納豆激酶的制備及其改性研究進(jìn)展

季順利，蔡俊秀，崔青，錢炳俊，姚曉敏，張建華*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.福建省湄州灣職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋與環(huán)境學(xué)院，福建莆田351254）

納豆激酶的制備及其改性研究進(jìn)展

季順利1，蔡俊秀2，崔青1，錢炳俊1，姚曉敏1，張建華1*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.福建省湄州灣職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋與環(huán)境學(xué)院，福建莆田351254）

納豆激酶（EC 3.4.21.62）是納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）發(fā)酵產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，在體外和體內(nèi)均具有強(qiáng)烈的纖維蛋白溶解活性。提高納豆激酶的產(chǎn)量及其穩(wěn)定性和經(jīng)口服后的生物利用度具有重要的研究意義，該文綜述了野生菌、基因工程菌及動(dòng)植物細(xì)胞發(fā)酵/培養(yǎng)制備納豆激酶的方法，及其穩(wěn)定性和生物利用度等性能改善方面的研究進(jìn)展，并對(duì)納豆激酶研究的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

納豆激酶；制備；改性

納豆激酶（nattokinase，NK）EC 3.4.21.62是由275個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子質(zhì)量為27.7 ku，等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）為8.6。它是存在于納豆中的一種具有強(qiáng)烈纖維蛋白溶解活性的絲氨酸蛋白酶［1］，同時(shí)還具有促進(jìn)血液流動(dòng)、防止血小板凝聚和降血壓等功效［2-3］。

在人體中，血纖維蛋白原在凝血酶作用下，形成血纖維蛋白單體，在凝血因子XIIIa的催化下，血纖維蛋白單體分子間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，生成二聚體和多聚體，從而形成血凝塊［4］，構(gòu)成了血栓的主要組成。健康的人體可生成適量的纖維蛋白酶原和組織型纖維蛋白酶原激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA）將組織纖維蛋白酶原激活，從而預(yù)防血栓癥。但血栓癥患者體內(nèi)t-PA和組織纖維蛋白酶原的生成量不足，因此必須使用溶栓劑。溶栓劑分為兩大類：一類是組織型纖維蛋白酶原激活劑（如t-PA和尿激酶）；另一類是類組織纖維蛋白酶的蛋白（如NK和蚓激酶［5］）。激活劑類藥物的缺點(diǎn)是，它們高度依賴體內(nèi)組織纖維蛋白酶原的水平，且在體內(nèi)的半衰期短，因此閾劑量大。NK有類似于組織纖維蛋白酶的特點(diǎn)，能直接溶解血栓［6］，而且它亦可以將組織纖維蛋白酶原分解為組織纖維蛋白酶，并能提高天然t-PA的生成量［7］。提高NK的產(chǎn)量及其經(jīng)口服后的生物利用度對(duì)其應(yīng)用和研究其體內(nèi)溶血栓機(jī)理都非常重要，本文主要就NK的制備及其改性方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為今后NK的開發(fā)和對(duì)其溶栓機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1　納豆激酶的制備

傳統(tǒng)的NK是從固態(tài)發(fā)酵豆制品（如納豆、豆豉、豆醬等）或其他發(fā)酵產(chǎn)品（如蝦醬）中提取的。1992年，NAKAMURA T等［8］克隆得到編碼NK的aprN基因后，利用基因工程菌液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)出NK，成為NK新的制備方式，如表1所示。

1.1野生型枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)NK

產(chǎn)NK的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）大多是從自然發(fā)酵的納豆［9-10］或其他大豆發(fā)酵產(chǎn)品［12，27］中分離獲得，也可從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得［11，14］。KU T W等［9-11，14］分別優(yōu)化了枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件，最終發(fā)酵液中NK的酶活分別為13.69 SU/mL、587 U/mL（四肽底物法）和3 194.25 U/mL日本納豆協(xié)會(huì)測(cè)定法（Japan bio science laboratory，JBSL）。當(dāng)LB液體培養(yǎng)基中添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）或谷氨酸（Glu）時(shí)，NK的產(chǎn)量可提高70%～95%；當(dāng)同時(shí)添加Glu和11種金屬離子混合物時(shí)，可使NK的表達(dá)量增加4倍［19］。也有研究者利用其他菌株發(fā)酵產(chǎn)生具有相似功能的酶，如WANG S L等［21］利用從土壤中分離的假單孢菌（Pseudomonassp.）TKU015發(fā)酵蝦殼獲得的分子質(zhì)量分別為21 ku和24 ku的具有溶栓功能的絲氨酸蛋白酶。

表1　納豆激酶的制備Table 1 Production of nattokinase

1.2基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)NK

作為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的模式菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌是NK表達(dá)研究最集中的宿主菌。大腸桿菌（E.coli）表達(dá)的NK通常為不溶的包涵體形式，但CHIANG C J等［28］通過將NK與油質(zhì)蛋白融合表達(dá)，并將表達(dá)蛋白置于含有甘三酯和磷脂等成分的人工油體中復(fù)性，可獲得有活性的蛋白；而LIANG X B等［22］利用一個(gè)協(xié)助胞外質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子pelB，實(shí)現(xiàn)了NK在大腸桿菌中胞外的可溶性表達(dá)，但與枯草芽孢桿菌相比較，表達(dá)量相對(duì)較低。

NK在枯草芽孢桿菌中可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，CHEN P T等［18］通過發(fā)酵條件優(yōu)化，利用枯草芽孢桿菌工程菌搖床培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)表達(dá)NK，其酶活分別為71 500 CU/mL和77400CU/mL。WUSM等［20］構(gòu)建了枯草芽孢桿菌工程菌，并通過優(yōu)化啟動(dòng)子使NK的表達(dá)量增加了136%，達(dá)1 999 U/mL（平板法）。

除枯草芽孢桿菌和大腸桿菌外，其他細(xì)菌及動(dòng)植物細(xì)胞也被用來表達(dá)NK。WEI X T等［23］利用一般公認(rèn)為安全的地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）作宿主菌，通過敲除編碼8個(gè)胞外蛋白酶的10個(gè)基因，并優(yōu)化信號(hào)肽，構(gòu)建了高產(chǎn)NK的地衣芽孢桿菌工程菌。LIANG X B等［24］利用乳酸鏈球菌肽（nisin）的抗性基因作為篩選標(biāo)記，以乳酸菌的模式菌株乳酸乳球菌（lactococcus lactis）為宿主菌構(gòu)建了表達(dá)NK的食品級(jí)菌株。LI X X等［25］通過將綠色熒光蛋白和NK融合在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行可溶性表達(dá)，酶活性達(dá)60 U/mL。HAN L等［26］基于植物偏愛密碼子，通過合成獲得了NK的編碼基因，采用植物果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8，使NK在甜瓜（Cucumis meloL.）中表達(dá)，最高酶活達(dá)79.3 U/mL。盡管對(duì)不同菌株發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)制備NK的報(bào)道很多，但NK測(cè)定方法不統(tǒng)一，給不同研究間的比較帶來困難。

2　納豆激酶的性能改善

NK屬于大分子化合物，在貯藏過程中易失活，因此需提高其貯藏穩(wěn)定性。另外，NK是口服攝入，需要經(jīng)胃腸道消化吸收，所以其在消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性非常重要。NK這兩方面性質(zhì)的改善可通過以下方式來實(shí)現(xiàn)。

2.1物理包埋

賦形劑（多聚物）可保護(hù)生物大分子不被胃的極端pH和蛋白酶破壞。對(duì)NK包埋的賦形劑通常選擇大分子形成脂質(zhì)體、微乳液或固體壓片，以對(duì)酶進(jìn)行保護(hù)，使其在貯藏條件下或胃液中穩(wěn)定。LAW D等［29］先將NK粉末壓成小片，再用腸溶性包衣材料EudragitRL 100-55和羥丙基纖維素通過壓縮涂在表面，壓力在400 MPa以下不會(huì)引起酶變性，NK片劑在人工胃液中2 h不變性，而在人工腸液中5 h被完全釋放。DONG X Y等［30］以卵磷脂、植物甾醇和甘露醇等為輔料，通過配比調(diào)整，實(shí)現(xiàn)了對(duì)NK的有效包埋。WEI X T等［17］利用甲基丙烯酸-乙烷基丙烯酸鹽共聚物對(duì)NK進(jìn)行包埋，使之能在胃中受到保護(hù)，并在腸液中釋放。

物理包埋還有緩釋及提高酶穩(wěn)定性的效果，可顯著提高包埋物在腸內(nèi)的溶解率，促進(jìn)包埋物在特異性細(xì)胞位點(diǎn)的吸收，從而提高其生物利用率。黃銀娟［31］以可溶性淀粉為原料，采用反相微乳液法制備陰離子型淀粉納米粒，對(duì)NK具有保護(hù)和控制釋放的作用，可作為NK的潛在載體。HSIEH C W等［32］用高分子量的γ-多聚谷氨酸鈉包埋NK后，明顯提高了其在60℃和低pH條件下的穩(wěn)定性。CHEN C等［33］合成了葉酸改性的殼聚糖（chitosn-folate，CS-FA），制備了不同質(zhì)量比的系列NK/CS-FA復(fù)合物。體外溶血栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NK/CS-FA復(fù)合物在溶栓活性和穩(wěn)定性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，且葉酸可促進(jìn)吸收NK。

2.2納米粒子結(jié)合

納米粒子（nano particle，NP）不僅能穿過組織間隙，還可通過人體最小的毛細(xì)血管，甚至可通過血腦屏障被細(xì)胞吸收。NP還具有靶向、緩釋、高效和低毒等許多優(yōu)點(diǎn)，且可實(shí)現(xiàn)口服、靜脈注射及敷貼等多種給藥途徑。NP結(jié)合NK的應(yīng)用除了可以利用磁性NP從發(fā)酵液中純化NK外，對(duì)NK的改性方面還具有以下作用：

（1）NK與NP結(jié)合后穩(wěn)定性提高。WEI X T等［34］利用納米銀粒子（AgNPs）與NK形成納豆激酶-納米銀粒子（NK-fAgNPs），NK-AgNPs的熱穩(wěn)定性和抗凝效果都有所提高。通過靜電引力與聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）逐層自組裝形成包被層，該包被復(fù)合物（NK-AgNPs-PEI）具有良好的纖溶效果。DEEPAK V等［35］利用聚羥基丁酸酯NP固定化NK，酶活提高了20%。固定化同樣可促進(jìn)酶穩(wěn)定性的提高，在4 ℃下貯藏25 d，NK酶活仍能完全保持。KAPOOR R等［36］制備了NK殼聚糖NP，結(jié)果表明，NK不僅穩(wěn)定且有緩釋效果，而小鼠卡拉膠誘導(dǎo)凝血實(shí)驗(yàn)證明NK-NP的效果顯著優(yōu)于游離的NK。凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化的部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）和纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）等凝血指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果同樣表明NK-NP的效果顯著優(yōu)于游離的NK。

（2）利于口服時(shí)保護(hù)NK順利通過胃腸道，達(dá)到靶向輸送的目的。在生物醫(yī)藥方面應(yīng)用的NP必須具有良好的生物相容性、低毒性和表面易于改造從而與藥物結(jié)合等性質(zhì)，為達(dá)到靶向輸送的目的還需要有電性或磁性等。LI C M等［37］將聚異丙基丙烯酰胺（poly（N-isopropylacrylamide），PNIPAAm）和聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）共價(jià)接枝到的微米級(jí)或納米級(jí)的聚丙烯（polypropylene，PP）表面，形成刷狀表面。甘露糖結(jié)合蛋白-伴刀豆球蛋白通過活化的羧基被共價(jià)結(jié)合固定在刷狀接枝表面。NK被紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）包埋，RBC通過其表面的甘露糖與伴刀豆球蛋白接合。經(jīng)改良的超疏水的聚丙烯能吸附的RBC比平的聚丙烯多7倍，且包埋的NK有緩釋效果。RBC包埋的物質(zhì)不僅具有緩釋效果還提高了包埋物的生物相容性。LAW D等［38］用蟲漆包埋NK形成小粒，在胃中不被分解而在腸液中釋放，達(dá)到了靶向輸送的目的。

2.3分子改性

對(duì)NK的分子改性是建立在酶的結(jié)構(gòu)和功能基因分析的基礎(chǔ)之上。NK的晶體結(jié)構(gòu)在2013年首次被YANAGISAWA Y等［39］通過X射線衍射揭示。WU S等［40］通過對(duì)Gly100、Ser101和Leu126三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，證實(shí)如果在100位上是體積大的或帶正電荷的側(cè)鏈，則底物結(jié)合和催化活性會(huì)大幅度下降；而這類殘基若位于101位則能明顯提高NK的蛋白酶和溶栓活性，Leu126的突變會(huì)破壞活性中心的結(jié)構(gòu)，從而使酶活大幅度下降。ZHENG Z L等［41］通過定點(diǎn)突變確認(rèn)Ser33、Asp 60和Ser 62及Thr 220是酶的催化位點(diǎn)，突變后自由能增加，催化效率降低。

對(duì)NK的分子改性可以提高酶的活性和穩(wěn)定性。CAI Y J等［42］通過對(duì)納豆芽孢菌AS 1.107、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CICC 20164和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）CICC 10092三個(gè)菌株的同源基因進(jìn)行DNA shuffling建立了一個(gè)突變子庫，通過平板法篩選到催化效率比野生型提高2.3倍的NK突變體。劉朔等［43］發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體紫外誘變產(chǎn)生的納豆芽孢桿菌NK突變體D36G在65℃處理15 min后，熱穩(wěn)定性提高了20%，比活力提高了16.6%。WENG M Z等［44］通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)L31I的催化效率是野生酶的2倍。雙突變M222A/I31L和T220S/I31L的酶活明顯高于單突變，且M222A/I31L的氧化穩(wěn)定性也高于野生酶。

3　展望

綜上所述，NK的制備和改性方面的研究已經(jīng)取得了很好的進(jìn)展，鑒于NK是生物大分子，且多采用經(jīng)口攝入，可以推斷將來的研究熱點(diǎn)主要集中在以下兩個(gè)方面：

（1）建立NK酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。盡管NK制備和表達(dá)方面的研究已經(jīng)很廣泛，但NK酶活性測(cè)定至今仍沒有標(biāo)準(zhǔn)方法，給不同研究結(jié)果間的相互比較帶來了一定的困難。常用的NK測(cè)定方法主要有以尿激酶為對(duì)照的平板法，四肽底物法、日本生物技術(shù)研究所（Nippon institute for biological science，JBSL）的方法，另外還有酪蛋白水解法等。因?yàn)樗碾牡孜锓ㄖ饕强疾霳K水解酰胺鍵的能力，而且尿激酶和NK對(duì)水解底物的特異性有差異，所以平板法和四肽底物法之間并無相關(guān)關(guān)系。而JBSL法現(xiàn)在還處于保密階段，日本納豆協(xié)會(huì)提供的簡(jiǎn)易方法誤差較大。

（2）對(duì)NK溶栓機(jī)理的研究。盡管諸多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NK的溶血栓、降血壓等功效，但NK是分子質(zhì)量為27.6 ku的生物大分子，現(xiàn)有的產(chǎn)品形式和食用方法在很大程度上并不能預(yù)防其在胃腸道中的水解。即使是物理改性的NK，作為完整分子在小腸中的吸收量也是很低的。所以NK的溶栓機(jī)理并不是很清楚。當(dāng)前NK的酶活性測(cè)定方法都是體外考察酶的水解能力，其活性高低是否能真正反映NK在體內(nèi)的功效，這些疑問的解答將對(duì)NK的研究及產(chǎn)品開發(fā)有指導(dǎo)作用。

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JI Shunli1，CAI Junxiu2，CUI Qing1，QIAN Bingjun1，YAO Xiaomin1，ZHANG Jianhua1*
（1.College of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2.College of Ocean and Environment，Meizhouwan Vocational Technology College，Putian 351254，China）

Nattokinase（EC 3.4.21.62）is a kind of serine protease produced byBacillus subtilisnatto，which has strong fibrinolytic activityin vitroand in vivo.Improving the yield，stability and bioavailability of nattokinase has important research significance.The paper reviewed nattokinase preparation by fermentation，culture of wild and genetically engineered strains，and plant and animal cells.The performance improvement including the stability and bioavailability were summarized.The development prospect of nattokinase was expected.

nattokinase；preparation；modification

Q556

0254-5071（2016）06-0006-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.002

2016-03-15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171737）

季順利（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)、食品微生物。

張建華（1968-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)、食品微生物。