羊乳表皮生長因子(EGF)在人工模擬胃腸液中的穩(wěn)定性

云丹，張富新，侯院林，于玲玲，雷飛艷，高佳媛，王銀，徐連應(yīng)

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

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羊乳表皮生長因子(EGF)在人工模擬胃腸液中的穩(wěn)定性

云丹，張富新*，侯院林，于玲玲，雷飛艷，高佳媛，王銀，徐連應(yīng)

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

文中在研究羊乳EGF和EGF標(biāo)品在人工胃液、人工腸液和人工胃腸液中消化穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，研究添加乳成分和食源性蛋白酶抑制劑的EGF標(biāo)品在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：羊乳中EGF濃度在人工胃液、人工腸液或人工胃腸液中消化1 h內(nèi)迅速下降，消化1 h后基本穩(wěn)定，但與純EGF消化程度相比，羊乳中EGF消化速度明顯降低；通過研究添加乳成分的EGF樣品在人工胃腸液中的消化穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在人工胃液中，乳清和乳清液對EGF的消化有保護(hù)作用，而酪蛋白和乳清蛋白對EGF的消化無保護(hù)作用，在人工腸液中，乳清、乳清液、酪蛋白和乳清蛋白均能對EGF的消化產(chǎn)生保護(hù)作用；通過研究添加食源性蛋白酶抑制劑和乳清液的EGF樣品在人工胃腸液中的消化穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在人工胃液中，乳清液(GMSF)對EGF的消化有保護(hù)作用，而大豆蛋白酶抑制劑(SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(EWPI)對EGF的消化無保護(hù)作用；在人工腸液中，大豆蛋白酶抑制劑(SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(EWPI)和乳清液(GMSF)對EGF的消化均產(chǎn)生保護(hù)作用。

羊乳；表皮生長因子；人工胃腸液；穩(wěn)定性

羊乳營養(yǎng)價(jià)值豐富，組分與人奶接近，易于被人體消化吸收、不含過敏原。羊乳可增強(qiáng)人體免疫力、促進(jìn)嬰幼兒生長發(fā)育，對胃腸炎、肺病、腎病、肝病等有治療和促進(jìn)康復(fù)作用等醫(yī)療保健功能，因而成為母乳的最佳替代品[1-2]。羊乳中含有與母乳相同的活性因子——表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，EGF通過與EGF受體結(jié)合，相鄰受體相互靠近形成二聚體，啟動一系列的級聯(lián)反應(yīng)催化、維持與細(xì)胞增長、增殖有關(guān)的一系列生化過程[3-4]?！俺ｏ嬔蛉椋缣幾印?，原因就是羊乳中具有抗氧化和美容養(yǎng)顏功效的EGF。此外，EGF可以幫助呼吸道和消化道的上皮黏膜細(xì)胞修復(fù)，提高人體對感染性疾病的抵抗力[5]。大量研究表明，作為羊乳中主要的活性因子之一，EGF在胃腸道疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要的作用[6]，然而EGF在人體內(nèi)生理功能的表達(dá)與其在胃腸液中的穩(wěn)定性密切相關(guān)，雖然國內(nèi)外對EGF在人工胃腸液中的穩(wěn)定性研究較多，但對羊乳中的EGF在人工胃液和腸液中的穩(wěn)定性卻未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過模擬人工胃液和腸液，研究其對羊乳EGF濃度的影響，以探明羊乳EGF在不同消化條件下的穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1羊乳

選擇西北農(nóng)林科技大學(xué)羊場健康奶山羊的乳樣。采取人工擠奶方式取樣，采樣時(shí)棄去前3把奶，取擠奶中段的乳樣。采樣后立即將乳樣在-40 ℃下冷凍儲存。

1.1.2試劑盒

山羊表皮生長因子酶聯(lián)免疫試劑盒，購于美國R&D公司，最低檢測濃度為1.0 pg/mL。EGF標(biāo)準(zhǔn)品由美國R&D公司提供。

1.1.3人工胃液的制備[7-8]

人工胃液：NaCl 2 g/L、胃蛋白酶(pepsin)3.5 g/L，用濃度為1 mol/L的HCl調(diào)整pH值為2.0、3.0、4.0、5.0后備用。

1.1.4人工腸液的制備[9-10]

人工腸液：將下述a液和b液以體積比2∶1混合即為人工腸液。

a.胰腺液：重碳酸鈉NaH(O3)質(zhì)量濃度為11 g/L，NaCl為2 g/mL，胰蛋白酶為1 g/L，用濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0。

b.膽汁液：Bile Salts(Difco)1.8 g/L，用濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0。

1.1.5EGF標(biāo)品的制備

將1 mg/mL的EGF標(biāo)準(zhǔn)品用無菌的18 mΩ-cm水稀釋至32 ng/mL,使得其濃度與羊乳中EGF濃度相近，在4 ℃冷藏備用。

1.2儀器與設(shè)備

MDF-U5411型低溫冰箱，日本三洋電機(jī)有限公司；JND-50型培養(yǎng)箱，寧波江南儀器有限公司；TGL-16gR型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Multiskan Go型全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司；KQ3200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；移液槍(100～1 000 μL，10～100 μL，0.5～10 μL)，德國eppendorf 公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ML104型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GZX-9146 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LS-B型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；pHS-3C型雷磁精密pH酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；XMTD型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3EGF的人工胃液穩(wěn)定性

分別取1 mL乳樣和稀釋至相同濃度的EGF標(biāo)品，于37℃水浴中預(yù)熱10 min，添加9 mL模擬的人工胃液，分別在恒溫?fù)u床上消化水解0.5、1、2、3、4 h后取樣，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3調(diào)節(jié)乳液pH值至7滅酶，測定EGF的濃度。計(jì)算EGF標(biāo)品和羊乳中EGF在人工胃液中消化后的濃度及活性保留率。

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1.4EGF的人工腸液穩(wěn)定性

分別取1 mL乳樣和稀釋至相同濃度的EGF標(biāo)品，于37℃水浴中預(yù)熱10 min，添加9 mL模擬的人工腸液，分別在恒溫?fù)u床上消化水解0.5、1、2、3、4 h后取樣，取樣后立即加入1滴胰蛋白酶抑制劑(PMSF，1 g/L，無水乙醇溶解)抑制胰蛋白酶活性，測定EGF的濃度。計(jì)算EGF的保留率。

1.5EGF體外模擬胃腸道消化

取1 mL乳樣和稀釋至相同濃度的EGF標(biāo)品，于37℃水浴中預(yù)熱10 min，添加9 mL模擬的人工胃液，在37 ℃恒溫?fù)u床上消化水解1.5 h，然后用l mol/L的NaOH調(diào)節(jié)乳液pH值至7滅酶。取1mL經(jīng)胃液消化后的樣品，添加9 mL模擬的人工腸液，在37 ℃恒溫?fù)u床上消化水解2 h取樣，立即加入1滴胰蛋白酶抑制劑(PMSF，1 g/L，無水乙醇溶解)抑制胰蛋白酶活性，測定EGF濃度。計(jì)算EGF在胃腸道中的保留率。

1.6乳成分對EGF在人工胃腸液中消化穩(wěn)定性的影響

取1 mL乳樣在5 000 g下低溫(4 ℃)離心10 min，去除上層脂肪，得乳清和酪蛋白。再將1 mL乳樣分離得到的乳清在80 ℃下加熱1 h，離心后得到乳清蛋白和去除乳清蛋白的乳清液。然后分別將1 mL乳樣獲得的乳清、酪蛋白、乳清液、乳清蛋白加入到濃度為32 ng/mL的EGF標(biāo)品中，制成EGF樣品液(EGF濃度與羊乳樣品相同)。取1 mL樣品液加入到9 mL人工胃液或人工腸液中，于37 ℃下消化1 h，測定EGF濃度。研究乳成分對EGF在人工胃腸液中消化穩(wěn)定性的影響。

1.7食源性蛋白酶抑制劑對EGF在人工胃腸液中消化穩(wěn)定性的影響

在1 mL濃度為32 ng/mL 的EGF標(biāo)品中添加1.8 mg大豆蛋白酶抑制劑(soya bean trypsin inhibitor，SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(lima bean trypsin inhibitor，LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(egg white trypsin inhibitor，EWPI)后，分別在9 mL人工胃液或9 mL人工腸液中消化1 h，測定EGF濃度，計(jì)算保留率，并與未添加抑制劑、添加乳清液(goat milk-soluble fraction，GMSF)的EGF標(biāo)品進(jìn)行對比。

1.8EGF濃度測定

1.8.1樣品處理

按照OSLISLO[11]的方法并加以改進(jìn)。將冷凍的乳樣在4 ℃解凍后，用移液槍吸取一定量的乳樣加入配制的人工胃液和腸液中消化一定的時(shí)間后，吸取1 mL在5 000 g下低溫(4 ℃)離心10 min，去除上層乳脂，取上清液，用ELISA試劑盒測定EGF濃度。

1.8.2EGF濃度的檢測

將EGF試劑盒從4 ℃的冰箱取出后室溫(20 ℃)平衡20 min，取出試劑盒中的板條。用移液槍取10 μL處理后的乳樣加入板條反應(yīng)孔中，再加樣本稀釋液40 μL，隨后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，在37 ℃保溫60 min。然后棄去反應(yīng)孔中液體，并在吸水紙上拍干，加入預(yù)先稀釋好的洗滌液(用蒸餾水按體積比=1∶20稀釋)350 mL，靜置1 min，棄去洗滌液，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。在洗滌后的反應(yīng)孔中加入底物A、B各50 μL，37℃保溫15 min后加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將山羊表皮生長因子(EGF)酶聯(lián)免疫試劑盒中濃度為1 000 pg/mL的EGF標(biāo)準(zhǔn)品用試劑盒中的標(biāo)品稀釋液依次稀釋成濃度為1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL的溶液。各取50 μL加入標(biāo)準(zhǔn)孔，按照1.8.2的方法檢測標(biāo)品在450 nm處的吸光度值，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)(x)，對應(yīng)吸光度值作為縱坐標(biāo)(y)，繪制EGF標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，按照線性回歸方程計(jì)算不同樣品中的EGF濃度。

1.9數(shù)據(jù)的處理

所有數(shù)據(jù)均采用DPS軟件進(jìn)行處理，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1EGF的人工胃液穩(wěn)定性

將EGF標(biāo)品和羊乳在人工胃液中分別消化0.5、1、2、3、4 h后，測定EGF濃度及保留率，結(jié)果見表1。

圖1　人工胃液(不同pH值)消化后EGF濃度的變化Fig.1　Changes of EGF concentration after digestion with artificial gastric juice

樣品消化時(shí)間/hpH值2345保留率/%0.564.8770.1380.2786.41146.0256.6064.4673.66EGF標(biāo)品233.2944.8954.7564.45320.7334.0145.2354.22421.2427.9639.7846.490.586.1482.9893.8198.67165.7875.2282.6184.07羊乳262.1574.9876.7373.65366.9670.1578.8574.79465.0371.5176.5177.88

由圖1可知，在人工胃液中，隨著消化時(shí)間的延長，EGF標(biāo)品的濃度一直降低(P<0.05)，而在羊乳中先降低后基本保持不變，當(dāng)消化液pH為2～4時(shí)，消化前1 h內(nèi)，羊乳中EGF濃度下降顯著(P<0.05)，消化時(shí)間超過1 h后，羊乳中EGF趨于穩(wěn)定(P>0.05)，同時(shí)當(dāng)消化液pH為5時(shí)，羊乳中EGF濃度在消化0.5 h內(nèi)無顯著性變化(P>0.05)，消化0.5～2 h時(shí)，羊乳中EGF濃度有所降低(P<0.05)，但當(dāng)消化2 h后，羊乳中EGF濃度趨于穩(wěn)定(P>0.05)。在整個(gè)消化期間，羊乳中的EGF濃度始終高于EGF樣品中的濃度，表明羊乳中的EGF比EGF標(biāo)品在胃液中更穩(wěn)定。

由表1可以看出，在pH值為2的人工胃液中，1 h后EGF標(biāo)品和羊乳中的EGF活性保留率分別為46.02%、65.78%，到4 h時(shí)EGF標(biāo)品保留率為21.24%，但羊乳中依然有高達(dá)65.03%的活性。在pH值為3的人工胃液中，1 h后EGF標(biāo)品和羊乳中的EGF活性保留率分別為56.60%、75.22%，到4 h時(shí)羊乳中的EGF活性顯著高于EGF溶液(P<0.01)。但是當(dāng)pH值達(dá)到4和5時(shí)，在EGF標(biāo)品和羊乳中，在人工胃液中消化4 h后，EGF的保留率分別為39.78%、76.51%和46.49%、77.88%，這種現(xiàn)象表明人工胃液的酸度越高，則EGF越容易被降解，穩(wěn)定性越差，同時(shí)可以看出，EGF標(biāo)品比羊乳中的EGF更易被胃液消化，由此可以推測，羊乳中的某些成分可能會增強(qiáng)EGF對胃液消化的耐受性。

生理pH條件下EGF在胃液中可被酸和胃蛋白酶作用降解。PLAYFORD[12]在研究胃液對EGF降解時(shí)發(fā)現(xiàn)完整的EGF1-53在胃液中可被降解為EGF1-49和EGF1-46片段，胃蛋白酶有特定的斷裂位點(diǎn)，可作用于那些含有芳香族氨基酸的多肽，使得EGF結(jié)構(gòu)上的Tryp49-Tryp50鍵快速斷裂，使完整的EGF1-53分子生物活性減少。成年人在未進(jìn)食時(shí)胃液pH值為2.0左右，但在進(jìn)食后pH值可升至4.5～5.0[13]，然而人胃液中胃蛋白酶活性在pH為2.5～3時(shí)最大，pH>4時(shí)快速下降，說明胃液的pH值對EGF的降解也有一定的影響，在進(jìn)食后EGF對胃液消化的耐受性更好，這也可以用來解釋EGF為何在胃液pH值為2時(shí)消化率達(dá)到最高。

2.2EGF的人工腸液穩(wěn)定性

將EGF標(biāo)品和羊乳分別在人工腸液中消化0.5、1、2、3、4 h后，測定EGF的濃度及活性保留率，結(jié)果見圖2及表2。

圖2　人工腸液中EGF濃度的變化Fig.2　Changes of EGF concentration after digestion with artificial intestinal juice

表2　EGF標(biāo)品和羊乳EGF在人工腸液中的保留率　單位：%

隨著消化時(shí)間的延長，EGF標(biāo)品的濃度一直降低(P<0.05)，而在羊乳中下降幅度較小，羊乳在腸液中消化1 h時(shí)EGF濃度迅速下降(P<0.05)，而在消化1 h后羊乳中的EGF濃度變化不大(P>0.05)，當(dāng)消化4 h時(shí)，EGF標(biāo)品中EGF活性僅剩初始濃度的29.67%，而羊乳中EGF的活性保留率高達(dá)73.69%，說明羊乳中可能含有某些物質(zhì)能增強(qiáng)EGF的腸液耐受性。SHEN等[14]研究了EGF在斷乳豬和吮乳豬胃腸道的穩(wěn)定性，表明EGF在吮乳豬的腸液中的降解率顯著減少，說明乳成分能夠減少EGF的降解。

2.3EGF體外模擬胃腸道消化

將EGF標(biāo)品和羊乳分別在人工胃液中消化1.5 h后，再在人工腸液中消化2 h，測定EGF在人工胃腸液中的濃度變化及活性保留率，結(jié)果見表3。

表3　EGF在人工胃腸液中的濃度變化

由表3可以看出，EGF標(biāo)品和羊乳中的EGF對人工胃腸液的耐受性有所不同。經(jīng)胃腸液消化后羊乳中的EGF濃度顯著高于EGF標(biāo)品(P<0.01)，從保留率來看，經(jīng)胃腸液消化后，羊乳中EGF保留率為58.82%，而EGF標(biāo)品保留率僅為26.17%。由此可見，羊乳中可能含有某些成分可以增強(qiáng)EGF對胃腸液的耐受性。EGF在胃腸液中的穩(wěn)定性與蛋白水解作用有關(guān)。胃蛋白酶參與胃液中EGF的降解，胰蛋白酶和糜蛋白酶參與腸液中EGF的降解，胃腸液中的多肽酶和蛋白酶可將EGF降解成為氨基酸和小分子肽，失去它本身的活性[15]。

2.4乳成分對EGF在人工胃腸液中消化穩(wěn)定性的影響

將從1 mL乳樣中分離得到的乳清、酪蛋白、乳清液、乳清蛋白分別加入到濃度為32 ng/mL的EGF標(biāo)品液中(與羊乳中濃度一致)。取1 mL加入乳成分的EGF標(biāo)品液，加入到9 mL人工胃液或9 mL人工腸液，在37℃下消化1 h，分別測定其在人工胃液和人工腸液中的EGF濃度，結(jié)果見圖3和圖4。

由圖3可知，在人工胃液中，EGF標(biāo)品經(jīng)1 h消化后濃度從起初的32 ng/mL降低至(14.73±0.78) ng/mL，活性保留率僅為46.02%。而添加酪蛋白、乳清蛋白、乳清、乳清液的EGF標(biāo)品經(jīng)人工胃液消化1 h后濃度分別為(14.69±0.81)、(14.51±0.83)、(18.89±0.49)、(18.32±1.28) ng/mL，活性保留率分別達(dá)到45.90%、45.34%、59.04%、57.25%。雖然添加乳成分的EGF樣品在人工胃液中均可明顯消化，但與未添加乳成分的EGF標(biāo)品相比，添加酪蛋白和乳清蛋白的樣品在人工胃液中消化1 h后，其濃度無明顯差別(P>0.05)，而添加乳清和乳清液的樣品經(jīng)胃液消化1 h后，其EGF濃度顯著高于未加入乳成分的EGF標(biāo)品(P<0.05)。說明乳清、乳清液可對EGF在胃液中的消化起保護(hù)作用，酪蛋白和乳清蛋白均無保護(hù)作用，由此推測乳清或乳清液中可能含有抑制EGF降解的成分[14]。

圖3　乳成分對EGF在人工胃液中消化(0 h)穩(wěn)定性的影響Fig.3　Effects of milk composition on the stability of EGF in artificial gastric juice

由圖4可知，在人工腸液中，EGF標(biāo)品經(jīng)1 h消化后濃度從起初的32 ng/mL降低至(21.81±1.63) ng/mL，活性保留率僅為68.15%，而添加酪蛋白、乳清蛋白、乳清和乳清液的EGF標(biāo)品經(jīng)人工腸液消化1 h后濃度分別為(24.92±0.30)、(24.71±0.67)、(27.35±1.06)、(26.28±0.91) ng/mL，活性保留率分別為77.86%、77.21%、85.47%、82.12%。雖然添加乳成分的EGF樣品在人工腸液中均可明顯消化，但與未添加乳成分的EGF標(biāo)品相比，在人工腸液中消化1 h后EGF濃度明顯較高，說明乳成分可對EGF在腸液中起保護(hù)作用。SHEN[14]等研究表明，乳的酸溶性部分和酪蛋白可顯著減少EGF的降解，攝入其他食源性蛋白質(zhì)，也可能會因?yàn)楦偁幮砸种葡富钚?，減少EGF的分解。

圖4　乳成分對EGF在人工腸液中消化(1 h)穩(wěn)定性的影響Fig.4　Effects of milk composition on the stability of EGF in artificial intestinal juice

2.5食源性蛋白酶抑制劑對EGF在人工胃腸液中消化穩(wěn)定性的影響

分別在1 mL EGF標(biāo)品(32ng/mL)中添加1.8 mg大豆蛋白酶抑制劑(soya bean trypsin inhibitor，SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(lima bean trypsin inhibitor，LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(egg white trypsin inhibitor，EWPI)后，分別在9 mL人工胃液或9 mL人工腸液中消化1 h，測定EGF的濃度，并與未添加抑制劑的EGF標(biāo)品、添加乳清液(goat milk-soluble fraction，GMSF)的EGF標(biāo)品進(jìn)行對比。結(jié)果見圖5和圖6。

圖5　食源性蛋白酶抑制劑對EGF在人工胃液中消化(0 h)穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effects of food-borne protease inhibitors on the stability of EGF in artificial gastric juice

圖6　食源性蛋白酶抑制劑對EGF在人工腸液中消化(1 h)穩(wěn)定性的影響Fig.6　Effects of food-borne protease inhibitors on the stability of EGF in artificial intestinal juice

由圖5可知，在人工胃液中，EGF標(biāo)品濃度由消化前的32 ng/mL降低至(15.95±1.08) ng/mL，添加大豆蛋白酶抑制劑(soya bean trypsin inhibitor，SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(lima bean trypsin inhibitor，LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(egg white trypsin inhibitor，EWPI)、乳清液(goat milk-soluble fraction，GMSF)的EGF標(biāo)品經(jīng)人工胃液消化1 h后，濃度分別為(15.34±0.73)、(15.75±1.02)、(16.06±1.13)、(20.58±0.18) ng/mL。添加GMSF的EGF樣品在胃液中消化后，其EGF濃度明顯高于未添加抑制劑的EGF標(biāo)品(P<0.05)，而添加SBTI、LBTI、EWPI的EGF樣品與未添加抑制劑的EGF樣品在人工胃液中消化1 h后，其EGF濃度無顯著性差異(P>0.05)，表明乳清液可減少EGF在胃液中的消化，食源性抑制劑對EGF在胃液中的消化無明顯保護(hù)作用，猜測乳清液中可能含有其他成分可以抑制EGF在胃液中的降解。

由圖6可知，在人工腸液中，EGF標(biāo)品濃度由消化前的32 ng/mL降低至(21.94±1.60) ng/mL，活性保留率達(dá)到68.55%，而在添加大豆蛋白酶抑制劑(soya bean trypsin inhibitor，SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(lima bean trypsin inhibitor，LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(egg white trypsin inhibitor，EWPI)、乳清液(goat milk-soluble fraction，GMSF)的EGF樣品中，經(jīng)人工腸液消化1 h后濃度分別為(29.07±0.35)、(26.19±1.74)、(24.82±1.82)、(27.96±1.12) ng/mL，活性保留率分別達(dá)到90.83%、81.83%、77.57%、87.39%。添加SBTI、LBTI、EWPI和乳清液的EGF樣品經(jīng)腸液消化1 h后其EGF濃度顯著高于未添加任何成分的EGF標(biāo)品中的濃度(P>0.05)，說明食源性蛋白酶抑制劑和乳清液均能抑制EGF在腸液消化過程中的降解。

EGF在胃腸道中能夠被降解成小分子的肽段[12]。在胃液中，抑制劑對EGF的降解無保護(hù)作用，而在腸液中抑制劑對EGF有保護(hù)作用，其原因可能是抑制劑抑制了腸液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白消化酶的活性，從而降低了腸道中蛋白消化酶對EGF的降解。而乳清液中的活性成分不但對胃液中胃蛋白酶具有抑制作用，而且對腸液中的蛋白消化酶也具有抑制作用。

3　討論

EGF是生物體中一種重要的生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)胃腸道生長，改善胃酸分泌及腸道酶活性水平，催化腸上皮細(xì)胞對金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和糖代謝，保護(hù)胃腸道黏膜等作用，這些作用只有EGF進(jìn)入體內(nèi)才能發(fā)揮，因此，通過口服作用進(jìn)入人體在消化過程中保持生物活性是發(fā)揮EGF生理作用的關(guān)鍵。通常EGF在幼畜的胃腸道中經(jīng)過胞飲作用被完整吸收利用。對于成人來說，EGF要經(jīng)過胃腸液的消化作用而被吸收。目前有研究報(bào)道，乳源性EGF在酸和胃蛋白酶、腸道消化酶存在時(shí)可發(fā)生降解。KLAGSBRUN[16]指出，母乳在混合的胰蛋白酶和糜蛋白酶環(huán)境下培養(yǎng)的Balb/c3T3細(xì)胞中EGF刺激生長作用減少到15%以下。一些研究表明EGF在鼠和人的胃液中穩(wěn)定存在，在腸液中會降解至一個(gè)變量范圍[17]。另外，其他的研究表明EGF在胃液中可以降解，盡管將胃液調(diào)節(jié)至更高的pH保護(hù)作用也比較微弱[13]。還有一些研究表明這種肽可在胃腸道內(nèi)穩(wěn)定存在，初生動物能完整吸收。EGF主要是在腸關(guān)閉后通過結(jié)合胃腸道細(xì)胞表面的受體被吸收，當(dāng)?shù)竭_(dá)其他組織時(shí)這種結(jié)合能力便會消失。服用125I-EGF后在腦、胃腸壁、皮膚等多個(gè)組織中均能檢測出放射性EGF，說明口服EGF可通過血液循環(huán)作用于胃腸外的組織。此外，若攝入膳食蛋白可減少EGF的分解，因?yàn)樗鼈兛赡軐ο傅姆纸庥懈偁幮砸种谱饔谩?/p>

4　結(jié)論

在人工胃液、人工腸液或人工胃腸液中，羊乳中EGF濃度在消化1 h內(nèi)迅速下降，消化1 h后基本穩(wěn)定，但與純EGF消化程度相比，羊乳中EGF消化速度明顯緩慢，表明羊乳中有保護(hù)EGF降解的物質(zhì)存在。通過研究添加乳成分的EGF樣品在人工胃腸液中的消化穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在人工胃液中，乳清和乳清液對EGF的消化有保護(hù)作用，而酪蛋白和乳清蛋白對EGF的消化無保護(hù)作用；在人工腸液中，乳清、乳清液、酪蛋白和乳清蛋白均能對EGF的消化產(chǎn)生保護(hù)作用。通過研究添加食源性蛋白酶抑制劑和乳清液的EGF樣品在人工胃腸液中的消化穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在人工胃液中，乳清液(GMSF)對EGF的消化有保護(hù)作用，而大豆蛋白酶抑制劑(SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(EWPI)對EGF的消化無保護(hù)作用；在人工腸液中，大豆蛋白酶抑制劑(SBTI)、青豆蛋白酶抑制劑(LBTI)、蛋清蛋白酶抑制劑(EWPI)和乳清液(GMSF)對EGF的消化均產(chǎn)生保護(hù)作用。

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Study on the stability of goat milk EGF in simulated gastrointestinal fluid

YUN Dan，ZHANG Fu-xin*，HOU Yuan-lin，YU Ling-ling，LEI Fei-yan，GAO Jia-yuan，WANG Yin，XU Lian-ying

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shanxi Normal University, Xi'an 710119，China)

The digestion stability of goat milk EGF and EGF standard in artificial gastric, intestinal juice and artificial gastrointestinal juice were studied and based on its result, the stability of EGF standard which has goat milk composition and food protease in artificial gastrointestinal fluid was investigated. The results showed that EGF concentration in goat milk digested rapidly in artificial gastric, intestinal juice and artificial gastrointestinal within 1 hour. It became stable after 1 h, but compared with the pure EGF, EGF digestion rate was significantly lower in goat milk. the digestive stability of EGF with milk composition in artificial gastrointestinal fluid showed that whey and whey liquid protected the digestion of EGF in the artificial gastric juice, while casein and whey protein did not have the protective effect. Whey, whey liquid, casein and whey protein all had protective effect on the digestion of EGF in artificial intestinal juice. The digestive stability of EGF with food protease inhibitor and goat milk-soluble fraction in artificial gastrointestinal fluid showed that goat milk-soluble fraction had protective effect on the digestion of EGF in artificial gastric juice while soya bean trypsin inhibitor, lima bean trypsin inhibitor and egg white trypsin inhibitor had no protective effect. Meanwhile, soya bean trypsin inhibitor, lima bean trypsin inhibitor, egg white trypsin inhibitor and goat milk-soluble fraction all had protective effect on EGF in artificial intestinal juice.

goat milk; epidermal growth factor; artificial gastrointestinal fluid; stability

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609012

碩士研究生(張富新教授為通訊作者，E-mail：fuxinzh@snnu.edu.cn)。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD18B04)；陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2014K01-17-05)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103038)；重大科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項(xiàng)(2016KTCG01-12)

2015-11-30，改回日期：2016-04-08