添加擴增內(nèi)標的單增李斯特菌PCR檢測方法的建立與應用

張德福，趙禹宗，付緒磊，張明，儀淑敏，徐永霞，殷喆，李春，勵建榮*

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)2(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京，100071)3(渤海大學 數(shù)理學院，遼寧 錦州，121013)

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添加擴增內(nèi)標的單增李斯特菌PCR檢測方法的建立與應用

張德福1, 2，趙禹宗1，付緒磊1，張明1，儀淑敏1，徐永霞1，殷喆2，李春3，勵建榮1*

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)2(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京，100071)3(渤海大學 數(shù)理學院，遼寧 錦州，121013)

以單增李斯特菌inlA基因為靶基因，設計一對特異性引物，以16S rRNA為擴增內(nèi)標對照，建立了一種含有擴增內(nèi)標的單增李斯特菌PCR檢測方法。優(yōu)化了PCR反應體系，并對PCR檢測方法的特異性、靈敏度、人工污染樣品及食品樣品檢測效果進行了測試。對2株單增李斯特菌、1株英諾克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株進行PCR檢測，結果顯示，只有2株單增李斯特菌能被檢出大小為826 bp的特異性片段，其余20株細菌只能檢出1 500 bp的擴增內(nèi)標片段。靈敏度實驗結果顯示，基因組DNA和純培養(yǎng)物的最低檢出限分別為1.80×102fg/μL和1.21×102CFU/mL。當人工污染牛乳樣品中單增李斯特菌在最低接種量為0.48 CFU/mL時，經(jīng)8 h增菌培養(yǎng)后可被該方法檢出。采用該研究建立的檢測方法對36種食品樣品進行檢測，證實了該檢測方法可以指示檢測過程中出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象。綜上所述，該研究建立的PCR檢測方法能特異性的檢測單增李斯特菌，并可有效排除檢測過程中出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象，提高檢測的準確性。

單增李斯特菌；聚合酶鏈式反應；檢測方法；擴增內(nèi)標；內(nèi)化素基因

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌，是目前6種李斯特菌菌株中對人類危害最大的食源性致病菌，能引起人和動物的李氏桿菌病。盡管它在健康人群中的致病率不高，但能引起新生兒和老年人的腦膜炎、敗血癥以及妊娠期孕婦流產(chǎn)等疾患[1]，致死率高達20%～40%[2]。單增李斯特菌普遍存在于自然環(huán)境中，主要包括土壤、腐敗植物、動物排泄物等[3]，極易引起食品加工環(huán)境和食品的污染。據(jù)估計，高達99%的李氏桿菌病病例是通過食用被單增李斯特菌污染的食品所致[2]。因此建立一種快速而準確的單增李斯特菌檢測方法是預防李氏桿菌病和保障食品安全的重要手段。

目前單增李斯特菌的檢測方法仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法為主，操作繁瑣，檢驗周期長，準確率低。基于PCR的檢測技術，因其操作簡便、檢測迅速、靈敏度較高一直是致病性微生物快速檢測的研究熱點。但是，由于食品檢測過程中需要進行增菌培養(yǎng)，而食品樣品殘渣、培養(yǎng)基以及微生物本身都會帶來一些PCR反應抑制因素，影響PCR反應，導致檢測結果出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象?，F(xiàn)有研究表明，在PCR反應體系中添加擴增內(nèi)標可以有效指示PCR反應過程中出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象[4-5]。擴增內(nèi)標是PCR反應體系中用以指示假陰性現(xiàn)象的一段人工構建DNA序列或一段致病菌自身的看家基因片段[6-7]。引物27F/1492R是一對擴增細菌16S rRNA的通用引物，能通過PCR反應從大部分細菌中擴增出一條大小約為1 500 bp的核酸片段。在PCR反應體系中添加引物27F/1492R，可以通過以食品樣品中的細菌作為模板擴增出一條內(nèi)標條帶，作為PCR檢測過程中指示假陰性結果的擴增內(nèi)標。

內(nèi)化素(InternalinA，InlA)是單增李斯特菌表面獨有的蛋白[8]，由基因inlA編碼。ALMEIDA等[9]的研究表明inlA基因序列作為單增李斯特菌檢測的靶基因具有極高的特異性，能對單增李斯特菌進行有效鑒定。本研究擬以單增李斯特菌inlA基因為靶基因，設計一對檢測單增李斯特菌的特異性引物，添加16S rRNA擴增通用引物27F/1492R作為擴增內(nèi)標，建立一種食品中單增李斯特菌的檢測方法，以達到快速檢測食品中單增李斯特菌并指示檢測過程中可能出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象的目的。

1　材料與方法

1.1實驗材料(表1)

1.1.1實驗用菌株及來源

表1　實驗用菌株及其PCR結果

1.1.2主要儀器及試劑

Taq-PCR Master Mix、細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker D2000，生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖，Sigma公司；LB培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限公司；APW培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂，青島高科園海博生物技術有限公司。

Mastercycler pro梯度PCR儀、5424R冷凍離心機，德國艾本德股份有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司；DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺，東聯(lián)哈爾(北京)儀器制造有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；LC-08拍擊式均質器，寧波立成儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1引物設計與篩選

根據(jù)GenBank上單增李斯特菌內(nèi)化素基因inlA(GenBank:CP001604)的核酸序列，使用Primer Primer 5.0軟件設計引物，得到一對檢測單增李斯特菌的特異性引物inlAF/R。實驗所用引物均由生工生物公司合成，將引物稀釋至濃度為10 μmol/L的工作液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄屑皵U增片段長度見表2。

表2　引物序列及擴增片段長度

1.2.2菌種培養(yǎng)及基因組DNA提取

實驗所用副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌均使用APW固體和液體培養(yǎng)基純化和培養(yǎng)，其余細菌均使用LB固體和液體培養(yǎng)基純化和培養(yǎng)。細菌經(jīng)增菌培養(yǎng)后，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取所有細菌的基因組DNA。

1.2.3單增李斯特菌DNA濃度測定

使用超微量分光光度計測定提取的單增李斯特菌DNA溶液濃度，濃度測定后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4PCR檢測方法的建立

根據(jù)Taq-PCR Master Mix說明書所提供的PCR反應體系及程序，對PCR反應體系的各組分含量以及擴增程序進行優(yōu)化。最終確定PCR反應最佳體系為：Taq-PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的引物27F/1492R和inlAF/R各1 μL，DNA模板5 μL，無菌超純水3.5 μL。PCR反應最佳程序為：94 ℃預變性4 min；40個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性30 s，55.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像儀下觀察結果。

1.2.5特異性實驗

使用建立的含擴增內(nèi)標的PCR檢測方法對表1中細菌的基因組DNA進行檢測，以驗證所建立檢測方法的特異性。

1.2.6靈敏度檢驗

1.2.6.1基因組DNA靈敏度檢測

將提取的單增李斯特菌基因組DNA用無菌超純水進行10倍梯度稀釋，使用建立的PCR擴增體系對各稀釋度的基因組DNA溶液進行擴增檢測。PCR產(chǎn)物的電泳結果中，能得到大小約為800 bp肉眼可見條帶的最小DNA濃度，視為該檢測方法的基因組DNA檢測靈敏度。

1.2.6.2純培養(yǎng)物靈敏度檢測

將活化的單增李斯特菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取106、107、108三個稀釋度的菌液進行平板計數(shù)。單增李斯特菌菌液濃度測定的同時，取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中，10 000 g離心5 min收集菌體，加1 mL無菌超純水重懸菌體，再用無菌超純水進行10倍梯度稀釋。細菌基因組DNA提取采用BILUNG等[10]的方法，取每個濃度梯度的菌液各1 mL置于1.5 mL的離心管中，沸水浴煮10 min后冰浴10 min裂解細菌。將細胞裂解物離心沉淀后，取上清液作為DNA模板進行PCR檢測，得到該PCR檢測方法的純培養(yǎng)物檢測靈敏度。

1.2.7.1人工污染食品樣品制備

取10份新鮮巴氏殺菌牛乳，每份25 mL，取適當稀釋度的單增李斯特菌菌液接種于無菌牛乳中，使牛乳中細菌濃度分別為0～1、1～10、10～100 CFU/mL，每組做3個平行實驗。另取1份無菌牛乳作為空白對照。

1.2.7.2人工污染樣品的增菌及PCR檢測

將9份25 mL的人工污染牛乳及1份空白對照牛乳添加到225 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃, 150 r/min搖床培養(yǎng)。每隔2 h取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中，連續(xù)取樣6次。待取樣完畢后，將菌液10 000 g離心5 min收集菌體，使用無菌生理鹽水離心洗滌1次后，加入100 μL無菌超純水重懸沉淀。按照純培養(yǎng)物靈敏度檢測中的方法提取樣品中細菌的DNA，提取的DNA模板進行PCR檢測。

1.2.8食品樣品檢測

采集新鮮食品樣品，每份樣品取25 g，加入到盛有225 mL LB液體培養(yǎng)基的無菌均質袋中。使用拍擊式均質器拍打2 min后，將均質袋置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。每份樣品取1 mL置于1.5 mL離心管中，1 000 g離心1 min去除食物殘渣，取上清液置于新的1.5 mL離心管中。以1.2.7.2中的實驗方法對樣品進行檢測。

2　結果

2.1基因組DNA濃度

經(jīng)分光光度計測定，提取的單增李斯特菌DNA溶液濃度為180.25 ng/μL。

2.2特異性實驗

對表1中細菌的基因組DNA進行PCR檢測。結果如表1所示，只有2株單增李斯特菌能擴增出約為800 bp的特異性條帶和1 500 bp的內(nèi)標對照條帶，1株英諾克李斯特菌及19株非李斯特菌菌株只能擴增出約1 500 bp的內(nèi)標對照條帶，表明引物inlA F/R特異性良好。

2.3靈敏度實驗

2.3.1基因組DNA靈敏度檢測

單增李斯特菌濃度為1.80×106～0.18 fg/μL的基因組DNA溶液PCR檢測結果如圖1所示。當基因組DNA稀釋至1.80×102fg/μL時，仍有大小約為800 bp肉眼可見條帶，表明本實驗所建立的PCR檢測方法對單增李斯特菌基因組DNA的檢測靈敏度為1.80×102fg/μL。

1-8：單增李斯特菌基因組DNA濃度1.80×106～0.18 fg/μL，9：陰性對照圖1　單增李斯特菌基因組DNA檢測靈敏度Fig.1　Sensitivity evaluation for L. monocytogenes genomic DNA

2.3.2純培養(yǎng)物靈敏度檢測

經(jīng)平板菌落計數(shù)得單增李斯特菌的菌液濃度為1.21×1011CFU/mL。各稀釋度單增李斯特菌菌液PCR檢測結果如圖2所示，當單增李斯特菌菌液濃度稀釋至1.21×102CFU/mL時，PCR檢測結果仍有大小約為800 bp的肉眼可見條帶，因此確定本研究的PCR檢測方法對單增李斯特菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度為1.21×102CFU/mL。

M：D2000 DNA ladder；1-7：單增李斯特菌菌體濃度1.21×106～1.21 CFU/mL；8：陰性對照圖2　單增李斯特菌純培養(yǎng)物檢測靈敏度Fig.2　Sensitivity evaluation for L.monocytogenes pure cultures

2.4人工污染樣品檢測結果

3組人工污染牛乳中接種的單增李斯特菌菌體濃度為：0.48 CFU/mL、4.84 CFU/mL、48.4 CFU/mL。PCR檢測結果如表3所示，接菌量為48.4 CFU/mL和4.84 CFU/mL的牛乳樣品中，在增菌培養(yǎng)4～6 h后即可檢出。接菌量為0.48 CFU/mL的牛乳樣品則需要增菌培養(yǎng)8 h才可以檢出。這表明，使用該PCR檢測方法，樣品只需經(jīng)8 h增菌培養(yǎng)即可鑒定食品樣品是否被單增李斯特菌污染。

2.5食品樣品檢測

實驗共采集食品樣品36份，其中雞蛋6份，果蔬16份，水產(chǎn)品4份，豆制品4份，畜肉6份。PCR檢測結果顯示，36份樣品中有32份樣品檢測出擴增內(nèi)標條帶，其中有1份雞蛋樣品和1份豆制品檢測出單增李斯特菌特異性條帶。表明，有4份樣品檢測結果呈現(xiàn)假陰性，有2份樣品確認污染單增李斯特菌。對4份檢測呈假陰性的樣品增菌液稀釋后重新進行檢測，均能檢測出擴增內(nèi)標條帶，未出現(xiàn)單增李斯特菌特異性條帶，表明這4份樣品增菌液中含有PCR反應抑制因子。

表3　人工污染食品樣品檢測結果

3　討論

本研究以細菌自身的16S rRNA為擴增內(nèi)標，只需向體系中添加16S rRNA擴增通用引物27F/1492，不需向PCR反應體系中另外添加擴增內(nèi)標片段，避免了因擴增內(nèi)標與目的基因交聯(lián)結合導致檢測靈敏度下降的現(xiàn)象。研究檢測單增李斯特菌基因組DNA檢測靈敏度為1.80×102fg/μL，純培養(yǎng)物靈敏度為1.21×102CFU/mL，與徐義剛等[11]報道的純培養(yǎng)物檢測靈敏度1.51×102CFU/mL相仿。由人工污染牛乳樣品檢測實驗可知，接菌量僅為0.48 CFU/mL的牛乳樣品經(jīng)過8h增菌培養(yǎng)后即可檢出。這表明，被單增李斯特菌污染的食品樣品，最多經(jīng)過8h增菌培養(yǎng)，即可被本研究檢測方法檢出，加上DNA模板提取、PCR擴增和電泳分析過程，整個檢測至多需要12 h，遠低于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法。實際樣品檢測過程中36份食品樣品有4份未擴增出內(nèi)標片段，通過對菌體洗滌、稀釋操作后重新進行PCR檢測，均能擴增出內(nèi)標條帶。表明，PCR反應中存在抑制因素，本研究建立的PCR檢測方法可以指示檢測過程中出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象。

綜上所述，本研究所建立的添加擴增內(nèi)標的單增李斯特菌PCR檢測方法具有較高的特異性及靈敏度，能有效指示檢測過程中出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象，提高檢測的準確性，能為單增李斯特菌的檢測提供一種快速、高效、準確的方法。

[1]KANKI M, NARUSE H, TAGUCHI M, et al. Characterization of specific alleles inInlA andPrfA ofListeriamonocytogenesisolated from foods in Osaka, Japan and their ability to invade Caco-2 cells[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015, 211:18-22.

[2]KOVACEVIC J, ARGUEDAS-VILLA C, WOZNIAK A, et al. Examination of food chain-derivedListeriamonocytogenesstrains of different serotypes reveals considerable diversity ininlA genotypes, mutability, and adaptation to cold temperatures.[J]. Appl Environ Microbiol,2013, 79(6):1 915-1 922.

[3]KATHARIOU S.Listeriamonocytogenesvirulence and pathogenicity, a food safety perspective[J]. Journal of Food Protection, 2002, 65(11): 1 811-1 829.

[4]HOORFAR J, MALOMY B, ABDULMAWJOOD A, et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology,2004, 42(5):1 863-1 868.

[5]ZHANG W J, CAI Q, GUAN X, et al. Detection of peanut (Arachishypogaea) allergen by Real-time PCR method with internal amplification control[J].Food Chemistry,2015,174:547-552.

[6]李雪玲, 陳勇, 張健. 添加有擴增內(nèi)標的PCR技術在食源性致病菌檢測中的應用[J]. 食品工業(yè), 2013(4):189-191.

[7]何曉華, 史賢明. 擴增內(nèi)標及其在食源性致病菌PCR檢測中的應用[J]. 微生物學報, 2010,40(2):141-147.

[8]COSSART P, PIZARRO-CERDA J, LECUIT M. Invasion of mammalian cells byListeriamonocytogenes: functional mimicry to subvert cellular functions[J]. Trends in Cell Biology, 2003,13(1):23-31.

[9]ALMEIDA P F, ALMEIDA R C C. A PCR protocol using inl gene as a target for specific detection ofListeriamonocytogenes[J]. Food Control, 2000, 11(2):97-101.

[10] BILUNG L M, RADU S, BAHAMAN A R, et al. Detection ofVibrioparahaemolyticusin cockle (Anadaragranosa) by PCR[J]. Fems Microbiology Letters, 2005, 252(1):85-88.

[11] 徐義剛, 李丹丹, 張柏棋, 等. 基于雙啟動引物特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌的PCR方法[J].食品工業(yè)科技,2014,35(10): 86-89.

Development and application of a PCR method with an internal amplification for detection ofListeriamonocytogenes

ZHANG De-fu1,2, ZHAO Yu-zong1, FU Xu-lei1, ZHANG Ming1, YI Shu-min1,XU Yong-xia1, YIN Zhe2, LI Chun3, LI Jian-rong1*

1(College of Food Science and Project Engineering,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products;Jinzhou 121013,China)2(Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing 100071,China)3(College of Mathematics and Physics,Bohai University,Jinzhou 121013,China)

Aimed to develop a PCR method with an internal amplification control (IAC) for detection ofListeriamonocytogenes, a pair of new specific primers were designed based oninlA gene ofL.monocytogenes, and the 16S rRNA sequence was used as the IAC. In this study, the PCR protocol was optimized, and the specificity, sensitivity, effect of artificially contaminated food and food samples were evaluated. The results of detection for 2 strains ofL.monocytogenes, one strain ofL.innocuaand 19 non-Listeria showed that, amplified fragments from 2 strains ofL.monocytogeneswere 826 bp as desired and the products from other 20 strains were 1465 bp fragment of IAC. From sensitivity detection, the pure genomic DNA is 1.80×102fg/μL, and the pure culture is 1.21×102CFU/mL. If theL.monocytogenesinoculation was 0.48 CFU/mL in artificially contaminated milk,L.monocytogenescould be detected after 8 hours of enrichment culture. Thirty-six food samples were detected by this method established in this study and the results demonstrated that it could effectively eliminate false-negative results. In summary, a novel PCR method was successfully developed in this study, which could specificity detectL.monocytogenesand could especially eliminate false-negative results.

Listeriamonocytogenes;polymerase chain reaction;detection method;internal amplification control;inlA

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609033

博士,講師(勵建榮教授為通訊作者,E-mail: zhangdf@bhu.edu.cn)。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD29B06)；博士后科學基金(2015M582803)；病原微生物生物安全國家重點實驗室開放課題(SKLPBS1520)；遼寧省重點實驗室開放課題(LNSAKF2013018)；遼寧省高等學校創(chuàng)新團隊項目(LT2014024)

2015-12-11，改回日期：2016-04-11