麥角甾醇含量檢測(cè)分析柑橘真菌污染程度的方法研究

唐艷斌，段曉艷，王麗娟，陳頔，楊蕾

（1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司檢測(cè)事業(yè)部，云南昆明650106；3.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650031）

麥角甾醇含量檢測(cè)分析柑橘真菌污染程度的方法研究

唐艷斌1，段曉艷3，王麗娟1，陳頔1，楊蕾2*

（1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司檢測(cè)事業(yè)部，云南昆明650106；3.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650031）

建立了以7-去氫膽固醇為內(nèi)標(biāo)，氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法同步選擇離子檢測(cè)/全掃描的定量檢測(cè)方法，并采用該方法檢測(cè)了不同程度霉變的柑橘中的麥角甾醇含量，確定柑橘的真菌污染程度。結(jié)果表明，麥角甾醇在5～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.999 9）；檢出限和定量限分別為3.12 mg/kg、10.39 mg/kg，加標(biāo)回收率范圍在91.33%～100.14%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04～0.49%、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%。該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，麥角甾醇含量可作為柑橘早期受真菌侵染的重要指標(biāo)。

麥角甾醇；柑橘；真菌侵染；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和保健作用［1］。我國(guó)柑橘的產(chǎn)銷(xiāo)量為世界第一，以鮮果銷(xiāo)售為主，而柑橘的生產(chǎn)地較為分散，且離城市較遠(yuǎn)，成熟期相對(duì)集中。因此，柑橘采收后需要經(jīng)過(guò)一定的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸周期，在這一段時(shí)期，柑橘鮮果的品質(zhì)受到諸多因素的影響而惡化，如柑橘果肉組織的生理變化失調(diào)或衰老、采收、包裝或運(yùn)輸過(guò)程中的機(jī)械損傷以及病原微生物的侵染等。水果的采后病害導(dǎo)致巨大損失是一個(gè)全球性的問(wèn)題，其中微生物的侵染是其中最主要的原因［2］。柑橘貯藏病害主要由真菌引起，由意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病和指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病的腐爛最為嚴(yán)重［3-4］。每年因病害造成柑橘腐爛損失率高達(dá)10%～30%，嚴(yán)重的竟達(dá)到60%以上［2］。因此，對(duì)柑橘受真菌侵染情況進(jìn)行測(cè)定，采取有效措施進(jìn)行病害的防治是非常有必要的。

當(dāng)前，對(duì)柑橘是否受真菌侵染的檢測(cè)一般采用肉眼觀察是否長(zhǎng)出真菌菌絲體、鼻聞是否出現(xiàn)霉味等感官手段［5-9］，或者通過(guò)對(duì)真菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基上計(jì)算菌落數(shù)量來(lái)表征［10-11］。人工方法較大的依賴于人的感官判斷，而真菌菌落計(jì)數(shù)需要培養(yǎng)5 d以上，耗時(shí)較長(zhǎng)。同時(shí)，這些方法都無(wú)法對(duì)柑橘鮮果早期受真菌侵染進(jìn)行判定。

麥角甾醇，別名24β-甲基膽固醇-5，7烯-3β-烴基，是存在于真菌細(xì)胞膜中的一種固醇類(lèi)化合物，大多以自由態(tài)存在于真菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中，少量酯化于脂肪酸中。在高等植物中不存在麥角甾醇，其良好的特異性和穩(wěn)定性可以有效地表征高等植物中真菌的生物量，反映植物受真菌侵染的程度［12］。目前，麥角甾醇檢測(cè)方法有高效液相色譜法［13-17］、紫外可見(jiàn)分光光度法［17］以及質(zhì)譜法［18］等。

本研究通過(guò)溶劑加熱超聲波萃取，將柑橘中的麥角甾醇提取、純化、濃縮富集后進(jìn)行衍生化處理，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀，在選擇離子模式下對(duì)衍生化后的麥角甾醇進(jìn)行定量測(cè)定，并對(duì)所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)麥角甾醇含量的變化反映柑橘受真菌侵染情況，以達(dá)到有效監(jiān)控柑橘早期霉變的目的，從而保證柑橘質(zhì)量及安全。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

柑橘：市售；麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；7-去氫膽固醇（內(nèi)標(biāo)）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）（純度≥99.0%）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；甲醇（色譜純）：迪馬科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：西隴化工股份有限公司分析純重蒸；正己烷（色譜純）：美國(guó)默克公司。

1.2儀器與設(shè)備

AE200型電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；6890N氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；S900H超聲波清洗機(jī)：德國(guó)Elma公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。依次用二氯甲烷稀釋麥角甾醇儲(chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

準(zhǔn)確稱取7-去氫膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL［21］，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2樣品前處理

將柑橘樣品于105℃烘箱中烘干，經(jīng)旋風(fēng)磨粉碎過(guò)60目篩后備用。準(zhǔn)確稱取2.00g柑橘樣品，置于50mL具蓋玻璃瓶中，加入20 mL重蒸后的二氯甲烷，旋緊瓶蓋，于35℃條件下超聲（超聲功率100 W、頻率50～60 Hz）萃取1 h后靜置30 min，取上層清液，用有機(jī)濾頭過(guò)濾后取1.0 mL置于2 mL色譜瓶中，加入100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL 7-去氫膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液后，在40℃水浴中揮干溶劑，加入300 μL BSTFA衍生化試劑，并于80℃條件下衍生化45 min，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫方式：初始溫度100℃，保持1 min，以30℃/min的升溫速率升至280℃，保持24 min，總運(yùn)行時(shí)間31 min。載氣：氦氣（He）；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度260℃，進(jìn)樣量2 μL，分流比10：1。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，質(zhì)譜掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（selectedion monitoring，SIM），掃描范圍50～550 m/z，溶劑延遲10 min。

1.3.4定性定量的方法

定性方法：通過(guò)質(zhì)譜在50～550 m/z范圍內(nèi)全掃描麥角甾醇特征離子和麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間定性。

定量方法：以麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法定量。

1.3.5萃取條件參數(shù)的選擇和優(yōu)化

選取對(duì)超聲萃取影響較大的萃取溶劑、萃取溫度和萃取時(shí)間3個(gè)參數(shù)，分別選擇用甲醇、二氯甲烷、正己烷作為萃取溶劑；選擇30℃、35℃、40℃、45℃作為萃取溫度水平；選擇30 min、45 min、60 min、120 min作為萃取時(shí)間水平，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，獲取最佳萃取條件。

1.3.6麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取質(zhì)量濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的1.0mL麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液與100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于2.0 mL色譜瓶中。在40℃水浴中揮干溶劑后加入300 μL BSTFA衍生試劑，80℃條件下衍生45 min，備用。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定麥角甾醇的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和GC-MS分析，用峰面積對(duì)其相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析，得到麥角甾醇和內(nèi)標(biāo)的積分峰面積，用麥角甾醇的積分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）作為縱坐標(biāo)，麥角甾醇質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度比值（X）作為橫坐標(biāo)，建立麥角甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7方法學(xué)評(píng)價(jià)

應(yīng)用方法線性范圍、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）、加標(biāo)回收率、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性對(duì)建立的柑橘中麥角甾醇含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。

1.3.8霉變柑橘中麥角甾醇的測(cè)定方法

（1）不同貯存條件柑橘樣品中麥角甾醇含量測(cè)定

選取20個(gè)柑橘鮮果，隨機(jī)選取其中10個(gè)放置于相對(duì)濕度（relative humidity，RH）為80%、溫度28℃環(huán)境條件下，以加速真菌的生長(zhǎng)增殖；剩余的10個(gè)放置于相對(duì)濕度20%、溫度28℃環(huán)境條件下避光保存，15 d后分別對(duì)不同貯存條件下的柑橘樣品進(jìn)行麥角甾醇含量的測(cè)定。

（2）真菌侵染不同程度柑橘樣品中麥角甾醇含量測(cè)定

選取10個(gè)柑橘鮮果，放置于RH為80%、溫度28℃環(huán)境條件下，連續(xù)培養(yǎng)18 d。每3 d取樣一次，對(duì)不同霉變程度的柑橘樣品進(jìn)行麥角甾醇含量的測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1萃取條件參數(shù)的選擇和優(yōu)化

通過(guò)選取對(duì)超聲萃取影響較大的萃取溶劑、萃取溫度和萃取時(shí)間3個(gè)參數(shù)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以麥角甾醇在GC-MS分析的響應(yīng)強(qiáng)度（峰面積）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行萃取條件參數(shù)和水平的優(yōu)化。萃取溶劑、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)麥角甾醇萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表1、表2及圖1。

表1　不同萃取溶劑對(duì)麥角甾醇萃取效果的影響Table1 Effect of different extraction solvent on ergosterol extraction

表2　不同萃取溫度對(duì)麥角甾醇萃取效果的影響Table 2 Effect of different extraction temperature on ergosterol extraction

圖1　不同萃取時(shí)間對(duì)麥角甾醇萃取效果的影響Fig.1 Effect of different extraction time on ergosterol extraction

由表1可知，以二氯甲烷為萃取溶劑，35℃萃取溫度下萃取30 min時(shí)，麥角甾醇峰面積最大，為48 125，獲得較好的萃取效果；由表2可知，以二氯甲烷為萃取溶劑，在不同萃取溫度下萃取30 min時(shí)，35℃萃取溫度下，麥角甾醇峰面積最大，為47 908，獲得較好的萃取效果；由圖1可知，以二氯甲烷為萃取溶劑，35℃萃取溫度下萃取時(shí)，60 min后可以達(dá)到萃取平衡。因此，最佳萃取條件為：二氯甲烷為萃取溶劑，在35℃萃取溫度條件下萃取60 min。

2.2方法評(píng)價(jià)

2.2.1線性回歸方程、檢出限和定量限

按照1.3.1配制麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL7-去氫膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液后，在40℃水浴中揮干溶劑，加入300 μL BSTFA衍生化試劑，并于80℃條件下衍生化45min，進(jìn)行GC-MS分析。以麥角甾醇峰面積與7-去氫膽固醇內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，其相應(yīng)質(zhì)量濃度比值（X）為縱坐標(biāo)，繪制麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2　麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ergosterol

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=165.3X，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，結(jié)果表明，在5～200μg/mL質(zhì)量濃度范圍，二者線性關(guān)系良好。方法的LOD和LOQ以最低濃度點(diǎn)加入柑橘樣品，重復(fù)進(jìn)樣10次，由測(cè)得的質(zhì)量濃度值統(tǒng)計(jì)出標(biāo)準(zhǔn)偏差，LOD以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差、LOQ以10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差求得，分別為3.12 mg/kg和10.39 mg/kg。

2.2.2加標(biāo)回收率

方法的回收率實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)加標(biāo)法，在樣品中加入麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述分析步驟操作，測(cè)得本底、低、中、高加標(biāo)4個(gè)水平下的各麥角甾醇的含量，每個(gè)水平平行測(cè)定3次，計(jì)算方法回收率［（加標(biāo)測(cè)定值-本底值/加標(biāo)量）］及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of standard recovery rate tests

由表3可知，麥角甾醇的平均回收率在91.33%～100.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.09%～1.31%。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較好，能夠滿足定量分析要求。

2.2.3方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性

采用1個(gè)霉變柑橘樣品，每天平行測(cè)定6次麥角甾醇含量，連續(xù)測(cè)定3 d，分別計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3），結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%～0.49%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%，均在1%以內(nèi)，滿足檢測(cè)需求。

表4　重復(fù)性和再現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeatability and reproducibility tests

2.3麥角甾醇含量檢測(cè)方法在柑橘中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

2.3.1不同貯存條件下柑橘樣品中麥角甾醇含量的測(cè)定

按照1.3.8中兩種不同貯存條件處理柑橘樣品，15 d后，測(cè)定其柑橘樣品中麥角甾醇含量結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　不同條件下貯存柑橘樣品中麥角甾醇含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of ergosterol content in fungal-contaminated citrus samples under different storage conditions

由表5可知，在相對(duì)濕度為80%環(huán)境條件下貯存的柑橘樣品中測(cè)定出麥角甾醇的含量為13.79～68.42 mg/kg，而正常柑橘樣品中麥角甾醇的含量為1.342～2.80 mg/kg，受到真菌侵染的柑橘樣品中麥角甾醇含量比正常樣品中高出10倍以上。通過(guò)肉眼觀察，存放在RH80%環(huán)境條件下的10個(gè)柑橘表現(xiàn)出不同程度的霉變；而存放在RH 20%、避光環(huán)境條件下的10個(gè)柑橘外觀正常。結(jié)果表明，當(dāng)保藏條件不利于真菌生長(zhǎng)的時(shí)候，菌絲體或孢子處于潛伏狀態(tài)，停止活動(dòng)，麥角甾醇的含量處于穩(wěn)定的水平，但是當(dāng)保藏條件處于高溫濕潤(rùn)狀態(tài)，則有利于真菌生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)，菌絲體生長(zhǎng)，麥角甾醇的含量遠(yuǎn)高于干燥保藏條件下［19］。因此，可以通過(guò)應(yīng)用麥角甾醇含量反映柑橘鮮果是否受到霉菌侵染，快速有效的發(fā)現(xiàn)鮮果真菌危害，及時(shí)采取防治措施。

2.3.2真菌侵染程度不同的柑橘樣品測(cè)定

對(duì)10個(gè)不同真菌侵染程度柑橘樣品進(jìn)行麥角甾醇含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　不同真菌侵染程度的柑橘樣品中麥角甾醇含量變化趨勢(shì)Fig.3 Variation trend of ergosterol contents in fungal-contaminated citrus samples with different levels

由圖3可知，隨著受到真菌侵染時(shí)間的增長(zhǎng)，麥角甾醇的含量逐漸增加，在第18天時(shí)達(dá)到最大值。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)在第12天時(shí)出現(xiàn)一個(gè)拐點(diǎn)，增加的速度加快；15d后急劇增加，在3 d內(nèi)迅速增加到其實(shí)濃度的30倍以上。因此，通過(guò)麥角甾醇含量的變化可以判斷柑橘受真菌侵染的時(shí)間。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了采用溶劑加熱超聲波萃取-衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定柑橘中麥角甾醇含量的方法，并以麥角甾醇含量的變化來(lái)判斷柑橘受真菌侵染情況。得出如下主要結(jié)論：

（1）對(duì)萃取影響較大的萃取溶劑、萃取溫度和萃取時(shí)間3個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，以二氯甲烷為萃取溶劑，35℃萃取溫度條件下萃取60 min能達(dá)到較好的萃取效果。

（2）麥角甾醇在5～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9999）；檢出限和定量限分別為3.12mg/kg、10.39 mg/kg，加標(biāo)回收率范圍在91.33%～100.14%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%～0.49%、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%。該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確。

（3）對(duì)不同霉變程度的柑橘樣品中麥角甾醇進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示新鮮健康的柑橘中麥角甾醇含量極低，隨著霉變程度的加深，麥角甾醇含量增加，麥角甾醇含量可作為反映柑橘早期受真菌侵染的重要指標(biāo)。

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TANG Yanbin1，DUAN Xiaoyan3，WANG Lijuan1，CHEN Di1，YANG Lei2*
（1.National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China，Beijing 100050，China；2.Testing Centre，Yunnan Comtestor Co.，Ltd.，Kunming 650106，China；3.School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650092，China）

A quantitative determination method by GC-MS with synchronize seletion ion monitoring/full scan mode was established by using 7-dehydrocholesterlo as internal standard.The contents of ergosterol in fungal-contaminated citrus with different levels were determined.The results showed that the calibration curve exhibited good linearity with a correlation coefficientR2of 0.999 9 in the range of 5-200 μg/ml.The limit of detection（LOD）and limit of quantitation（LOQ）were 3.12 mg/kg and 10.39 mg/kg，respectively.The adding standard recovery rate ranged from 91.33%to 100.14%with the intra-day relative standard deviation of 0.04～0.49%and inter-day relative standard deviation 0.22%.The method was simple，sensitive and accurate，and ergosterol contents could be as an important indicator in early fungal-contaminated citrus.

ergosterol；citrus；fungal contamination；GC-MS

O657.63

0254-5071（2016）06-0050-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.011

2016-04-29

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（2010AA023004）

唐艷斌（1983-），女，助理研究員，博士，主要從事食品生物術(shù)及營(yíng)養(yǎng)與健康研究工作。

楊蕾（1983-），女，工程師，博士，主要從事食品分析檢測(cè)研究工作。