電子鼻結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析冷藏期間刺參揮發(fā)性成分的變化

張鵬，肖水水，李江闊*，農(nóng)紹莊

1(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)2(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連，116034)

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電子鼻結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析冷藏期間刺參揮發(fā)性成分的變化

張鵬1，肖水水2，李江闊1*，農(nóng)紹莊2

1(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)2(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連，116034)

以鮮活刺參為原料，測定其水分含量、自溶酶和揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)指標(biāo)在0 ℃冷藏過程中的變化，并采用電子鼻結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)，研究刺參在0 ℃貯藏過程中的揮發(fā)性成分變化。結(jié)果表明：電子鼻中PCA和LDA算法能夠較好的區(qū)分不同貯藏時間的刺參樣品，且其分析結(jié)果與常規(guī)的品質(zhì)指標(biāo)變化相一致，即貯藏9 d是刺參品質(zhì)劣變的拐點。經(jīng)GC-MS共檢測出33中揮發(fā)性物質(zhì)，以醇類物質(zhì)種類最多，含量隨貯藏時間的延長呈先增加后降低的趨勢；另外還有少量的醛類，其在貯藏6～12 d內(nèi)含量較高；含氮類物質(zhì)僅在貯藏9 d和15 d時有少量檢出。

刺參；揮發(fā)性成分；電子鼻；GC-MS

刺參屬于刺參科，仿刺參屬，是海參種類中食用品質(zhì)較高的一種，廣泛分布于黃、渤海地區(qū)，以山東半島和遼東半島地區(qū)為主要刺參產(chǎn)區(qū)，又稱北方刺參[1-2]。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多糖、皂苷、膠原蛋白等活性成分，具有抗腫瘤、抗凝血、降血脂和防止動脈硬化等多種保健作用，深受消費著青睞[3-4]。隨著貯藏時間的延長會發(fā)生一系列的氣味變化，而氣味是影響刺參食用品質(zhì)的指標(biāo)之一[5]。因此可從氣味分析的角度分析其品質(zhì)的變化。

電子鼻作為一種新型仿生技術(shù)，是通過模擬動物嗅覺系統(tǒng)，收集氣味指紋數(shù)據(jù)來實現(xiàn)對檢測對象的品質(zhì)評價[6]，以其準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，不存在人的主觀臆斷特點而優(yōu)于感官評價；頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)可對揮發(fā)性氣味進(jìn)行較為精確的定性和定量分析[7]；頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)技術(shù)集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣為一體，與GC-MS連用具有較高的實驗效率和準(zhǔn)確性[8]。目前已有將電子鼻結(jié)合GC-MS技術(shù)用于果蔬[9]、肉制品[10]、水產(chǎn)品[11-12]、香料香精[13]、煙草茶葉[14]等的氣味分析鑒定中。對于刺參類珍稀水產(chǎn)品，還未見關(guān)于其揮發(fā)性成分的報道。本研究采用電子鼻結(jié)合HS-SPME-GC/MS技術(shù)對刺參中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析與鑒定，比較了不同貯藏時間下的刺參氣味變化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與處理

鮮活刺參，購買自大連市鑫玉龍海洋珍品有限公司。捕撈后的鮮活刺參立即置于含有海水的冰水混合物的黑色塑料袋中，扎緊后放入白色泡沫盒中，封箱后于當(dāng)日空運到達(dá)國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)，隨即將其放入冷卻的人工配置的海水鹽溶液中，置于0 ℃冷庫中貯藏。

1.1.2儀器與設(shè)備

Trace DSQ GC/MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Finnigan公司；固相微萃取手柄SPME(含100μm PDMS(聚二甲基硅氧烷)萃取頭),美國Supleco公司；PC-420D數(shù)字型磁力加熱攪拌裝置美國Corning公司；PEN3型便攜式電子鼻,德國Airsense公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-82A恒溫水浴鍋,金壇市金南儀器制造有限公司；ML503千分之一天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2測定指標(biāo)與方法

1.2.1水分含量

采用GB 5009.3—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定中的第一法 直接干燥測定法進(jìn)行，每組重復(fù)測定3次。

1.2.2自溶酶活性

參照夏遠(yuǎn)景等[15]的方法測定，每組重復(fù)測定3次。

1.2.3揮發(fā)性鹽基氮

依照SC/T 3032—2007水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的方法，每組重復(fù)測定3次。

1.2.4電子鼻檢測方法

將刺參切成1 cm左右的小片，準(zhǔn)確稱取5 g切碎刺參樣品平鋪于300 mL燒杯中，用雙層保鮮膜密封30 min達(dá)平衡狀態(tài)后開始測量。測試參數(shù)：自動調(diào)零時間10 s，樣品準(zhǔn)備時間5 s，樣品檢測時間50 s，進(jìn)樣流量100 mL/min，清洗時間300 s，每組刺參樣品重復(fù)測定7次，選取重復(fù)性好的4組用于后續(xù)電子鼻數(shù)據(jù)分析。

1.2.5HS-SPME-GC/MS測定方法

刺參試樣處理：準(zhǔn)確稱取3 g攪碎刺參試樣于頂空瓶中，加入4 mL飽和食鹽水，加蓋封口，于50 ℃保溫15 min，隨后加入磁力攪拌子，立即加蓋封口，置于磁力攪拌器上，將老化好的萃取頭插到頂空瓶距離樣品液面1 cm處，在溫度為50 ℃轉(zhuǎn)速為650 r/min條件下吸附40 min后，拔出萃取頭，立即插入GC/MS進(jìn)樣口，于250 ℃解吸10 min，每組樣品重復(fù)測定2次。

1.2.5.1氣相色譜條件

規(guī)格為30 m×250 μm×0.25 μm的HP-INNOWAX色譜柱；升溫程序：40 ℃保留3 min，隨后4 ℃/min升至120 ℃，5 ℃/min升至210 ℃，保留5 min；載氣為He，流速1 mL/min，不分流。

1.2.5.2質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度200 ℃；連接桿溫度280 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z35～350。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0軟件對理化指標(biāo)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗；刺參電子鼻傳感器數(shù)據(jù)采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)。對HS-SPME-GC/MS檢測獲得的實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Xcalibur軟件處理、計算機NIST/WILEY庫檢索、解析和查閱有關(guān)資料進(jìn)行定性分析，對正反匹配度均大于800的檢測結(jié)果予以確認(rèn)，并用峰面積歸一化法確定各種成分的相對含量。

2　結(jié)果與分析

2.1不同貯藏時間下刺參品質(zhì)變化

隨著貯藏時間的延長，刺參在0 ℃下的品質(zhì)隨時間的變化如表1所示。由表1可以看出，刺參的含水量隨貯藏時間的延長而呈上升趨勢，在0～6 d內(nèi)刺參的水分含量呈微弱的波動，不同貯藏時間下的含水量無顯著性差異；而在貯藏6～9 d時，刺參的含水量顯著增加，說明在6～9 d這3 d的時間內(nèi)刺參可能出現(xiàn)化皮自溶現(xiàn)象，而9～15 d含水量繼續(xù)緩慢增加，說明刺參的自溶進(jìn)程在慢慢深入。剛運輸回來的鮮活刺參其體內(nèi)自溶酶活性較高，0～9 d內(nèi)自溶酶活性呈下降趨勢，可能原因是刺參在0 ℃的低溫環(huán)境中代謝緩慢使得酶活性降低，9～15 d內(nèi)自溶酶活性又有所上升，這可能是由于刺參的死亡，胞內(nèi)物質(zhì)大量溶出，使得自溶酶活力增強。隨著刺參貯藏時間的延長TVB-N呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢，剛捕撈的的刺參TVB-N值為5.6 mg/100 g，新鮮度較好，第9天為20.80 mg/100 g，至第15天達(dá)28 mg/100 g，說明對照組刺參在第3天后開始發(fā)生變化，新鮮度降低，但仍具有食用價值,至第9天其TVB-N的含量已超過20 mg/100 g，已超過GB 2733—2005中規(guī)定的牡蠣、淡水魚蝦的規(guī)定限量，說明0 ℃環(huán)境可以貯藏刺參6～9 d左右，超過9 d已開始出現(xiàn)腐敗跡象。綜合上述3個指標(biāo)可以看出，刺參在0 ℃的環(huán)境下可貯藏6～9 d，超過9 d刺參的品質(zhì)已發(fā)現(xiàn)顯著變化。

表1　不同貯藏時間下刺參的品質(zhì)變化

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P> 0.05)。

2.2刺參貯藏期間電子鼻檢測結(jié)果分析

由于刺參在貯藏15 d后從感官上就可以聞到令人惡心的腥臭氣味，且氣味濃烈，外觀呈黏稠狀不利于取樣和分析，因而不對貯藏15 d的刺參樣品進(jìn)行電子鼻分析。

2.2.1PCA算法對不同貯藏時間下刺參揮發(fā)性氣味分析

圖1為刺參貯藏期間(0～12 d)的PCA分析圖。圖1中每個橢圓代表同一貯藏時間下的刺參數(shù)據(jù)采集點,數(shù)據(jù)點越緊密，代表樣品的重復(fù)性越好。由圖1可以看出，2種主成分的貢獻(xiàn)率分別為96.83%和2.88%，之和為99.71%，大于90%，說明這2種主成分基本代表了樣品的全部特征信息，無其他干擾成分，因而該PCA分析方法具有可行性。從圖1可以看出，各個貯藏時間下的橢圓區(qū)域無交叉重疊區(qū)域，說明PCA算法可以將不同貯藏時間下的刺參區(qū)分開來。

圖1　不同貯藏時間下刺參電子鼻PCA分析Fig.1　PCA analysis for sea cucumber at different storage time

2.2.2LDA算法對不同貯藏時間下刺參揮發(fā)性氣味分析

相比PCA將整組數(shù)據(jù)整體映射到最方便表示這組數(shù)據(jù)的坐標(biāo)系中，LDA算法則利用了數(shù)據(jù)內(nèi)部的分類信息，它將數(shù)據(jù)組間差距最大化，而組內(nèi)數(shù)據(jù)差距最小化，注重響應(yīng)值在空間的分布及距離分析。圖2為不同貯藏時間下的刺參的LDA分析圖。其判別式LD1和LD2的貢獻(xiàn)率分別為84.40%和9.56%，之和為93.96%，大于90%，基本代表了樣品的全部特征信息。由圖2可以看出，LDA分析可以將不同貯藏時間下的刺參很好的區(qū)分開來。另外由各個橢圓距離坐標(biāo)原點的距離和彼此間的相對距離可以發(fā)現(xiàn)，刺參試樣隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性變化，表現(xiàn)在0～3 d時，刺參樣品沿第一主軸向右、沿第二主軸向上移動明顯，且距離原點的位置較遠(yuǎn)，說明0～3 d內(nèi)刺參的揮發(fā)性氣味發(fā)生明顯變化，可能原因是經(jīng)過長途運輸?shù)拇虆⒃诨謴?fù)到相對穩(wěn)定環(huán)境中代謝能力增強導(dǎo)致氣味變化明顯的結(jié)果，隨后3～12 d內(nèi)刺參樣品在LD1方向上基本保持不變，而沿LD2方向向下移動，其3、6、9和 12 d的刺參樣品呈現(xiàn)一定的聚類分布，如3 d和6 d距離較近，說明3 d和6 d的刺參氣味差別不大；而9 d和12 d的形成的橢圓距離相對較遠(yuǎn)，說明9 d和12 d的刺參樣品氣味存在明顯不同，亦即刺參在貯藏9～12 d這3 d的時間內(nèi)，氣味劇烈變化。此外，通過HS-SPME-GC/MS技術(shù)對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行進(jìn)一步的分析和鑒定。

圖2　不同貯藏時間下刺參電子鼻PCA分析Fig.2　LDA analysis for sea cucumber at different storage time

2.3刺參貯藏期間GC-MS檢測結(jié)果分析

表2為刺參不同貯藏時期下的主要揮發(fā)性成分檢測結(jié)果?？梢钥闯觯诖虆⒅泄矙z測出33種揮發(fā)性成分，主要為醇類、醛類、烴類和少量含氮有機物。

醇類物質(zhì)種類豐富且相對含量較高為刺參的主要揮發(fā)性物質(zhì)。它可由脂肪酸氧化酶作用于脂肪酸產(chǎn)生或是脂肪氧化分解產(chǎn)生或羰基化合物還原生成，亦或是脂肪酸二級產(chǎn)物氫過物分解產(chǎn)生。在第0、3、6、9、12和15天分別檢測出14、14、18、17、16和15種醇類物質(zhì)，相對含量分別為95.04%、91.17%、54.45%、54.46%、64.7%和89.55%，可以看出隨貯藏時間的延長醇類物質(zhì)的相對含量呈現(xiàn)出先下降隨后上升的趨勢。

醇類物質(zhì)通常具有植物香、泥土氣味或是酸敗氣味，實驗中檢測出的含量較高的醇為2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇、(Z)-5-癸烯-1-醇、1-辛醇、2-甲基-1-辛醇、1-壬醇、(Z)-4-癸烯-1-醇及(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇，它們也是刺參在不同貯藏時間下存在差異的主要醇類。如2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇在不同貯藏時間下相對含量差別顯著，在鮮刺參中含量為50.05%，到第3天時含量降低為37.8%，當(dāng)貯藏6d時含量僅為0.17%，在貯藏15d時又有所上升為20.88%；(Z)-5-癸烯-1-醇隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在12 d時達(dá)到峰值，相對含量為38.83%。相關(guān)研究表明C4～C11的醇類會呈現(xiàn)出金屬氣味或泥土味，但一般閾值較高，含量較高的醇或是烯醇式結(jié)構(gòu)的醇類閾值一般較低，因而可判斷2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇和(Z)-5-癸烯-1-醇對不同貯藏時間下刺參揮發(fā)性風(fēng)味的區(qū)分起了比較大的作用。1-辛醇在不同貯藏時間的刺參內(nèi)相對含量存在明顯差別，在第0、3 、6 、9 、12和15天的刺參樣品中的相對含量分別為12.59%、22.96%、16.57%、13.04%、12.88%和19.22%， 1-辛醇具有油脂氣味，其會與其他物質(zhì)作用產(chǎn)生的土腥味。1-壬醇在鮮刺參(0d)中的相對含量僅為0.95%，而在貯藏12 d時增加到2.19%，至15 d含量高達(dá)6.16%，隨著貯藏時間的延長，其1-壬醇增加顯著，同樣的2-甲基-1-辛醇和(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇也隨貯藏時間的延長而增加，在貯藏15d時相對含量達(dá)峰值，因而猜測1-壬醇、2-甲基-1-辛醇和(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇可能是造成貯藏后期刺參產(chǎn)生異味的主要成分。

表2　刺參貯藏期間主要揮發(fā)性物質(zhì)相對含量變化

續(xù)表2

化合物名稱RT/min相對含量/%0d3d6d9d12d15d小計(3種)0.070.1639.6133.0327.630.32含氮類物質(zhì)(2-氮雜環(huán))胺(2-aziridinylethyl)amine1.69———0.23—0.1甲氧基苯基肟methoxy-phenyl-oxime27.7———0.93——3-氨基苯乙炔m-aminophenylacetylene41.12—————0.18小計(3種)0001.1600.28總計(33種)97.7496.3398.4596.7797.2795.19

注：“—”表示未檢出。

除醇類外在刺參揮發(fā)性物質(zhì)中還有少量醛類檢測出來，其閾值一般比醇類低，與其他物質(zhì)有很強的風(fēng)味重疊作用[16]。在刺參中檢測到辛醛、(Z)-7-癸烯醛和2-(4-甲基-3-環(huán)己烯基)丙醛3種醛類物質(zhì)，其中不同貯藏時間下的刺參中(Z)-7-癸烯醛含量差別較大，貯藏6 d、9 d和12 d的刺參分別有39.5%、32.68%和27.5%的(Z)-7-癸烯醛檢出，而其他時間內(nèi)則未檢出。猜測(Z)-7-癸烯醛對不同貯藏時間下刺參揮樣品的區(qū)分起了比較大的作用。除醇類和醛類外，刺參中還有少量的烴類和含氮物質(zhì)存在，其中含氮物質(zhì)僅在9 d和12 d中檢測出來，可能與刺參貯藏中后期刺參中蛋白質(zhì)經(jīng)微生物的分解作用產(chǎn)生。低級脂肪胺具有令人不愉快的腥臭氣味，但在貯藏后期沒有檢測出尸胺或腐胺，可能是刺參在貯藏15 d時仍沒有達(dá)到極度腐敗狀態(tài)的結(jié)果。

3　結(jié)論

刺參在0℃的環(huán)境下貯藏，隨著貯藏時間的延長水分含量、自溶酶活性以及TVB-N等品質(zhì)和鮮度指標(biāo)發(fā)生變化的同時，揮發(fā)性氣味也發(fā)生著改變。通過對刺參貯藏期間的水分含量、自溶酶和揮發(fā)性鹽基氮的3個指標(biāo)的測定，確定刺參在貯藏9 d后品質(zhì)開始明顯變劣，表現(xiàn)在含水量和TVB-N含量顯著增加，自溶酶活性顯著降低，即貯藏9 d是刺參品質(zhì)變化的一個拐點。應(yīng)用電子鼻對刺參貯藏期間氣味進(jìn)行主成分分析和線性判別分析，發(fā)現(xiàn)PCA和LDA分析均能有效的將不同貯藏時間的刺參區(qū)分開來，表明隨著貯藏時間的延長刺參的氣味變化明顯。因而利用HS-SPME-GC/MS對刺參貯藏期間的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，共檢測出33中揮發(fā)性物質(zhì)，其中以醇類物質(zhì)種類最多含量最高，是刺參的主要氣味成分。不同貯藏階段的刺參揮發(fā)性物質(zhì)含量差別較大， 醇類物質(zhì)隨貯藏時間的延長呈先增加后降低的趨勢；醛類物質(zhì)在貯藏6 ～12 d內(nèi)含量顯著增加；含氮類物質(zhì)僅在貯藏9 d和15 d時有少量檢出。2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇、(Z)-5-癸烯-1-醇、1-辛醇、2-甲基-1-辛醇、1-壬醇、(Z)-4-癸烯-1-醇及(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇和(Z)-7-癸烯醛這些揮發(fā)性有機物在不同貯藏時期的刺參中差別較大，可能是造成不同貯藏時間下刺參揮發(fā)性氣味不同的主要成分。

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Analysis of volatiles compounds change of sea cucumber during cold storage by electronic nose combined with GC-MS

ZHANG Peng1, XIAO Shui-shui2, LI Jiang-kuo1*, NONG Shao-zhuang2

1(National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agriculture Products(Tianjin), Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products, Tianjin 300384, China)2(College of Food Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Changes in water content, autoenzyme and total volatile basic nitrogen (TVB-N) of sea cucumber at 0 ℃ were measured, and changes in the volatile compound profile were also investigated by electronic nose combined with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The results showed that PCA and LDA method of electronic nose could effectively distinguish samples at different storage time, and the results was generally consistent with the results of conventional quality indicators, and the 9th day is the changing point of the quality. Totally 33 volatile components were detected in sea cucumber, including many types of alcohols, The content of alcohols was climbed up and then declined with the storage time prolonged. Additionally,a small number of aldehydes was detected, and their higher values were from 6th-9thday. A small amount of nitrogenous substances were detected on the 9thand 15thday.

sea cucumber; volatile compound; electronic nose; GC-MS

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609035

博士，助理研究員(李江闊副研究員為通訊作者，E-mail:lijkuo@sina.com)。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2015BAD￣16B0903)

2016-01-31，改回日期：2016-03-04