脯氨酸和可溶性糖在南極冰藻低溫適應機制中的作用

王以斌 繆錦來 姜英輝 劉芳明 鄭洲 李光友

（1.國家海洋局第一海洋研究所，青島 266061；2.國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室，青島 266061）

脯氨酸和可溶性糖在南極冰藻低溫適應機制中的作用

王以斌 繆錦來 姜英輝 劉芳明 鄭洲 李光友

（1.國家海洋局第一海洋研究所，青島 266061；2.國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室，青島 266061）

對低溫脅迫下兩種南極冰藻胞內的脯氨酸和可溶性糖含量的變化進行分析研究，探討兩種冰藻對低溫的適應性機制。測定不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間下兩種南極綠藻細胞中的脯氨酸和可溶性糖含量，獲得其在低溫下隨溫度和脅迫時間變化的趨勢，分析其產生變化的原因。結果顯示，溫度越低，塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1胞內的脯氨酸和可溶性糖含量增加越明顯。-5℃，培養(yǎng)48 h后，脯氨酸含量是初始值的6.5倍，可溶性糖含量增加60%。衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內脯氨酸的含量同樣為溫度越低，胞內脯氨酸的含量越高；但隨時間變化趨勢與塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1相反，含量隨溫度作用時間的增加出現(xiàn)減少的趨勢。-5℃，48 h后脯氨酸含量基本維持不變，可溶性糖含量增幅達90%。結果表明，脯氨酸和可溶性糖在南極冰藻的低溫適應性機制中具有重要的作用，但在不同藻種中的作用機制不同。

南極冰藻；低溫適應性；脯氨酸；可溶性糖

1963年Bunt［1］首次報道南極海水及海冰中有冰藻的存在。此后，各國科研人員對其展開了大量的研究［2-4］。冰藻可以在南極低溫環(huán)境中快速生長，是海冰生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級生產力來源［3，4］，并且可以耐受海冰反復凍融所產生的滲透壓急劇變化、高鹽度以及強紫外輻射等極端環(huán)境［4］。

脯氨酸和可溶性糖在高等植物的抗逆生理中發(fā)揮著重要的作用［5］。脯氨酸是在各種生物體內均有分布的滲透保護物質，在低溫脅迫條件下，高等植物通過增加細胞內的脯氨酸和可溶性糖含量來維持細胞的滲透壓，增強細胞對低溫的抵抗能力［6-8］。同時，可溶性糖的含量與植物抗寒性之間呈正相關［9］。然而，兩者在相對低等的海洋微藻的低溫脅迫生理適應機制中的研究未見報道。

當前，對于南極冰藻低溫適應性的機制研究中，細胞膜適應性變化、冰活性蛋白、不飽和脂肪酸、低溫酶等研究已相對較多［10］，而關于脯氨酸及可溶性糖的變化及與低溫適應性的相關性研究較少。本研究通過分析兩種南極冰藻中的脯氨酸及可溶性糖在低溫脅迫下的變化趨勢，探究脯氨酸及可溶性糖在南極冰藻適應極端低溫環(huán)境中的變化過程和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種及其培養(yǎng) 實驗用南極冰藻為兩種單細胞綠藻，塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1和衣藻Chlamydomonas sp. L-4［11，12］，均為中國第18次南極科考所采集海冰樣品中分離所得，并在國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室獲得長期保藏。

冰藻在溫控光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強度為20-30 μmol/（m2·s），光暗周期為12∶12；培養(yǎng)基為f/2海水培養(yǎng)基，每日搖動4-5次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期［13］。

1.2 方法

1.2.1 細胞內脯氨酸含量的測定 細胞內脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮法［14，15］。

取一定體積的南極冰藻培養(yǎng)液，低溫離心機4 000 r/min離心5 min，去除上清液后用蒸餾水洗滌。藻泥加入5 mL、5%的乙酸和20 mL蒸餾水，用研磨器研磨20 min后，加入1 g人造沸石，振蕩5 min，以5 000 r/min的轉速離心10 min。取上清液3 mL，加入冰醋酸和茚三酮各3 mL，振蕩5 min后，沸水浴1 h，冷卻后加入苯3 mL，充分振蕩，測定515 nm的光吸收值。同時取相同體積的冰藻培養(yǎng)液，測定干重。

脯氨酸標準曲線的方程為：Pro（μg/mL）=10.27x +0.00468。從標準曲線中查出每毫升樣品中脯氨酸的含量，再計算出樣品中脯氨酸含量（mg/g）。

1.2.2 細胞內可溶性糖的提取及含量的測定 胞內可溶性糖的測定方法采用蒽酮比色法［15，16］。

取一定體積的南極冰藻培養(yǎng)液，低溫離心機4 000 r/min離心5 min，去除上清液后用蒸餾水洗滌，藻泥加入乙醚后用研磨器研磨10 min成均勻糊狀，加入蒸餾水后放入燒杯中70-80℃水浴30 min，冷卻后滴加飽和中性醋酸鉛至完全沉淀，將混合物及沉淀在100 mL容量瓶中定容，充分振蕩混合后過濾取清液，清液用草酸鈉去除過量醋酸鉛后再次過濾，此時透明濾液即為可溶性糖提取液。

取1 mL可溶性糖提取液，加入5 mL蒽酮置于試管中，沸水浴中10 min，冷卻后用分光光度法在625 nm處測定光吸收值。從標準曲線中查出每毫升樣品中可溶性糖的含量，再計算出樣品中可溶性糖含量（mg/g）。

1.2.3 溫度對細胞內脯氨酸和可溶性糖含量的影響 實驗設定培養(yǎng)溫度為-5℃、0℃和5℃（-5℃-0℃視為低溫），每個溫度梯度分別處理6、12、24和48 h。測定不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間下兩種南極綠藻細胞中的脯氨酸和可溶性糖含量。

2 結果

2.1 溫度對兩種綠藻胞內脯氨酸含量的影響

溫度對塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1的脯氨酸含量的影響結果（圖1）顯示，塔胞藻L-1細胞內的脯氨酸含量在不同溫度作用下的變化幅度有較大差異。在溫度處理初始的6 h內，3組別溫度作用下的L-1細胞內脯氨酸的含量變化并不明顯，差別也不大；隨著處理時間的延長，塔胞藻L-1細胞內的脯氨酸含量開始增加，并且3組別溫度作用的細胞內脯氨酸含量的變化有明顯差異。其中在-5℃下，塔胞藻L-1胞內的脯氨酸含量增加最多，明顯超過其它兩組別溫度作用下的結果；處理48 h后，該組別細胞內的脯氨酸含量由0.48 mg/g增加到了3.24 mg/g，含量增加到初始值的6.5倍。0℃溫度組別的L-1在48 h后胞內的脯氨酸含量也增到初始值的4.8倍；而5℃溫度組別的L-1胞內脯氨酸的含量變化則相對小很多，僅增加到初始值含量的2倍左右。

圖1 溫度對Pyramidomonas sp. L-1（A）和Chlamydomonas sp. L-4（B）胞內脯氨酸含量的影響

相同溫度條件作用下，衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內脯氨酸的含量變化趨勢與塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1相反。同樣由圖1可知，衣藻L-4的細胞內脯氨酸的含量隨著溫度作用時間的增加出現(xiàn)減少的趨勢。處理初始，3個組別的L-4細胞內的脯氨酸含量都是18.84 mg/g。-5℃處理48 h后，L-4胞內的脯氨酸含量基本維持在了初始的含量狀態(tài)，雖略有減少但基本可以視為保持穩(wěn)定。在3個組別當中，該組別細胞內脯氨酸的含量相對最高，其它兩組別胞內脯氨酸的含量都出現(xiàn)了明顯的下降；其中，0℃組別胞內脯氨酸的含量降低最多，由0 h時的18.84 mg/g降低到了48 h后的14.99 mg/g，降幅達到了20%。

雖然兩種綠藻的胞內脯氨酸含量的變化趨勢不同，但是衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內脯氨酸的相對含量卻遠遠大于塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1，其初始狀態(tài)時胞內脯氨酸含量是L-1的近40倍。-5℃溫度處理48 h后，雖然L-1胞內的脯氨酸含量有大幅度增加，但L-4胞內的脯氨酸含量仍然是L-1的5.6倍，而這個差距也是3組溫度組別處理48 h后最小的。

雖然兩種綠藻胞內脯氨酸含量的變化趨勢不同，但均在-5℃時具有相對最高的胞內含量，這說明低溫脅迫下細胞內的脯氨酸的積累在冰藻的低溫適應性過程中發(fā)揮了積極的作用。

圖2 溫度對Pyramidomonas sp. L-1（A）和Chlamydomonas sp. L-4（B）胞內可溶性糖含量的影響

2.2 溫度對兩種綠藻胞內可溶性糖含量的影響

塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1經過3個組別溫度處理48 h后，胞內的可溶性糖含量出現(xiàn)較大差異，結果見圖2。其中，0℃和5℃的溫度處理后胞內可溶性糖的含量變化相對于-5℃處理的結果非常微小。5℃條件下處理48 h后L-1胞內可溶性糖的含量變化非常小，0℃組別胞內的可溶性糖含量在12 h有所增加，12 h后基本維持在一定含量保持不變。-5℃組別的L-1胞內可溶性糖含量變化最為明顯，其含量在處理6 h后開始穩(wěn)定增加，由初始時的3.23 mg/g增加到了48 h時的5.13 mg/g，增加了約60%的含量。

溫度對衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內可溶性糖含量變化的影響與塔胞藻L-1的變化趨勢相似，0℃與5℃處理48 h后的可溶性糖含量變化不明顯，-5℃處理48 h后變化較大，含量由初始時的3.76 mg/g增加到48 h后的7.13 mg/g，增加了90%的含量。

對比兩種綠藻細胞內可溶性糖的含量，均在-5℃條件下含量最高，并且L-4胞內的可溶性糖含量要略高于L-1。

3 討論

脯氨酸的積累是植物體抵抗?jié)B透脅迫的一種有效方式，其可以通過調節(jié)細胞的滲透勢，穩(wěn)定蛋白結構來維持細胞正常的生理功能［5，7，8］。

本研究的結果表明，在塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1中，隨著培養(yǎng)溫度的降低，其胞內脯氨酸的含量成倍增加。溫度在-5℃，培養(yǎng)48 h后，胞內的脯氨酸含量由0.48 mg/g增加到了3.24 mg/g，含量是初始值的6.5倍；0℃溫度組別的L-1在48 h后胞內的脯氨酸含量也增到初始值的4.8倍，5℃由于在其可正常生長的溫度內（2-6℃）［11］，因此脯氨酸含量增加較小。這說明在低溫（-5℃-0℃）環(huán)境脅迫下，L-1胞內通過富集脯氨酸來維持細胞在低溫下的正常生理功能。

溫度對衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內的脯氨酸含量的影響不同于L-1。-5℃條件下，L-4胞內的脯氨酸含量沒有明顯變化，而溫度為0℃和5℃時，脯氨酸含量隨著作用時間的延長而降低。這說明-5℃的低溫條件下，L-4細胞內的脯氨酸含量需要維持在一個較高的水平；而在0℃和5℃時，脯氨酸的含量適當減少即可維持其胞內正常的生理活動。

Chlamydomonas sp. L-4胞內的脯氨酸含量遠遠高于Pyramidomonas sp. L-1，約為后者的40倍。L-1的脯氨酸對溫度變化敏感，低溫會導致其含量成倍增加，而L-4在低溫下可以維持胞內較高的脯氨酸含量。這說明脯氨酸在南極冰藻的低溫適應性機制中起到了重要的作用，對于不同的藻種，其發(fā)揮作用的方式不同；L-1和L-4在各自的低溫適應過程中的脯氨酸調節(jié)機制和方式是不同的。另一方面，L-1可能對低溫的反應更加敏感；而L-4在長期的進化過程中，相對于L-1更適應極地的低溫環(huán)境，因此在胞內已合成較高含量的脯氨酸，這種高含量的脯氨酸足以抵御不良環(huán)境對其造成的傷害，從而維持其正常的細胞生長。

根據(jù)脯氨酸在高等植物抗逆過程中的作用機制［6-8］，分析脯氨酸在南極冰藻低溫環(huán)境適應過程中的作用可能有以下幾方面：（1）作為滲透保護物質，調節(jié)胞內外的滲透壓平衡。在海冰的凍融過程中，生存在其中的南極冰藻不僅受低溫的影響，還需要經受由于鹽度的急劇變化而導致的滲透壓的巨大變化，脯氨酸作為滲透調節(jié)劑能夠迅速維持南極冰藻細胞內外的滲透壓平衡。（2）保護和穩(wěn)定蛋白。脯氨酸具有很高的水溶性，其分子結構既具有親水部分，又具有疏水部分，可以同蛋白質的疏水部分結合，又不影響蛋白質分子內部的疏水作用，使蛋白質不變性，在低溫下保持蛋白質的生物活性。（3）脯氨酸可與細胞內的一些化合物形成聚合物，降低細胞質的冰點。（4）清除羥基自由基。脯氨酸能夠清除低溫下產生的活性氧，保護細胞膜免受破壞。

高等植物細胞在低溫下會大量的積累可溶性糖以提高其抗寒性［8］，袁淑珍等［17］對低溫脅迫下螺旋藻細胞內可溶性糖的研究也已證明在藻類植物細胞中其作用機制同樣如此。本研究的結果表明，在低溫脅迫下，兩株冰藻細胞內的可溶性糖含量均有明顯的增加，-5℃，48 h后，增加量均在60%以上，衣藻L-4胞內的可溶性糖含量增幅達90%。這說明兩株綠藻均對低溫環(huán)境脅迫做出了應答響應和適應性變化。而在0℃與5℃的溫度下處理后，胞內可溶性糖的增幅并不明顯。這說明，在L-1和L-4可正常生長的溫度范圍內，可溶性糖的含量增加并不明顯，因為這些低溫藻類已經適應了極地的環(huán)境溫度，當周圍環(huán)境溫度繼續(xù)降低至冰點以下時，其低溫適應性機制中可溶性糖的變化機制才會開始發(fā)揮作用。

極地冰藻的低溫適應性機制是其胞內各種生化組分共同作用的結果。以往的研究中，重點關注了細胞膜的流動性機制、抗凍蛋白及冰活性物質、低溫酶的作用機制、細胞膜不飽和脂肪酸的變化機制等在冰藻低溫適應過程中的作用，而關于脯氨酸和可溶性糖的研究則相對較少。本研究通過對兩株冰藻在低溫脅迫下脯氨酸和可溶性糖的變化過程的研究和分析，闡述了這二者在冰藻低溫脅迫適應過程中的作用，為深入了解和分析極地冰藻的低溫適應性機制提供了基礎數(shù)據(jù)。

4 結論

低溫脅迫下通過對兩種南極冰藻胞內脯氨酸和可溶性糖含量變化的分析，獲得了其在低溫適應性過程中的變化趨勢，對于不同的藻種，兩種物質發(fā)揮作用的方式不同。

低溫下塔胞藻Pyramidomonas sp. L-1胞內的脯氨酸和可溶性糖含量均發(fā)生了明顯變化，溫度越低，脯氨酸和可溶性糖含量增加越明顯，溫度越高，增加的幅度越小。-5℃處理48 h后，脯氨酸含量增加到初始值的6.5倍；可溶性糖增加了約60%的含量。

衣藻Chlamydomonas sp. L-4胞內脯氨酸的含量變化隨著溫度作用時間的增加出現(xiàn)減少的趨勢，溫度越低，胞內脯氨酸的含量越高。-5℃處理48 h后，胞內的脯氨酸含量基本維持在了初始的含量，0℃降低最大達到了20%?？扇苄蕴请S溫度的變化趨勢為溫度降低含量增加；-5℃處理48 h后，L-4胞內可溶性糖增加了90%的含量。

［1］Bunt JS， Wood EJF. Microbiology of Antarctic sea-ice：microalgae and Antarctic sea-ice［J］. Nature， 1963， 199：1254-1255.

［2］Priscu JC， Palmisano AC， Peiscu LR， et al. Temperature dependence of inorganic nitrogen uptake and assimilation in Antarctic sea-ice microalgae［J］. Polar Biology， 1989， 9（7）：443-446.

［3］Thomas DN， Dieckmann GS. Antarctic sea ice-a habitat for extremophiles［J］. Science， 2002， 295（5555）：641-644.

［4］何劍鋒， 王桂忠， 李少菁， 蔡明紅. 南極海冰區(qū)冰藻類群及興衰過程［J］. 極地研究， 2003， 15（2）：102-105.

［5］Verbruggen N， Hermans C. Proline accumulation in plants：a review［J］. Amino Acids， 2008， 35（4）：753-759.

［6］王小華， 莊南生. 脯氨酸與植物抗寒性的研究進展［J］. 中國農業(yè)學報， 2008， 24（11）：398-402.

［7］王麗媛， 丁國華， 黎莉. 脯氨酸代謝的研究進展［J］. 哈爾濱師范大學自然科學學報， 2010， 26（2）：84-89.

［8］羅丹， 張喜春， 田碩. 低溫脅迫對番茄幼苗脯氨酸積累及其代謝關鍵酶活性的影響［J］. 中國農學通報， 2013， 29（16）：90-95.

［9］王榮富. 植物抗寒指標的種類及其應用［J］. 植物生理學通訊，1987（3）：49-55.

［10］史翠娟， 闞光鋒， 繆錦來， 等. 南極冰藻逆境適應性機理的研究進展［J］. 海洋科學， 2010， 34（4）：100-103.

［11］姜英輝， 侯旭光， 李光友. 兩種南極冰藻的形態(tài)和超微結構觀察［J］. 高技術通訊， 2001， 8：29-33.

［12］ 繆錦來， 闞光鋒， 張波濤， 等. 南極冰藻Pyramidomonas sp. 和Chlorophyceae L-4的優(yōu)化培養(yǎng)［J］. 中國水產科學， 2004， 11（3）：244-252.

［13］繆錦來， 石紅旗， 姜英輝， 等. 南極冰藻生化組成及其與低溫適應性關系的研究［J］. 海洋科學進展， 2002， 20（4）：43-50.

［14］朱廣廉， 鄧興旺， 左衛(wèi)能. 植物體內游離脯氨酸的測定［J］.植物生理學通訊， 1983， 1（1）：34-37.

［15］李合生. 植物生理生化實驗原理和技術［M］. 北京：高等教育出版社， 2003.

［16］郝建軍， 劉延吉. 植物生理學實驗技術［M］. 沈陽：遼寧科學技術出版社， 2001.

［17］袁淑珍， 栗淑媛， 喬辰. 低溫脅迫對螺旋藻體內可溶性糖含量的影響［J］. 中國農學通報， 2008， 24（5）：113-116.

（責任編輯 馬鑫）

Roles of Proline and Soluble Sugar in the Cold-adaptation of Antarctic Ice Microalgae

WANG Yi-bin MIAO Jin-lai JIANG Ying-hui LIU Fang-ming ZHENG Zhou LI Guang-you
（1. First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061；2. Key Laboratory of Marine Bioactive Substances，State Ocean Administration，Qingdao 266061）

The content changes of proline and soluble sugar in two Antarctic ice microalgae under low temperature stress were measured and analyzed for understanding their cold-adaptation mechanisms. Measuring the proline and soluble sugar in two microalgae at different low temperatures and culturing time， the changing trend of them with the temperature and stress time at low temperature was obtained， and the reasons of it was analyzed. The lower the temperature was， the more significantly the contents of proline and soluble sugar in Pyramidomonas sp. L-1 increased. The amount of proline was 6.5 times of initial one and the soluble sugar increased 60% after 48 h at -5℃. The content of proline in Chlamydomonas sp. L-4 was in the same way as Pyramidomonas sp. L-1， i.e.， the lower the temperature was， the higher the content of proline was. However， the changing trend of the content with the time was in contrast， decreasing with the culturing time. The proline was almost unchanged after 48 hours at -5℃， while soluble sugar increased 1.9 times. In conclusion， proline and soluble sugar play an important role in the cold-adaptation mechanism of Antarctic ice microalgae， however， the action mechanism is different in the different algae species.

Antarctic ice microalgae；cold-adaptability；proline；soluble sugar

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.024

2015-05-05

國家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務費專項（2015G10，2013G33），國家自然科學基金青年基金項目（31200097，31200272），海洋公益性行業(yè)科研專項（201305027，201405015）

王以斌，男，助理研究員，研究方向：極地海洋生物學；E-mail：wangyibin@fio.org.cn

繆錦來，男，研究員，研究方向：極地海洋生物學；E-mail：miaojinlai@fio.org.cn