秀珍菇子實(shí)體多糖PFP-m的膜法分離及其性質(zhì)研究

孫玉軍，周禮元

1(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)，233100) 2(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 合肥，230601)

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秀珍菇子實(shí)體多糖PFP-m的膜法分離及其性質(zhì)研究

孫玉軍1*，周禮元2

1(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)，233100) 2(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 合肥，230601)

以秀珍菇子實(shí)體為原料，經(jīng)閃式提取、Sevag法脫蛋白、不同孔徑的濾膜分離，得到秀珍菇子實(shí)體多糖(PFP-m)。采用光譜分析和比色等方法對(duì)其部分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：PFP-m為均一組分，分子質(zhì)量為3.27×104Da；具有多糖的特征吸收峰；PMP衍生化結(jié)合HPLC法得出其單糖組成及摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖=3.10∶1.00∶22.99∶6.85∶4.59。PFP-m具有多糖的一般理化性質(zhì)，總糖含量為93.16 %。與柱層析法相比，膜超濾法操作簡(jiǎn)單，效率高，適合秀珍菇子實(shí)體多糖PFP-m的分離純化。

秀珍菇；子實(shí)體；多糖；膜分離

多糖是生物體內(nèi)具有重要功能的生物大分子之一，在自然界分布廣泛，主要存在于動(dòng)物、植物、微生物等機(jī)體內(nèi)，具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫[1]、抗腫瘤等功效[2]。

多糖的提取方法有熱水浸提、超聲提取、微波提取、超高壓提取、超臨界提取、酶法提取等，不同的提取方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)[3]。閃式提取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高效的提取方法，其原理是利用高速機(jī)械剪切力和超速動(dòng)態(tài)分子的滲濾作用，在一定的溫度(如室溫)和溶劑條件下，將植物、食用菌子實(shí)體等材料破碎成細(xì)微顆粒，使待提成分迅速達(dá)到微粒組織的內(nèi)外平衡，能最大限度的保留材料的有效成分，具有速度快、效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，適合多糖等活性物質(zhì)的有效提取[4]。

獲得多糖純品，除了去除蛋白、脫色素等除雜外，還需進(jìn)一步分離純化。近年來(lái)，膜過(guò)濾法開(kāi)始用于多糖等生物活性物質(zhì)的分離與純化[5-8]。本文以秀珍菇子實(shí)體為材料，采用閃式提取、閃式蒸餾、乙醇沉淀、Sevag法脫蛋白得秀珍菇粗多糖(PFP)，PFP經(jīng)膜超濾技術(shù)獲得均一多糖PFP-m，并通過(guò)紅外光譜、紫外光譜、液相色譜等方法對(duì)其理化性質(zhì)和部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)子實(shí)體，由安徽科技學(xué)院食用菌研究所陸曉民教授提供。

標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T3,T10,T40,T70,T100, T200,T500,T2000，瑞典Pharmacia公司；DEAE-Sepharose F.F，瑞典Pharmacia公司；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器與設(shè)備

JHBE-50T閃式提取器，河南智晶生物科技股份有限公司；JMF-320G多級(jí)閃蒸器，河南智晶生物科技股份有限公司； AKTA Purifier10 FPLC，GE公司； Masterflex蠕動(dòng)泵，Cole-Parmer公司；Vivaflow50 超濾膜， Sartorius Stedim Biotech公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；Nicolet 380紅外光譜儀，Thermo公司；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent1260蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Agilent 公司；UltrahydrogelTM1000色譜柱(7.8 mm×300 mm)，Waters公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1秀珍菇粗多糖的閃式提取

秀珍菇子實(shí)體粉末200 g，加入7 000 mL蒸餾水，電子轉(zhuǎn)速8 000 r/min，閃式提取器閃式提取2 min，提取液經(jīng)多級(jí)閃蒸器濃縮至適當(dāng)體積，加3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇沉淀12 h，4 500 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)蒸餾水復(fù)溶，離心，上清液冷凍干燥得秀珍菇子實(shí)體粗多糖。

1.3.2秀珍菇粗多糖的脫蛋白[9]及HPLC 法[10]檢測(cè)

取一定質(zhì)量的秀珍菇粗多糖，用蒸餾水溶解，加入多糖溶液1/4體積的Sevag試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]脫蛋白數(shù)次，直至中間層無(wú)蛋白出現(xiàn)，再經(jīng)冷凍干燥得多糖干粉(PFP)。取少許PFP溶于適量的二蒸水中，12 000 r/min離心10 min，上清液再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為10 μL，色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTM1000(7.8 mm×300 mm)；流動(dòng)相為二蒸水，流速為1 mL/min；柱溫35 ℃，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)，根據(jù)HPLC圖譜分析，判斷PFP含有多糖的種類(lèi)及相應(yīng)的分子質(zhì)量。

1.3.3PFP的超濾膜分離

取PFP溶于適當(dāng)體積的二蒸水，12 000 r/min離心10 min，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，根據(jù)PFP的HPLC圖譜(圖1)可知，第三個(gè)峰面積最大，且其保留時(shí)間與Dextran T40(分子質(zhì)量40 kDa)相近，因此首先選擇截留分子質(zhì)量50 kDa的超濾膜超濾，跨膜壓力為103.42 kPa，收集濾液；濾液再選擇截留分子質(zhì)量5 kDa的超濾膜超濾，跨膜壓力為103.42 kPa，收集截留液，截留液經(jīng)冷凍干燥，命名為秀珍菇子實(shí)體多糖PFP-m。

1.3.4PFP-m的純度鑒定及分子質(zhì)量測(cè)定

1.3.4.1純度鑒定

采用HPLC法[10]。

1.3.4.2分子質(zhì)量測(cè)定

采用HPLC法[10]。系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖和樣品PFP-m用二蒸水溶解，12 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為20 μL。色譜條件：色譜柱UltrahydrogelTM1000；流動(dòng)相為二蒸水，流速為1 mL/min；柱溫35 ℃，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(Dextran)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值(lgMw)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.5PFP-m紫外光譜掃描

取適量的PFP-m用適量的二蒸水溶解，于190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.3.6PFP-m紅外光譜掃描

樣品采用KBr壓片，于400～4 000 cm-1掃描。

1.3.7PFP-m的單糖組分測(cè)定

采用PMP柱前衍生化法[11]。樣品經(jīng)三氟乙酸(TFA)水解，水解后的樣品和鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)等標(biāo)準(zhǔn)單糖與PMP發(fā)生衍生化反應(yīng)，所得產(chǎn)物采用HPLC法檢測(cè)分析。流動(dòng)相為PBS(50 mmol/L)-乙腈混合物，柱溫25 ℃，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.8PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量測(cè)定

理化性質(zhì)測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行；總糖含量測(cè)定以葡聚糖T40為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[13]。

2　結(jié)果與分析

2.1秀珍菇粗多糖的提取結(jié)果

秀珍菇子實(shí)體經(jīng)閃式提取、閃蒸、離心、醇沉、冷凍干燥獲得17.16 g粗多糖，得率為8.58%，比楊潤(rùn)亞等[14]采用的超聲提取秀珍菇子實(shí)體多糖的得率6.19 mg/g(即6.19%)高，且提取時(shí)間短，這主要是由于閃式提取伴有高速攪拌、超強(qiáng)振動(dòng)、負(fù)壓滲透等作用實(shí)現(xiàn)秀珍菇子實(shí)體組織的快速破碎，浸提時(shí)間短、提取效率高的緣故。

2.2PFP、PFP-m的HPLC的檢測(cè)及膜超濾結(jié)果

PFP、PFP-m的HPLC檢測(cè)圖譜如圖1、圖2所示。由圖1可知，PFP含有4種多糖，按照分子質(zhì)量從大到小依次命名為PFP-1、PFP-2、PFP-3、PFP-4，保留時(shí)間分別為6.349、7.607、8.794、10.972 min。根據(jù)葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 lgMw=8.900 6-0.498 7t(R2=0.998 8)計(jì)算出它們的分子質(zhì)量分別為5.42×105、1.28×105、3.27×104、2.7×103Da，因此選擇截留分子質(zhì)量50、5 kDa的超濾膜分離多糖。

圖1　PFP 的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC of PFP

圖2　PFP-m的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC of PFP-m

PFP經(jīng)截留分子質(zhì)量50 kDa的超濾膜超濾，濾液再經(jīng)5 kDa的超濾膜超濾，截留液冷凍干燥得白色絮狀物質(zhì)，即為秀珍菇子實(shí)體膜分離多糖PFP-m，得率為73.21%，分子質(zhì)量在5～50 kDa。

由圖2可以看出，PFP-m的液相色譜圖均呈單一狹長(zhǎng)對(duì)稱(chēng)峰，表明其純度高，為均一組分。其保留時(shí)間和圖1中的第三個(gè)峰(PFP-3)的保留時(shí)間一致，可判斷PFP-m 和PFP-3為同一種多糖。

2.3PFP-m的紅外光譜分析

PFP-m在190～400 nm掃描發(fā)現(xiàn)，在260、280 nm處均沒(méi)有吸收峰，表明PFP-m既不含有蛋白，也不含有核酸。

2.4PFP-m的紅外光譜分析

PFP-m的紅外光譜圖譜見(jiàn)圖3。PFP-m典型吸收峰均在3 425.13、2 931.41、1 637.35、1 403.10、1 145.57、1 035.01 cm-1波數(shù)位置。3 425.13 cm-1吸收峰是由O—H的伸縮振動(dòng)引起的，2 931.41 cm-1吸收峰是由糖類(lèi)C—H伸縮振動(dòng)引起的，它是糖類(lèi)的特征吸收峰；1 637.35 cm-1吸收峰是由糖類(lèi)O—H的彎曲振動(dòng)引起的；1 403.10 cm-1吸收峰是由糖類(lèi)C—H變角振動(dòng)引起的；1 035.01 cm-1吸收峰是由吡喃糖環(huán)引起的。紅外光譜表明PFP-m是一種含有吡喃糖苷鍵的多糖。

圖3　PFP-m的紅外掃描圖譜Fig.3　IR spectrum of PFP-m

2.5PFP-m的單糖組成分析

PFP-m的水解物PMP衍生化高效液相色譜圖見(jiàn)圖4。根據(jù)液相色譜的保留時(shí)間可判斷PFP-m含有Man、Rha、Glc、Xyl、Ara 5種組分，它們的摩爾比為Man∶Rha∶Glc∶Xyl∶Ara=3.10∶1.00∶22.99∶6.85∶4.59，PFP-m的單糖組分中，葡萄糖含量最高，鼠李糖含量最低。

1-甘露糖；2-鼠李糖；3-葡萄糖；4-半乳糖；5-木糖；6-阿拉伯糖圖4　標(biāo)準(zhǔn)單糖(a)與PFP-m(b)水解物的PMP衍生化液相色譜圖Fig.4　PMP-labeled HPLC spectrum of standard monosaccharides(a) and PFP-m(b)

2.6PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量

PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知PFP-m不是淀粉類(lèi)物質(zhì)，也不是單糖和多酚類(lèi)物質(zhì)，而是典型的多糖類(lèi)物質(zhì)。

表1　PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量

3　結(jié)論與討論

目前實(shí)驗(yàn)室中均一多糖的分離純化多采用離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾柱層析法，柱層析法操作繁瑣，上樣量少，分離制備的效率低，不能進(jìn)行大規(guī)模的制備。而膜超濾法操作簡(jiǎn)單，分離制備的量大，效率高，適合工廠化生產(chǎn)。但不是所有的多糖都可以采用膜分離法來(lái)制備，首先要看目的多糖與其他物質(zhì)的分子質(zhì)量大小差距有沒(méi)有合適的膜可供選擇，其次要看被分離的多糖粘性是否大，如果黏性過(guò)大，易產(chǎn)生膜污染和膜孔堵塞，引起膜滲透通量下降。因此在膜分離過(guò)程中，多糖的濃度不能太大，否則會(huì)引起黏性的增加，造成超濾困難。

本文采用閃式提取、閃式蒸餾的方法制備的秀珍菇子實(shí)體粗多糖，提取率高，能耗低，制備時(shí)間短，效率高，該方法適合秀珍菇子實(shí)體多糖的提取。

秀珍菇子實(shí)體粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后、采用截留分子量50 kDa和5 kDa的超濾膜分離得到1種秀珍菇子實(shí)體多糖PFP-m。經(jīng)測(cè)定，PFP-m為一種均一多糖，且含量高，達(dá)到73.21 %，該方法適合秀珍菇子實(shí)體多糖PFP-m的分離純化。

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Separation of polysaccharide PFP-m fromPleurotusgeesteranusfruit body by ultrafiltration membrane and its property

SUN Yu-jun1*, ZHOU Li-yuan2

1(School of Life Science, Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100, China)2(School of Life Science, AnhuiUniversity, Hefei 230601, China)

A polysaccharide(PFP-m)was obtained from the fruit body ofPleurotusgeesteranusby a sequential processing of flash extraction, deproteinization and separation through different pore ultrafiltration membrane. Its partial properties and structure were studied by spectrographic method and colorimetry. The results showed that PFP-m was a homogeneous polysaccharide. ItsMw was 3.27×104Da. Typical polysaccharide absorption of PFP-m was in its IR spectrum. PFP-m consists of Man, Rha, Glc, Xyl, Ara, in molar ratios of 3.10∶1.00∶22.99∶6.85∶4.59 by PMP-HPLC. PFP-m has general physical and chemical properties of polysaccharide and its total sugar content were 93.16 %. Compared with column chromatography, ultrafiltration membrane method was easier to operate and more efficient. It was suitable for separation and purification of polysaccharide PFP-m frompleurotusgeesteranusfruit body.

Pleurotusgeesteranus; fruit body; polysaccharide; membrane separation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609029

在讀博士，教授(本文通訊作者，E-mail：sunyujun208@163.com)。

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A052)；安徽大學(xué)現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心2015年度開(kāi)放課題(BM2015004)；安徽省高校2016年優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(gxyqZD2016211)；安徽科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(AKZDXK2015B02)

2015-11-10，改回日期：2016-02-23