耐二氧化硫乳酸菌的篩選鑒定及其在泡野山椒中的應(yīng)用

胡露，胡凱弟，王興潔，雷承延，周康,2，陳安均，劉書亮,2*

1 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)2 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

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耐二氧化硫乳酸菌的篩選鑒定及其在泡野山椒中的應(yīng)用

胡露1，胡凱弟1，王興潔1，雷承延1，周康1,2，陳安均1，劉書亮1,2*

1 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)2 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

篩選出2株源于泡蒜的耐SO2乳酸菌，對其形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試及16S rDNA序列測定，菌株2-2被鑒定為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，菌株2-5為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。利用2株菌耐SO2特性，將其應(yīng)用于野山椒泡制中，對含SO2的泡野山椒基礎(chǔ)配方進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：2株菌均在含SO2150 mg/L的MRS培養(yǎng)基中能正常生長；將2菌株按1∶1的比例混合，以2%(v/w)的接種量接種至含SO275 mg/L，鹽含量4%，蔗糖含量2%的野山椒中，室溫發(fā)酵，成熟的泡野山椒酸咸適宜，色澤金黃、味道鮮美，具有泡野山椒典型的香氣，為其工業(yè)生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

耐SO2；乳酸菌；泡野山椒；發(fā)酵

野山椒(Capsicumfrutescensvar)俗稱天椒、小米辣，果實(shí)呈米粒形或短指形，果皮主要為淡黃色、綠色，辣味濃郁[1]。野山椒經(jīng)泡制發(fā)酵后，具有脆嫩芳香，辣中帶酸、辣而不燥的特點(diǎn)，可增食欲、助消化、具有營養(yǎng)保健[2]的功效。泡野山椒的傳統(tǒng)制作多以添加有機(jī)酸和SO2的化學(xué)法進(jìn)行。對野山椒的護(hù)色需要添加一定量的SO2，SO2可殺死不耐受SO2的乳酸菌及其他微生物。也有采用自然發(fā)酵法，其發(fā)酵周期緩慢，甚至雜菌污染而發(fā)生“生花”、變軟、褐變等現(xiàn)象，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[3]。乳酸菌作為泡菜發(fā)酵的主要菌群，其具有發(fā)酵糖產(chǎn)酸，降低環(huán)境pH值，改善泡菜風(fēng)味等功能[4]。隨著泡菜工業(yè)化的發(fā)展，人工接種乳酸菌已成為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的新趨勢。而目前關(guān)于利用乳酸菌發(fā)酵泡野山椒以改善泡椒品質(zhì)的研究還鮮有報道。

有研究表明：泡菜色澤變化的主要原因有酶促褐變、維生素C氧化以及雜菌生長引起的變色等[5]。野山椒中Vc含量高，在發(fā)酵過程中易被氧化而引起變暗或變黑的現(xiàn)象[6]，嚴(yán)重影響產(chǎn)品外觀、風(fēng)味、營養(yǎng)價值，甚至商品價值。護(hù)色與防腐成為泡野山椒加工的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于亞硫酸鹽離子的親核反應(yīng)性，使其具有能廣泛抑制褐變的功能[7]，對食品能夠起到漂白、抑菌[8]、脫色和抗氧化[9]的作用。在泡野山椒生產(chǎn)中添加SO2或亞硫酸鹽，對泡野山椒可以起到很好的護(hù)色作用，防止其褐變，使用低濃度的SO2不僅能達(dá)到理想效果減少殘留，且能降低生產(chǎn)成本[10]。而SO2的抑殺菌作用會對泡野山椒中乳酸菌的生長發(fā)酵產(chǎn)生抑制效果，實(shí)際生產(chǎn)中往往出現(xiàn)泡野山椒自然發(fā)酵失敗或?yàn)榱朔栏霈F(xiàn)SO2殘留超標(biāo)的現(xiàn)象。為了能使泡野山椒產(chǎn)生良好的風(fēng)味與色澤，采用接種耐受SO2的乳酸菌和添加SO2產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，因此，本試驗(yàn)以篩出耐SO2乳酸菌并將其應(yīng)用于發(fā)酵野山椒中，優(yōu)化泡野山椒的基礎(chǔ)配方，為泡野山椒的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1原料

野山椒購自四川省雅安市蒼坪路農(nóng)貿(mào)市場；食鹽、蔗糖均為食品級，購自雅安市吉選超市。

1.2菌株

乳酸菌株2-2和2-5分離于泡蒜；菌株8m-9(植物乳桿菌，Lactobacillusplantarum)、3m-1(腸膜明串珠菌，Leuconostocmesenteroides)分離于什錦泡菜[11]；菌株6066分離于葡萄酒，為酒明串珠菌(Leuconostocoenos)。由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL。pH 6.0～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.4試劑

焦亞硫酸鈉為食品級，市售。鹽酸、乙酸鉛、淀粉指示液、碘標(biāo)準(zhǔn)溶液、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、酚酞指示劑；乳酸菌生化鑒定管，青島海博生物技術(shù)有限公司；溶菌酶(10 mg/mL)，北京天為時代科技有限公司；Taq酶、PCR反應(yīng)試劑，寶生物工程(大連)有限公司；TIANGEN試劑盒(TIANamp Bacteria DNAkit 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒-離心柱型)，天根科技生化(北京)有限公司。

1.5主要儀器

DHG-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SorvallST16R高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司；PTC-200 PCR儀，美國Bio-Rad公司；CX21FS1光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；pHS-4C+數(shù)顯酸度計,成都世紀(jì)方舟科技有限公司；G154DW全自動高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司。

1.6方法

1.6.1耐SO2乳酸菌的篩選

將4 ℃冰箱保存的斜面乳酸菌菌種，接種到MRS培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，以1%的接種量接種菌濃度為107CFU/mL的菌液到SO2含量分別為0、50、100、150、200 mg/L的MRS培養(yǎng)基中，設(shè)定初始pH為5.5，37 ℃培養(yǎng)2 d，采用GB 4789.35—2010測定乳酸菌數(shù),判斷菌株耐受SO2的能力。

1.6.2耐SO2乳酸菌的鑒定

1.6.2.1菌株形態(tài)及生理生化鑒定

在形態(tài)特征觀察的基礎(chǔ)上，參照《乳酸菌鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌鑒定手冊》，選擇青島海博生物技術(shù)有限公司的乳桿菌成套生化試劑進(jìn)行鑒定。

1.6.2.216S rDNA的分子生物學(xué)鑒定

①將菌種接于10 mL MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，收獲菌體。按Bacterial DNAout抽提試劑盒使用手冊提取菌株2-2、2-5的總DNA。

②16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列測定：16S rDNA的通用引物為27F、1492R。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1 μL，2×longTaqPCR MasterMix 12.5 μL(包括：0.1 U longTaqpolymerase/μL，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl，3 mmol/L MgCl2)，超純水9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min，66 ℃ 1 min，72 ℃20 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

③序列分析：PCR產(chǎn)物序列通過BLAST在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[12]。

1.6.3泡野山椒工藝配方優(yōu)化

菌懸液、焦亞硫酸鈉、食鹽、蔗糖

↓

新鮮野山椒→去梗→清洗→瀝干→裝罐→密封→發(fā)酵

原料處理：選擇大小均勻、淡黃色且新鮮的野山椒，剔除色深、已腐爛個體，去梗，清水清洗并瀝干。

裝罐：將冷開水注入罐中，加入焦亞硫酸鈉溶液、食鹽、蔗糖充分?jǐn)嚢枞芙夂?，并接種乳酸菌，按1∶1(w/v)的菜水比例，將野山椒碼放于罐中，使其完全浸沒于鹽水中。

密封：蓋好罐蓋，避免空氣及雜菌進(jìn)入(以pH值降為3.5～3.6為發(fā)酵終點(diǎn))。

1.6.3.1發(fā)酵野山椒

在室溫(日均最高、最低氣溫為25 ℃、15 ℃)下，選取接種混合乳酸菌(A：將篩選的耐SO2乳酸菌2-2∶2-5以1∶1混合接種)、焦亞硫酸鈉(B)、食鹽(C)、蔗糖(D)作為基礎(chǔ)配方成分,參照文獻(xiàn)[13]并在實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)之上設(shè)計4因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素表見表1，以感官評分和總酸為評價指標(biāo)，優(yōu)化泡野山椒基礎(chǔ)工藝配方。

表1　L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.6.3.2檢測指標(biāo)

(1)總酸測定：根據(jù)GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》中的規(guī)定，采用酸堿滴定法，以乳酸計。

(2)SO2殘留測定L按照GB/T 5009.34—2003進(jìn)行，采用直接滴定碘量法。

(3)乳酸菌數(shù)測定：平板計數(shù)法，參照GB 4789.35—2010測定。

(4)感官評價：參照文獻(xiàn)[14]中發(fā)酵辣椒感官評分標(biāo)準(zhǔn)略改動，10人評價小組對產(chǎn)品的色澤、香氣、滋味、質(zhì)地進(jìn)行感官評價，對應(yīng)的評價得分集=[很差(2)，較差(4)，一般(6)，較好(8)，很好(10)]，評價結(jié)果用SPSS.19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株耐SO2能力的測定

將5株菌按照2%的接種量接種到初始pH5.5，SO2質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150、200 mg/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，測定菌數(shù)，結(jié)果見表2。

表2　菌株在不同SO2濃度的發(fā)酵液中的生長情況

一般情況下，細(xì)菌對SO2很敏感，SO2結(jié)合在被細(xì)胞膜束縛的ATP酶上，使細(xì)胞內(nèi)ATP的丟失不受控制，從而影響細(xì)胞活性[6]，較低濃度的SO2對細(xì)菌都有一定的抑制或殺滅作用[15]。由表2可知，菌株6066、8m-9、3m-1的生長繁殖受到SO2的嚴(yán)重影響。無添加SO2培養(yǎng)條件下，從培養(yǎng)開始到結(jié)束，3株菌的菌量由105CFU/mL上升到1010CFU/mL，而在含SO250 mg/L的低濃度培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d后的菌量為104或105CFU/mL，與零添加培養(yǎng)比較，說明菌株在接種至含SO2的培養(yǎng)基后沒有繁殖跡象甚至一部分已經(jīng)死亡。隨著SO2濃度的繼續(xù)升高，菌株死亡增加，菌數(shù)迅速減少，當(dāng)SO2濃度達(dá)到200 mg/L時，這3株菌活菌數(shù)幾乎為零。菌株2-2、2-5雖然隨SO2濃度的升高，菌數(shù)逐漸下降，但降幅遠(yuǎn)低于其余3株菌。當(dāng)SO2濃度在50～150 mg/L區(qū)間內(nèi)時，培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)2菌株菌濃度均能達(dá)到107CFU/mL以上，生長穩(wěn)定，且在含200 mg/L SO2的培養(yǎng)基中，菌數(shù)還能基本維持在初始菌數(shù)范圍內(nèi)，因此認(rèn)為菌株2-2、2-5為耐SO2的乳酸菌。菌株2-2、2-5均從大蒜泡菜水中篩得，試驗(yàn)選擇這兩株菌作為后續(xù)研究對象。

2.2耐SO2乳酸菌的鑒定結(jié)果

菌株2-2、2-5在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的菌落及菌體形態(tài)見圖1和圖2。2菌株在改良MRS平板上的菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊，表面光滑濕潤，隆起，在含碳酸鈣的MRS平板上均有溶鈣圈，菌株2-5呈乳白色，而菌株2-2為淺白色，菌落較小；革蘭氏染色鏡檢結(jié)果均為G+短桿菌。

圖1　乳酸菌菌株2-2的細(xì)胞形態(tài)及菌落形態(tài)Fig.1　Cell morphology and colony morphology of lactic bacteria 2-2

圖2　乳酸菌菌株 2-5的細(xì)胞形態(tài)及菌落形態(tài)Fig.2　Cell morphology and colony morphology of lactic bacteria 2-5

2.2.1生理生化結(jié)果

菌株2-2、2-5的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，2菌株能發(fā)酵分解糖代謝，不還原硝酸鹽，不液化明膠，接觸酶和氧化酶皆呈陰性，結(jié)合形態(tài)特征和《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》初步判斷菌株2-2和2-5屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。

2.2.2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

采用16S rDNA序列同源性分析法對菌株2-2、2-5 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以確定其分類地位。分別以2株菌的總DNA為模版，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司進(jìn)行序列測定，2-2、2-5測序片段長分別為1444 bp、1433 bp，具有典型的16S rDNA的特征。將2菌株的16S rDNA序列輸入GenBank，以Blast 軟件進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果顯示：菌株2-2的16S rDNA基因序列與登錄號為JN175331.1、KJ026616.1等發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)有100%相似性，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支。菌株2-5的16S rDNA基因序列與登錄號為KP862657.1、AJ965482.1等植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)相似性達(dá)100%。2菌株均與嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp)近緣乳酸菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。因此，根據(jù)其親緣關(guān)系，結(jié)合形態(tài)、生理生化鑒定結(jié)果確定2-2為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum2-2)，2-5為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum2-5)。

表3　菌株2-2、2-5的生理生化特征

注：“-”為陰性反應(yīng)，“+”為陽性反應(yīng)。

2.3泡野山椒基礎(chǔ)工藝配方的確定

由表5和表6結(jié)果顯示，影響泡野山椒感官評價的主次順序?yàn)锳(接種量)>C(食鹽添加量)>D(蔗糖添加量)>B(SO2添加量)，即對泡野山椒感官影響最大的因素為乳酸菌的接種量，SO2添加量對其品質(zhì)影響最小，最優(yōu)組合為A3B2C1D3。泡野山椒發(fā)酵產(chǎn)酸方面，最佳組合為A3B1C1D3，乳酸菌接種量和蔗糖添加量對泡野山椒產(chǎn)酸的影響較大，食鹽添加量的影響次之，而SO2添加量的影響最小，這4個因素對泡野山椒產(chǎn)酸的影響都未達(dá)到顯著水平。綜合考慮各因素指標(biāo)，選擇最佳發(fā)酵條件：為A3B2C1D3，即接種量2%，SO2添加量75 mg/L，鹽含量4%，蔗糖含量2%。

圖3　菌株2-2、2-5基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree of strain 2-2 and 2-5

按照以上所得最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果證明，接種量2%，SO2添加量75 mg/L，鹽含量4%，蔗糖含量2%，在室溫(日均最高、最低氣溫為25 ℃、15 ℃)下發(fā)酵5 d后野山椒成熟，其總酸含量為1.05 g/100 mL，乳酸菌數(shù)為1.18×108CFU/mL，感官評分為8.86，泡山椒呈淡黃色、色澤鮮亮，口感酸咸適宜，香氣濃厚。測得樣品中SO2含量為11.2 mg/L，符合國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)。

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果

表5　直觀分析表

表6　方差分析表

注：F0.05(2,9)= 4.26；F0.01(2,9)= 8.02。

3　結(jié)論與討論

篩得2株對SO2具有較強(qiáng)耐受能力的乳酸菌，經(jīng)系統(tǒng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌2-2(Lactobacillusfermentum2-2)、植物乳桿菌2-5(Lactobacillusplantarum2-5)，它們在SO2添加量為150 mg/L培養(yǎng)基中均能正常生長。菌株2-2和2-5均來源于大蒜泡菜水，在蒜制品生產(chǎn)過程中，為使其保持鮮艷色澤和抑制微生物生長常使用亞硫酸鹽[16],這可能是菌株2-2與2-5較其他來源乳酸菌耐SO2的原因。SO2對乳酸菌有強(qiáng)烈的抑制作用，并且低的pH值與SO2的抑制作用有協(xié)同效應(yīng)，原因是SO2在水溶液中會呈現(xiàn)3種形式：游離態(tài)SO2、HSO3-、SO32-，其中游離態(tài)的SO2是唯一一種能夠與食品中一些重要的風(fēng)味及呈色化合物結(jié)合的形態(tài)[17]，酸性條件下結(jié)合態(tài)的SO2易轉(zhuǎn)化成游離態(tài)的SO2，從而增大了游離態(tài)SO2濃度，對乳酸菌造成毒害影響[18]。泡野山椒是酸性食品，其pH值范圍易以游離態(tài)SO2形式的呈現(xiàn)，能起到良好的護(hù)色、抗氧化作用。因此，選育出具有抗逆性的耐SO2乳酸菌是改善泡野山椒品質(zhì)的關(guān)鍵。SO2常作為防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，尤其是偏酸食品例如醬腌菜、果汁、發(fā)酵飲料[19-20]，利用乳酸菌與添加SO2結(jié)合來發(fā)酵野山椒以改善泡野山椒品質(zhì)的報道甚少。目前關(guān)于耐受SO2乳酸菌的研究主要集中在果酒釀造領(lǐng)域。任香蕓[21]等從加硫枇杷汁自然發(fā)酵的枇杷酒中分離篩選得到耐SO2的植物乳桿菌R23，可耐受120 mg/L總SO2及13%酒精。段浩云[22]等分離于自然發(fā)酵的葡萄酒中的菌株G23和L42能在酒精度13% vol、130 mg/L SO2的環(huán)境下生長，2株菌均為植物乳桿菌。

將菌株2-2、2-5以1∶1的比例混合，按照接種量2%接種，SO2添加量為75 mg/L，食鹽含量4%，蔗糖含量2%在室溫下發(fā)酵5 d，得到具有良好風(fēng)味、金黃色澤的泡野山椒，SO2殘留低于國家安全標(biāo)準(zhǔn)，為泡野山椒生產(chǎn)提供了參考數(shù)據(jù)。

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Screening, identification of sulfur dioxide-resistant lactic acid bacterium and its application in fermentation of rod chilli

HU Lu1,HU Kai-di1,WANG Xing-jie1,LEI Cheng-yan1,ZHOU Kang1,2,CHEN An-jun1,LIU Shu-liang1,2*

1(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)2(Institute of Food Processing and Safety, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Two kinds of sulfur dioxide-tolerant lactic acid bacterium were screened from garlic pickled water, and were identified to be asLactobacillusfermentumandLactobacillusplantarumrespectively based on the results of characterization of morphology, physiological and biochemical properties and 16S ribosomal DNA identification. The two strains were applied in fermentation of pickled rod chilli, and the fermentation formula for rod chili containing sulfur dioxide was optimized. Results showed that the two strains could grow well in MRS media containing 150 mg/L SO2. The optimal fermentation formula was as follows: the mixture of strain 2-2 and strain 2-5 with ratio of 1∶1 was inoculated (2%, v/w) into rod chilli sample containing 75 mg/L SO2, 4% of salt, 2% of sucrose, and then fermented at room temperature. By using the optimized fermentation formula based on these two strains, the pickled rod chilli product had golden color, extremely good taste and typical aroma. This work provides a basis for the industrial production of pickled rod chilli.

sulfur dioxide-resistant; lacticacid bacterium; identification;rod chilli;fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609026

碩士研究生(劉書亮教授為通訊作者,E-mail:lsliang￣999@163.com)。

四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(14NZ0012)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性科研項(xiàng)目

2016-03-21，改回日期：2016-05-24