhì)差異顯著（P＜0.05）。與SJ4單菌種發(fā)酵相比，3-1Y/SJ4（1∶1）與SP/SJ4（1∶1）混合發(fā)酵糯米酒的酒精度與之相當(dāng)，總酸含量卻分別提高了11.7%、27.8%，氨基酸態(tài)氮含量亦分別提高了19.8%、34.8%，糯米酒中總酸和氨基酸態(tài)氮含量的升高標(biāo)志著糯米酒品質(zhì)的提高［10-11］。因此釀酒酵母SJ4與非釀酒酵母3-1Y、SP的兩兩混合（1∶1）發(fā)酵，在保證產(chǎn)品酒精度的同時(shí)能提升糯米酒的品質(zhì)。

2.2單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糖代謝的影響

單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒還原糖含量的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，還原糖含量在發(fā)酵時(shí)間0～9 h，在根霉8-3M的糖化作用下逐漸升高，后來隨著酵母對(duì)還原糖的吸收和利用又逐漸降低。單一和混合酵母發(fā)酵對(duì)還原糖的消耗速度差異性顯著（P＜0.05），得出不同屬酵母在發(fā)酵過程中對(duì)還原糖的吸收速率不同。

圖1　單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒還原糖含量的影響Fig.1 Effects of single and mixed yeasts fermentation on reducing sugar content of glutinous rice wine

曲線下面積法可以評(píng)價(jià)整體的耗糖快慢，殘還原糖曲線下面積越小，耗糖越快［12］。單一及混合酵母發(fā)酵糯米酒的還原糖變化曲線下面積結(jié)果表2。

表2　單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒還原糖曲線下面積的影響Table 2 Effects of single and mixed yeasts fermentation on reducing sugar area under curve of glutinous rice wine

由表2可知，AUCSJ4＜AUC3-1Y/SJ4＜AUCSP/SJ4＜AUCSP/3-1Y/SJ4＜AUCSP＜AUC3-1Y，故3種不同屬酵母單菌種發(fā)酵時(shí)，SJ4消耗還原糖的速度最快，其次是粟酒裂殖酵母SP，扣囊復(fù)膜酵母3-1Y最慢。當(dāng)2種非釀酒酵母分別與SJ4混合發(fā)酵的耗糖速度與其單菌種發(fā)酵時(shí)相比明顯提高：AUC3-1Y/SJ4與AUC3-1Y相比降低了59.2%，AUCSP/SJ4與AUCSP相比降低了32.9%。但酵母3-1Y/SP/SJ4（1∶1）混合發(fā)酵的耗糖速度低于3-1Y/SJ4（1∶1）和SP/SJ4（1∶1）混合發(fā)酵，可能是因?yàn)?種非釀酒酵母的過度增殖與SJ4產(chǎn)生競(jìng)爭性抑制作用［13-14］，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長。3種混菌發(fā)酵方式中3-1Y/SJ4（1∶1）混合發(fā)酵的AUC值最小為9 371，表明其耗糖快，發(fā)酵時(shí)間短。結(jié)果表明，釀酒酵母SJ4能快速消耗還原糖轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭?，具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力。利用SJ4這種發(fā)酵特性將其與非釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，與非釀酒酵母單菌種發(fā)酵相比，能夠提高發(fā)酵過程中還原糖的消耗速率，改善非釀酒酵母單菌種發(fā)酵時(shí)發(fā)酵時(shí)間長的問題。

2.3單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

混標(biāo)、單一及混合酵母發(fā)酵糯米酒樣品中10種主要的風(fēng)味物質(zhì)在1.3.2的氣相條件下進(jìn)行分析，氣相色譜圖見圖2，各風(fēng)味物質(zhì)含量結(jié)果見表3。

圖2　混標(biāo)（A）及酵母3-1Y與SJ4混合（1∶1）發(fā)酵糯米酒樣品（B）的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of mixed standards（A）and glutinous rice wine sample（B）by yeast 3-1Y：yeast SJ4（1∶1）mixed fermentation

醇、酯類風(fēng)味物質(zhì)是酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)白酒的風(fēng)味具有重要的影響［15］。由表3可知，SJ4與SP單菌種發(fā)酵時(shí)甲醇含量依次為（417.4±1.7）mg/L、（99.2±0.6）mg/L，異丁醇含量依次為（321.3±2.3）mg/L、（334.5±3.1）mg/L。甲醇能刺激視神經(jīng)，含量過高可致人失明，異丁醇能夠引起飲用者的頭痛，含量過高會(huì)影響酒的品質(zhì)［16］。而酵母3-1Y單菌種發(fā)酵時(shí)發(fā)酵能力弱，糯米酒中不僅酒精度低，高級(jí)醇含量也很低。故3種不同屬酵母的單菌種發(fā)酵均不適用于糯米酒的液態(tài)釀造。

與SJ4單菌種發(fā)酵相比，混合發(fā)酵均能使糯米酒中甲醇含量明顯降低，這對(duì)改善糯米酒的品質(zhì)有重要作用。3-1Y/SJ4（1∶1）、SP/SJ4（1∶1）、SP/3-1Y/SJ4（1∶1∶1）混合發(fā)酵中高級(jí)醇含量降低分別為SJ4單菌種發(fā)酵時(shí)的7.61%、29.2%、 32%，總酯含量升高是SJ4單菌種發(fā)酵的3.47倍、3.21倍、5.95倍。結(jié)果表明，混合菌種發(fā)酵能使糯米酒中高級(jí)醇含量降低、酯類物質(zhì)含量升高，這對(duì)改善糯米酒的風(fēng)味和口感有重要的意義。

表3　單一及混合酵母發(fā)酵對(duì)糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)含量的影響Table 3 Effects of single and mixed yeasts fermentation on flavor compounds contents in glutinous rice wine mg/L

2.4主成分分析法確定最佳酵母組合

主成分分析（PCA）也稱主分量分析，該方法利用降維的思想，將多指標(biāo)的變量通過線性變換、計(jì)算特征值等轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法［17］。單一及混合酵母發(fā)酵所得糯米酒中的10種風(fēng)味物質(zhì)含量，在Minitab15分析軟件中運(yùn)用統(tǒng)計(jì)菜單中的主成分分析過程進(jìn)行分析，得到特征值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率、載荷圖（見圖3）和分值圖（見圖4）。由圖3可知，第一分量（PC1）所占比率為48.9%，第二分量（PC2）所占比率為31%，兩個(gè)分量的累計(jì)貢獻(xiàn)率為79.9%，故此分析結(jié)果可靠；對(duì)第一分量影響較大的依次為異丁醇、仲丁醇、正丁醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、甲醇，對(duì)第二分量影響較大的依次為丁酸乙酯、異戊醇、正丙醇。

圖3　單一及混合酵母發(fā)酵糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)載荷圖Fig.3 Load diagram of flavor compounds in glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

圖4　單一及混合酵母發(fā)酵糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)分值圖Fig.4 Score diagram of flavor compounds in glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

由圖4可知，SJ4、SP、3-1Y三種屬酵母混合發(fā)酵的PC1值最高為2.821 5，SJ4與3-1Y混合發(fā)酵的PC2值最高為2.60369。計(jì)算2種發(fā)酵方式的相對(duì)貢獻(xiàn)率（PC1×PC2）大小，SJ4與3-1Y混合發(fā)酵的貢獻(xiàn)率大于SJ4、SP、3-1Y三種屬酵母混合發(fā)酵，因此確定SJ4與3-1Y的混合發(fā)酵是最佳酵母屬組合方式。

2.5不同酵母釀造糯米酒的感官評(píng)分

將不同酵母釀造的糯米酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，不同酵母釀造糯米酒的感官評(píng)分由大到小依次為：SJ4/3-1Y＞SJ4/SP/3-1Y＞SJ4＞3-1Y＞SJ4/SP＞SP。其中SP單菌種發(fā)酵的糯米酒中因混雜較明顯的臭味導(dǎo)致感官評(píng)分最低僅為2.3分，3-1Y/SJ4混合發(fā)酵酒香氣飽滿、口味清爽，感官評(píng)分最高為7分（滿分10分計(jì)）。以上結(jié)果與主成分分析所得結(jié)果基本一致，說明主成分分析法在一定程度上適用于液態(tài)發(fā)酵糯米酒酵母菌種優(yōu)選。

圖5　單一及混合酵母發(fā)酵糯米酒的感官評(píng)分Fig.5 Sensory evaluation of glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)2種非釀酒酵母（扣囊復(fù)膜酵母屬3-1Y、粟酒裂殖酵母屬SP）和釀酒酵母SJ4進(jìn)行了單一及混合菌種發(fā)酵研究。結(jié)果表明，不同屬酵母之間發(fā)酵特性及代謝產(chǎn)物含量差異巨大：釀酒酵母與非釀酒酵母分別有很強(qiáng)的耗糖和產(chǎn)酯能力。釀酒酵母和非釀酒酵母的混合發(fā)酵，在保證發(fā)酵效率的同時(shí)能使糯米酒中酯類物質(zhì)含量增加，低級(jí)醇含量降低。利用主成分分析法（PCA）對(duì)單菌種及混合菌種發(fā)酵糯米酒的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，得出酵母3-1Y+SJ4混合發(fā)酵的相對(duì)貢獻(xiàn)值最大為3.448 7，糯米酒中總酸和氨基酸態(tài)氮含量有所提高，產(chǎn)品共檢測(cè)了12種風(fēng)味物質(zhì)，總酯含量有增加，甲醇及高級(jí)醇有所降低，感官評(píng)分為7分（滿分10分），最適用于糯米酒的發(fā)酵。

通過研究不同屬酵母單菌種及混合菌種在液態(tài)發(fā)酵糯米酒中的發(fā)酵特性，并用主成分分析法分析糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)含量從而優(yōu)選出最佳釀造菌種，以上研究方法為大規(guī)模篩選最佳工業(yè)酵母菌株提供參考依據(jù)。

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YANG Zilin，WU Shihua，ZHAO Dongling*，HUANG Cuiji，YANG Lifeng
（College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

In order to select excellent yeast strains and improve the taste of glutinous rice wine produced by liquid fermentation，the glutinous rice wine was brewed by single yeast（Sacchromyces cerevisiaeSJ4，Saccharomycopsis fibuligera3-1Y，orSchizosaccharomyces pombeSP）and multi-yeast（S.cerevisiaeSJ4∶S.fibuligera3-1Y（1∶1），S.cerevisiae SJ4：S.pombe SP（1∶1），or S.cerevisiae SJ4∶S.fibuligera3-1Y∶S.pombeSP（1∶1∶1））fermentation method.The flavor compounds and physicochemical indexes of glutinous rice wine were analyzed by area under the curve（AUC）and principle component analysis（PCA）.The results showed that at the mixed fermentation ofS.cerevisiaeSJ4∶S.fibuligera3-1Y∶S.pombeSP（1∶1∶1），the AUC value（9 371）was the least and the relative contribution value（3.448 7）was the largest.The content of total acid and amino acid nitrogen in glutinous rice wine were increased，and 12 kinds of flavor compounds in the wine were detected，the total esters content was increased，methanol and higher alcohols were decreased.The sensory score was 7，which was the most suitable for the glutinous rice wine fermentation.

glutinous rice wine；yeast；selection；principle component analysis；flavor compounds

TS261.1

0254-5071（2016）06-0060-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.013

2016-03-09

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目（桂科攻0782003-2）

楊子琳（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榇x控制發(fā)酵。

趙東玲（1965-），男，工程師，博士，研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>