植物乳桿菌B002凍干工藝的條件優(yōu)化

曹珂珂，張立豐，李妍

(蚌埠學院, 生物與食品工程系，安徽 蚌埠，233030)

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植物乳桿菌B002凍干工藝的條件優(yōu)化

曹珂珂，張立豐，李妍

(蚌埠學院, 生物與食品工程系，安徽 蚌埠，233030)

以植物乳桿菌B002為目標，研究了該菌株在凍干過程中菌泥和保護劑平衡時間、預冷凍時間和凍干保護劑對菌粉存活率的影響。結果表明，在以質(zhì)量濃度100 g/L脫脂乳為基礎保護劑的條件下，4 ℃，6 000 r/min離心15 min，菌泥和保護劑在室溫下平衡40 min，厚度5 mm，-45 ℃預冷凍2 h，復合保護劑為質(zhì)量濃度100 g/L的脫脂乳、80 g/L麥芽糊精、30 g/L谷氨酸鈉和100 g/L海藻糖，在上述條件下真空冷凍干燥24 h，植物乳桿菌B002凍干存活率達到75.9%。

植物乳桿菌；真空冷凍干燥；保護劑

隨著研究人員對乳酸菌益生功能的不斷發(fā)現(xiàn)和機理的不斷研究，乳酸菌類產(chǎn)品的用途越來越廣泛[1]。蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌劑的制備，不僅可以高效發(fā)酵蔬菜，縮短生產(chǎn)周期，而且還能降低成本，提高生產(chǎn)效率[2]。乳酸菌劑可以通過噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥等方法制備，其中真空冷凍干燥效果相對較好。真空冷凍干燥用于微生物凍干菌粉制備是利用微生物的生理生化特點，凍干后微生物代謝減緩，生長繁殖受抑制，處于休眠狀態(tài)，因而能保持菌株原有特性[3]。但冷凍干燥會對細胞造成機械損傷，溶質(zhì)損傷，細胞膜通透性改變，蛋白質(zhì)變性，DNA損傷，造成菌粉存活率下降[4-5]，因此提高菌粉存活率是關鍵。

影響菌粉存活率的因素有很多，比如菌種、細胞性狀、細胞生長狀態(tài)、離心條件、預冷凍時間和溫度、保護劑系統(tǒng)、復水介質(zhì)等[6]。保護劑可以改變細胞在凍干過程中的物理、化學環(huán)境，減輕菌體在冷凍和復水時受到的損傷，盡可能保護菌種的原有特性[7]。在前期研究中，筆者從酸黃瓜中分離到植物乳桿菌B002(LactobacillusplantarumB002)，該菌具有一定的產(chǎn)酸，耐鹽，降低亞硝酸鹽含量和膽固醇的能力，在MRS增殖培養(yǎng)基中能實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，其凍干菌粉可以用于蔬菜發(fā)酵中。本試驗對植物乳桿菌B002冷凍干燥條件和凍干保護劑進行優(yōu)化，以期為提高菌粉凍干存活率及開發(fā)商品化蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌劑提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌B002(L.plantarumB002 )分離自酸黃瓜，由蚌埠學院微生物菌種保藏室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖20，乙酸鈉5，檸檬酸二銨2，KH2PO42，吐溫-80 1，MnSO40.25，MgSO40.58，pH 6.5。MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂。MRS增殖培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中，添加體積分數(shù)為5%的番茄汁，質(zhì)量濃度為30 g/L的葡萄糖和25 g/L的胰蛋白胨。

1.2試劑與設備

1.2.1試劑

海藻糖(上海凱爾生物科技有限公司)、谷氨酸鈉(國藥集團化學儀器試劑公司)、麥芽糊精(上海強順化學試劑有限公司)等均為生化試劑級；甘油(天津市永大生化試劑有限公司)、VC(國藥集團化學儀器試劑公司)，均為分析純。

1.2.2設備

BHC-1300ⅡA/B2生物潔凈安全柜,蘇州凈化設備有限公司；DW-HL328超低溫冷凍儲藏箱,中科美菱低溫科技有限公司；BSD-YX2200立式智能精密搖床,上海恒訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JW-3021高速離心機,安徽嘉文儀器裝備有限公司；YM50壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠；ALPHA1-2LD冷凍干燥機,德國CHRIST公司。

1.3實驗方法

1.3.1實驗流程

菌種活化→菌種增殖培養(yǎng)→離心→加保護劑→預冷凍→真空冷凍干燥→凍干菌粉復水→活菌計數(shù)。

1.3.2菌種活化

將植物乳桿菌B002按照體積分數(shù)3%的接種量，接入到100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.3.3菌體增殖培養(yǎng)及菌泥的收集

將活化好的菌懸液以體積分數(shù)5%的接種量接種到100 mL MRS增殖培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h。然后將菌懸液放置于離心管中，4 ℃，6 000 r/min離心15 min，用等量的生理鹽水洗滌沉淀2次，在同樣的條件下離心15 min，棄去上清液，收獲菌泥。

1.3.4菌泥和保護劑平衡時間的選擇

將菌泥懸浮于等體積的質(zhì)量濃度100 g/L脫脂乳保護劑中，混合后取0.1 mL稀釋涂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，計活菌數(shù)。余下的菌懸液在室溫下平衡10、20、30、40、50、60 min，放置于平皿中，凍干厚度5 mm，-45 ℃的冰箱中預冷凍2.5 h，并對凍干后的樣品進行活菌計數(shù)。

1.3.5預冷凍時間的選擇[8-9]

重復1.3.4的操作，菌泥和保護劑在室溫下平衡40 min，在-45 ℃的冰箱中預冷凍1、1.5、2、2.5、3 h，并對凍干后的樣品進行活菌計數(shù)。

1.3.6單一凍干保護劑的選擇[10]

取2 mL含有脫脂乳的菌懸液與2 mL添加不同濃度的凍干保護劑(脫脂乳、可溶性淀粉、甘油、谷氨酸鈉、蔗糖、海藻糖、VC和麥芽糊精)混合均勻，根據(jù)上述試驗結果，選擇最優(yōu)的菌泥和保護劑平衡時間和預冷凍時間，-65 ℃真空冷凍干燥24 h，凍干后加入與凍干前等體積的無菌生理鹽水復水，稀釋涂平板，活菌計數(shù)。

1.3.7復合保護劑的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果進行凍干保護劑的篩選，選擇對植物乳桿菌B002凍干存活率影響較大的4個因素即A脫脂乳、B麥芽糊精、C谷氨酸鈉和D海藻糖進行4因素3水平的正交試驗。正交試驗因素水平表如表1。

表1　正交因素水平表

1.3.8凍干存活率的計算

(1)

2　實驗結果與分析

2.1菌泥和保護劑的平衡時間對凍干存活率的影響

菌泥和保護劑的平衡時間長短會影響保護劑進入菌泥的程度，進而影響凍干存活率。平衡時間對凍干存活率的影響結果如圖1所示。隨著平衡時間的延長，凍干存活率逐漸增加，在室溫下平衡40 min后，植物乳桿菌B002的凍干存活率最大。隨著時間的進一步延長，凍干存活率有所下降，可能是對植物乳桿菌B002的保護性降低，也可能出現(xiàn)負效應[11]。

圖1　菌泥和保護劑平衡時間對凍干存活率的影響Fig.1　Effect of bacteria and protective agent balance time for freeze-dried survival rate

2.2預冷凍時間對凍干存活率的影響

菌體懸浮于保護劑中后，要先進行預冷凍使其完全凍結再進行真空冷凍干燥。這是由于細胞在冷凍過程中細胞膜通透性發(fā)生改變，部分細胞會因此而受損或死亡。預冷凍是將細胞中的游離水固化，使產(chǎn)品凍干前后形態(tài)保持一致，減少因溫度降低而引起的物質(zhì)可溶性降低和生命特征的變化[11-12]。冷凍速度較慢，細胞外部形成冰晶，胞內(nèi)水分會外滲到胞外，溶質(zhì)會受損；冷凍速度較快，胞內(nèi)水分還來不及外滲就被凍成冰晶因而會損傷細胞[8]，因此應選擇最佳的冷凍速率來保護細胞。凍干時間過長會造成能源浪費。由圖2可知，植物乳桿菌B002的凍干存活率隨著預凍時間的延長會產(chǎn)生變化，預冷凍可以促進菌體的低溫應激反應，提高菌體存活率，同時預冷凍時加入保護劑也在一定程度上保護了菌體的活性。-45 ℃預冷凍2 h凍干存活率相對較高，再延長預冷凍時間，凍干存活率變化趨勢并不很明顯，所以本實驗選擇-45 ℃預冷凍2 h。

圖2　預冷凍時間對凍干存活率的影響Fig.2　Effect of pre-freezing time of freeze-dried survival rate

2.3凍干保護劑的選擇

2.3.1單一保護劑的選擇

對每種單一保護劑設計不同的濃度，測其對菌體凍干存活率的影響，其中每種保護劑的最佳保護濃度和對菌體凍干存活率的影響結果如表2所示。相比較，脫脂乳、麥芽糊精和海藻糖的凍干效果較好。

表2　單一保護劑對菌體凍干存活率的影響

凍干保護劑可以改變生物制品在凍干過程中的理化環(huán)境，減少凍干及復水時對細胞的損傷，盡可能保持其原有的生理活性和生物學性質(zhì)[13-14]。凍干保護劑可以分為大分子凍干保護劑，如可溶性淀粉、糊精、脫脂乳；小分子保護劑如糖醇類、氨基酸類。不同的保護劑有不同的特點。從表2可以看出，大分子保護劑效果相對較好，尤其是脫脂乳，可能是脫脂乳含有乳清蛋白，能在細胞表面形成膜對細胞進行保護，并能固定酶類，防止細胞壁由于蛋白質(zhì)破壞而造成的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；同時脫脂乳中還含有乳糖，也可以對細胞進行保護[15]。麥芽糊精以“包裹”的方式保護菌體[8]。海藻糖的保護效果優(yōu)于蔗糖，可能是海藻糖是一種天然的非還原性雙糖，高粘度、低流動性，并且具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度，在凍干過程中，能有效的阻止冰晶的形成，穩(wěn)定細胞膜和蛋白質(zhì)的結構，其作為保護劑效果非常顯著[16]。谷氨酸鈉和甘油也有一定的保護作用[17]，可能是谷氨酸鈉能進入細胞，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)部理化平衡，同時還能聯(lián)合保護劑中的其他成分，對菌體進行保護；甘油能滲透到細胞內(nèi)，將細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度提高，使得細胞外的滲透壓減小，大大減少細胞的水分流失；在細胞外，甘油也可以與水分子結合，從而發(fā)生水合作用，進而達到弱化水的結晶過程的目的，減輕細胞外溶質(zhì)濃度升高對細胞的損傷。

2.3.2復合保護劑的優(yōu)化

不同的保護劑有不同的保護原理和特點，單一保護劑效果相對低于復合保護劑，所以為了尋找適合植物乳桿菌B002的復合保護劑，本研究根據(jù)單因素試驗選擇不同類型、保護效果相對較好的脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精和谷氨酸鈉進行4因素3水平的正交優(yōu)化實驗。正交試驗結果如表3。

表3　正交試驗結果

由表3可以看出，復合保護劑較單一保護劑效果要好，可能是復合保護劑中不同種類的物質(zhì)通過不同的方式對菌體進行保護。同時，這些保護劑間又具有協(xié)同作用。如果復合保護劑中的各種保護劑比例和質(zhì)量濃度達到協(xié)調(diào)，將會加速干燥，且能在保存期間維持較高的細胞存活率，達到最佳的保護效果。

根據(jù)凍干保護劑正交試驗結果可知，優(yōu)化后的最佳保護劑組合是A2B2C3D2，即質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳、80 g/L的麥芽糊精、30 g/L的谷氨酸鈉和100 g/L的海藻糖。

2.3.3驗證試驗

優(yōu)化后的最佳保護劑組合是A2B2C3D2沒有出現(xiàn)在正交試驗表中，為了驗證該組合是否是最優(yōu)的凍干保護劑組合，將組合A2B2C3D2和正交試驗表中存活率最高的組合A2B3C1D2在相同條件下再次同時進行冷凍干燥試驗，結果為優(yōu)化組合A2B2C3D2所測得的凍干存活率為75.9%，高于A2B3C1D2的凍干存活率73.1%，因此，最佳復合保護劑是A2B2C3D2組合，即質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳、80 g/L的麥芽糊精、30 g/L的谷氨酸鈉和100 g/L的海藻糖。

3　結論

本實驗以植物乳桿菌B002為出發(fā)菌株，研究了該菌株在凍干過程中菌泥和保護劑平衡時間、預冷凍時間和凍干保護劑對菌粉存活率的影響，結果表明，在以10%脫脂乳為基礎保護劑的條件下，4 ℃，6 000 r/min離心15 min，菌泥和保護劑在室溫下平衡40 min，厚度5 mm，-45 ℃預冷凍2 h后，-65 ℃真空冷凍干燥24 h，菌粉存活率相對較高。本實驗通過單因素和正交試驗優(yōu)化了保護劑配方，即質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳、80 g/L的麥芽糊精、30 g/L的谷氨酸鈉和100 g/L的海藻糖，在上述條件下真空冷凍干燥，菌粉存活率達到75.9%。

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Optimization for freeze-drying technology ofLactobacillusplantarumB002

CAO Ke-ke, ZHANG Li-feng,LI Yan

(Department of Biology and Food Engineering,Bengbu University, Bengbu 233030,China)

UsingLactobacillusplantarumB002 as a target strain, the influences of protective agent balance time, pre-freezing time and preservative formula on the survival rate during process of freeze-drying bacteria were studied. The results showed that the survival rate ofL.plantarumB002 reached 75.9% after treatments as follows: it was centrifuged with 6 000 r/min at 4 ℃ for 15 min using 100 g/L skim milk as basic protectant, , then the centrifugal mud and protective agent were balanced at room temperature for 40 min to reach material thickness of 5 mm, then it was pre-freezed at -45 ℃ for 2 h using the optimal preservative containing skim milk powder 100 g/L, maltodextrin 80 g/L, monosodium glutamate 30 g/L and trehalose 100 g/L, finally it was vacuum freeze-dried for 24 h.

Lactobacillusplantarum;vacuum freeze-drying;protective agent

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609020

碩士，講師。

安徽省高校自然科學研究一般項目(KJ2013Z194)；蚌埠學院“優(yōu)秀中青年骨干教師”支持計劃

2016-01-13，改回日期：2016-05-09