高山被孢霉中Δ6脫飽和酶關(guān)鍵位點(diǎn)及其對(duì)活性的影響

史海粟，陳海琴，顧震南，張灝，陳永泉，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

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高山被孢霉中Δ6脫飽和酶關(guān)鍵位點(diǎn)及其對(duì)活性的影響

史海粟，陳海琴*，顧震南，張灝，陳永泉，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

高山被孢霉中Δ6脫飽和酶(MaFADS6)是決定ω3/ω6多不飽和脂肪酸代謝流的關(guān)鍵酶。利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究MaFADS6-Ι一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為高山被孢霉多不飽和脂肪酸的合成提供了理論依據(jù)。利用非鏈取代式質(zhì)粒擴(kuò)增技術(shù)對(duì)已構(gòu)建質(zhì)粒pYES2/NT C-MaFADS6-Ι內(nèi)的表達(dá)單元(即MaFADS6-Ι)中細(xì)胞色素b5區(qū)(HPGG)下游的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將所有突變體分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)在培養(yǎng)基中添加Δ6脫飽和酶的底物來(lái)考察重組菌對(duì)各底物的催化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有突變體催化α-亞麻酸(ALA)的活性沒有改變；K61和D68兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)催化亞油酸(LA)起關(guān)鍵作用，其對(duì)應(yīng)的4個(gè)突變體對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率分別為(6.2±0.5)% (K61T)、(0.3±0.0)% (K61F)、(8.2±0.7)% (D68N)和(6.6±0.8)% (D68L)，相比原始轉(zhuǎn)化率各降低50%以上；G63和T69兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)LA的催化無(wú)直接影響，但G63T突變體由于突變位點(diǎn)極性改變，其對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率為(8.5±0.9)%，比原始轉(zhuǎn)化率降低了49.9%；而V66位點(diǎn)的突變體對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率分別為(22.3±2.6)% (V66T)和(20.7±2.5)% (V66A)，比原始轉(zhuǎn)化率分別降低了36.1%和37.8%。確定了MaFADS6-Ι氨基酸序列中K61和D68兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)經(jīng)突變后均會(huì)使其酶活明顯降低，這為研究MaFADS6-Ι一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了理論依據(jù)。

Δ6脫飽和酶；高山被孢霉；定點(diǎn)突變

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)對(duì)人體有重要的生理功能，對(duì)人類膳食和健康具有重要意義[1]。目前PUFAs的動(dòng)植物來(lái)源有限，而利用產(chǎn)脂微生物合成PUFAs成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。高山被孢霉(Mortierellaalpina)是目前工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸(arachidonic acid, 20:4Δ5,8,11,14, AA)的主要菌株，也是少量合成二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid, 20:5Δ5,8,11,14,17, EPA)的具有正式安全性評(píng)估的菌種，同時(shí)也是脂質(zhì)生物化學(xué)基礎(chǔ)研究的重要模式菌[2-7]。

在高山被孢霉合成PUFAs途徑中(圖1)，Δ6脫飽和酶是調(diào)控ω3/ω6脂肪酸代謝流的“分子開關(guān)”，它可以將α-亞麻酸(α-linolenic acid, 18:3Δ9,12,15, ALA)轉(zhuǎn)化為十八碳四烯酸(stearidonic acid, 18:4Δ6,9,12,15, SDA)或?qū)営退?linoleic acid, 18:2Δ9,12, LA)轉(zhuǎn)化為γ-亞麻酸(γ-linolenic acid, 18:3Δ6,9,12, GLA)[8-9]。高山被孢霉中Δ6脫飽和酶(MaFADS6)對(duì)這兩種底物的選擇性決定了ω3/ω6的比例，因此研究Δ6脫飽和酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要意義，但該酶是一個(gè)膜結(jié)合脫飽和酶，其分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究一直沒有取得重要進(jìn)展?，F(xiàn)階段主要利用蛋白質(zhì)功能區(qū)域交換或定點(diǎn)突變的技術(shù)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)高山被孢霉ATCC 32222的Δ6I-脫飽和酶進(jìn)行了催化特性的研究，確定了其底物偏好相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)[10]，但對(duì)其細(xì)胞色素b5區(qū)域和His I區(qū)之間的氨基酸片段還沒進(jìn)行詳細(xì)研究，本文將依托氨基酸多序列比對(duì)，對(duì)Δ6脫飽和酶的氨基酸序列進(jìn)行比較，確定了細(xì)胞色素b5的特征結(jié)合區(qū)域-HPGG(His-Pro-Gly-Gly)下游的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，旨在獲得影響高山被孢霉來(lái)源MaFADS6-Ι催化特性的關(guān)鍵位點(diǎn)，為研究產(chǎn)脂微生物M.alpina中ω3/ω6脂肪酸流向調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

圖1　高山被孢霉中多不飽和脂肪酸合成途徑PUFAs biosynthetic pathways of M.alpina

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒、培養(yǎng)基

大腸桿菌(Escherichiacoli) TOP 10為實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)提供；高山被孢霉ATCC 32222購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)保藏，并已對(duì)其完成基因組測(cè)序；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)營(yíng)養(yǎng)缺陷型INVSc1及表達(dá)載體質(zhì)粒pYES2/NT C購(gòu)自INVITROGEN公司，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。SC-U及誘導(dǎo)培養(yǎng)基見pYES2/NT C操作手冊(cè)。胰蛋白胨和酵母提取物均購(gòu)自O(shè)xoid公司。

1.2工具酶和試劑

游離脂肪酸LA和ALA及脂肪酸標(biāo)品購(gòu)于NU-CHEK，PREP公司。DNA marker DL10000購(gòu)自TAKARA公司； HYQspinTMPlasmid DNA Kit柱式法質(zhì)粒小提試劑盒(HG101-01)購(gòu)自HYQBio公司；DNA序列測(cè)試也由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)于TIANGEN公司；一抗(6×His標(biāo)簽鼠抗，Mouse THETM His Tag Antibody)和二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，HRP-conjugated Goat Anti Mouse IgG)購(gòu)于Genscript公司；引物由上海桑尼有限公司合成。其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1同源序列比對(duì)及拓?fù)淠Ｐ皖A(yù)測(cè)

將MaFADS6-Ι與其他10個(gè)物種的Δ6脫飽和酶的氨基酸序列在DNAMAN軟件中進(jìn)行比對(duì)，并在TMHMM上完成對(duì)MaFADS6-Ι拓?fù)淠Ｐ偷念A(yù)測(cè)。

1.3.2MaFADS6-Ι定點(diǎn)突變及測(cè)序鑒定

MaFADS6-Ι基因定點(diǎn)突變方法采用非鏈取代式質(zhì)粒擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)部分重疊的引物設(shè)計(jì)原則，利用primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)K61T、K61F、G63A、G63T、V66T、V66A、D68N、D68L、T69V、T69S十對(duì)含預(yù)定突變位點(diǎn)的互補(bǔ)的寡核苷酸引物，送上海桑尼有限公司合成，如表1所示。以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pYES2-MaFADS6-Ι質(zhì)粒為模板，按TIANGEN公司快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖械牟僮髡f(shuō)明進(jìn)行定點(diǎn)突變的載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)(圖2)。

表1　本文所用的引物

注：a下劃線代表突變的堿基位點(diǎn)。

圖2　表達(dá)載體pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的構(gòu)建圖示Fig.2　Schematic map of the recombinant plasmid pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)

對(duì)長(zhǎng)出的突變克隆子進(jìn)行PCR鑒定后,送交生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。得到的相應(yīng)序列與MaFADS6-Ι基因原始序列使用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行分析比較。將突變正確的轉(zhuǎn)化子于-80 ℃冰箱在甘油管里保存。

1.3.3重組質(zhì)粒pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的轉(zhuǎn)化

接種釀酒酵母菌株INVSc1的單菌落于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)，接種適量的過(guò)夜培養(yǎng)液至YPAD液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后離心收集菌體。細(xì)胞用無(wú)菌水和鋰鹽溶液[10×TE緩沖液∶10×LiAcV(貯液)∶V(無(wú)菌水)=1∶1∶8]各重懸1次，1 mL/份分裝，于-80 ℃保存。

取200 μg載體DNA(鮭魚精DNA)和≤5 μg重組表達(dá)載體一起加入2 mL EP管，混勻，加入鋰鹽溶液重懸，再加入1mL新鮮PEG溶液(50% PEG溶液∶10×TE緩沖液∶10×LiAc貯液=8∶1∶1)，30 ℃搖蕩溫育30 min后于42 ℃熱休克15 min，取200 μL 1×TE緩沖液重懸，最后取其中少量涂布于SC-U平板，28 ℃培養(yǎng)36～48 h。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后，于-80 ℃甘油管保存。具體方法詳見精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[11]。

1.3.4重組質(zhì)粒pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的表達(dá)及產(chǎn)物的Western blot分析

挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落至SC-U液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600值，取適量菌液接入含15 mL SC-U液體培養(yǎng)基的三角瓶，28 ℃搖床培養(yǎng)48 h，收集菌體，ddH2O重懸3次，SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸1次，離心去上清，加入15 mL SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28 ℃搖床誘導(dǎo)12 h后收菌。

取2 mL誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液，離心去上清，加入160 μL酵母破壁緩沖液和等體積的玻璃珠，使用FastPrep快速細(xì)胞破碎儀破壁后，加入40 μL 5×Loading Buffer，沸水浴5～10 min，取10 μL上樣。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST溶液漂洗3次，5 min/次，以含5%脫脂奶粉的TBST溶液于4 ℃緩慢振搖45 min，TBST溶液漂洗3次，5 min/次， 按1∶5 000加入6× His標(biāo)簽的鼠抗，孵育1 h，回收一抗，TBST溶液漂洗3次，5 min/次，按1∶2 000 加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，緩慢搖蕩45 min，TBST溶液漂洗3次，5 min/次。取等體積A、B液(A液：0.01 mol/L魯米諾溶液；B液：0.1 mol/L雙氧水溶液)混合，將PVDF膜反貼于A、B混合液于FluorChem FC3成像儀觀察。

1.3.5重組Δ6脫飽和酶的活性測(cè)定

在上述誘導(dǎo)后的培養(yǎng)基中加入0.25 mmol/L cis-LA和0.25 mmol/L cis-ALA，28 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收菌。菌體水洗3次，凍干。取100 mg凍干菌體，加2 mL 6mol/L的HCl，80 ℃水浴3 h，恢復(fù)至室溫，加1 mL甲醇，振蕩，加2 mL三氯甲烷，振蕩1 min，收集氯仿層，氮?dú)獯蹈?；加? mL 10%的鹽酸甲醇，60 ℃水浴3 h，加入1 mL飽和氯化鈉和2 mL正己烷混勻，取上層于GC瓶。通過(guò)氣相色譜儀對(duì)脂肪酸甲酯進(jìn)行定性及定量分析，具體方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.3.6三維結(jié)構(gòu)模擬

Δ6脫飽和酶各突變位點(diǎn)及突變體的三維結(jié)構(gòu)通過(guò)SWISS-MODEL軟件完成模擬，通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)搜索匹配的模板進(jìn)行比對(duì)，生成三維結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與討論

2.1同源序列比對(duì)及突變位點(diǎn)確定

利用DNAMAN軟件對(duì)不同來(lái)源的Δ6脫飽和酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)MaFADS6-Ι與其他Δ6脫飽和酶一樣，含有細(xì)胞色素b5區(qū)HPGG及3個(gè)組氨酸保守區(qū)即Ⅰ區(qū)HX3H、Ⅱ區(qū)HX2HH、Ⅲ區(qū)QX2HHLFP。細(xì)胞色素b5區(qū)域是作為Δ6脫飽和酶催化時(shí)的電子供體，該結(jié)構(gòu)域中的HPGG是一個(gè)非常保守的亞鐵血紅素結(jié)合基序，是前端脫飽和酶的顯著特征，對(duì)脂肪酸的脫飽和起著關(guān)鍵作用[13-14]。因此，我們從該區(qū)域?qū)ふ铱赡芘cΔ6脫飽和酶催化特性相關(guān)的位點(diǎn)，并在細(xì)胞色素b5區(qū)下游發(fā)現(xiàn)有一段比較保守的區(qū)域，其中有5個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異，這可能與不同來(lái)源的Δ6脫飽和酶的催化特性相關(guān)。

MaFADS6-Ι：高山被孢霉ATCC 32222；OmFADS6：大麻哈魚；CoFADS6：耳霉；TpFADS6：海鏈藻；GcFADS6：球狀金藻；PtFADS6：三角褐指藻；PiFADS6：缺刻緣綠藻；CpFADS6：角齒蘚；PyiFADS6：畸雌腐霉；MfFADS6：高山被孢霉1S-4；MWFADS6：高山被孢霉W15細(xì)胞色素b5(HPGG)區(qū)域用下劃線表示，星號(hào)表示相同的氨基酸殘基，箭頭指示的氨基酸殘基表示定點(diǎn)突變的位點(diǎn)。圖3　基于Clustal X軟件的FADS6序列比對(duì)Fig.3　Multiple Sequence alignment of FADS6 by Clustal X

通過(guò)脂肪酸脫飽和酶拓?fù)鋵W(xué)模型分析顯示，3個(gè)組氨酸保守區(qū)全部位于Δ6脫飽和酶的親水區(qū)域。用TMHMM軟件對(duì)Δ6 脫飽和酶的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行疏水性分析，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖4所示，該基因具有Δ6脫飽和酶基因的典型結(jié)構(gòu)特征，兩個(gè)長(zhǎng)的跨膜疏水區(qū)，3個(gè)組氨酸保守區(qū)全部位于親水區(qū)一側(cè)，2個(gè)疏水的跨膜區(qū)穿過(guò)膜4次，與3個(gè)組氨酸保守區(qū)組成Δ6脫飽和酶的催化中心，5個(gè)待突變的氨基酸位點(diǎn)位于胞漿內(nèi)。

圖4　Δ6脫飽和酶的拓?fù)淠Ｐ徒Y(jié)構(gòu)Fig.4　The predicted topology model of FADS6

2.2突變體構(gòu)建及其驗(yàn)證

以氨基酸的親水性和疏水性為原則，將5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基分別突變成親水性氨基酸和疏水性氨基酸。以提取的重組質(zhì)粒pYES2-MaFADS6為模板，由表1的突變引物進(jìn)行非鏈取代式質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，經(jīng)DpnI消化后轉(zhuǎn)化至FDM感受態(tài)細(xì)胞中(定點(diǎn)突變?cè)噭┖刑峁?，待長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，擴(kuò)增出的Δ6脫飽和酶突變基因大小在1 500 bp左右，與理論值大小一致。將鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，確證定點(diǎn)突變成功。

M-Marker; 1,2-pYES2-K61T; 3,4-pYES2-G63A; 5,6-pYES2-V66T; 7,8-pYES2-D68N; 9,10-pYES2-T69V; 11,12-pYES2-K61F; 13,14-pYES2-G63T; 15,16-pYES2-V66A; 17,18-pYES2-D68L; 19,20-pYES2-T69S; 21-pYES2-FADS6圖5　Δ6脫飽和酶突變基因重組載體pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的PCR驗(yàn)證Fig.5　Identification of recombinant vectors for mutant genes by PCR

2.3MaFADS6-Ι突變基因在釀酒酵母中的表達(dá)

重組載體pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutantsites)轉(zhuǎn)化釀酒酵母并誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析和Western blot分析顯示，重組MaFADS6-Ι在相對(duì)分子質(zhì)量約54 kDa處可見特異的蛋白條帶，與理論分子量一致，且各轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)量在同一水平(圖6)。

MW-Marker；1-pYES2/NT C；2-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61T；3-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61F；4-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63A；5-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63T；6-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66T；7-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66A；8-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68N；9-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68L；10-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69V；11-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69S；12-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι圖6　各突變基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western bolt分析Fig.6　Analysis of expressing products by SDS-PAGE and Western bolt

2.4重組MaFADS6-Ι的催化特性分析

為驗(yàn)證重組MaFADS6-Ι的催化特性，選取已誘導(dǎo)的酵母轉(zhuǎn)化子，以原始MaFADS6-Ι為對(duì)照，加入LA和ALA底物，28 ℃搖床培養(yǎng)12 h后通過(guò)氣相色譜確定樣品中LA、GLA、ALA和SDA的百分含量，以計(jì)算其對(duì)不同底物的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖7和圖8所示，原始MaFADS6-Ι對(duì)LA和ALA的活性分別為56.2%和2.9%，所有重組MaFADS6-Ι對(duì)ALA的催化活性無(wú)影響。在對(duì)LA催化活性的影響上，K61T和K61F突變體對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率相比比原始MaFADS6-Ι有明顯降低，分別降為6.2%和0.3%，這說(shuō)明K61位點(diǎn)在MaFADS6-Ι的結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，而將該點(diǎn)的Lys(K)突變成Phe(F)之后，幾乎檢測(cè)不到活性，推測(cè)原因可能是由于Phe的結(jié)構(gòu)中存在苯環(huán)，其空間位阻使底物L(fēng)A不能與酶契合；G63A、T69V和T69S對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率沒有顯著影響(分別為50.6%、51.8%和45.5%)，但將G63突變成Thr時(shí)，轉(zhuǎn)化率卻降低至8.5%，由于Ala是非極性R基氨基酸，而Thr是不帶電荷的極性R基氨基酸，這種替換改變了該位點(diǎn)的極性，從而破壞了MaFADS6-Ι活性中心的正常三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)致活性下降；V66T和V66A對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率分別為22.3%和20.7%，比原始MaFADS6-Ι的活性降低了50%以上， 推測(cè)該位點(diǎn)對(duì)酶活有影響，但不是影響酶活最關(guān)鍵的位點(diǎn)；D68N和D68L對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率分別為8.2%和6.6%，推斷D68位點(diǎn)對(duì)MaFADS6-Ι活性的影響比V66位點(diǎn)更重要。

圖7　同時(shí)添加底物L(fēng)A和ALA時(shí)各突變體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率Fig.7　Conversion rate of each mutant for each substrate其中LA轉(zhuǎn)化率(%)=100 ×反應(yīng)生成的GLA的量/(反應(yīng)生成的GLA的量+反應(yīng)剩余的LA的量)，ALA轉(zhuǎn)化率(%)=100 ×反應(yīng)生成的SDA的量/(反應(yīng)生成的SDA的量+反應(yīng)剩余的ALA的量)。

2.5三維結(jié)構(gòu)模擬分析

為了直觀地解釋各突變體的活性驗(yàn)證結(jié)果，以最近WANG[15]和BAI[16]等人在Nature雜志發(fā)表的人類和動(dòng)物的Δ9-脫飽和酶的晶體結(jié)構(gòu)和昆蟲細(xì)胞色素b5區(qū)域的結(jié)構(gòu)[17]為模板，利用SWISS-MODEL軟件模擬出MaFADS6-Ι的三維結(jié)構(gòu)(圖9)，各突變體的三維結(jié)構(gòu)模擬圖顯示，對(duì)K61和D68兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變后，其三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，而其他3個(gè)位點(diǎn)(G63、V66和T69)的突變沒有引起明顯的結(jié)構(gòu)改變，這與釀酒酵母活性驗(yàn)證結(jié)果吻合。

綜上所述，K61和D68兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)MaFADS6-Ι的活性起關(guān)鍵作用，G63和T69 兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)MaFADS6-Ι的活性不起關(guān)鍵作用，V66位點(diǎn)對(duì)MaFADS6-Ι的活性介于上述兩者之間。

a-Cells of control(pYES2/NT C)；b-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι；c-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61T；d-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61F；e-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63A；f-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63T；g-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66T；h-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66A；i-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68N；j-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68L；k-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69V；l-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69S圖8　同時(shí)添加底物L(fēng)A和ALA后各重組載體pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)脂肪酸組成的GC圖譜Fig.8　GC of fatty acids in each recombinants by adding both LA and ALA substrates

圖9　突變體的三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.9　Three-dimensional structure of each mutant(其中灰色結(jié)構(gòu)表示突變氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式)

3　結(jié)論

本研究以MaFADS6-Ι為研究對(duì)象，通過(guò)序列分析確定了關(guān)鍵位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行突變后測(cè)定各突變體對(duì)兩底物的催化作用，最終確定了MaFADS6-Ι氨基酸序列中K61和D68兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)對(duì)其催化活性有重要影響。

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Key sites of Δ6 desaturase fromMortierellaalpinaand its effect on catalytic activities

SHI Hai-su, CHEN Hai-qin*, GU Zhen-nan, ZHANG Hao,CHEN Yong-quan, CHEN Wei

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Δ6 desaturase from oleaginousMortierellaalpina(MaFADS6) is a key enzyme in biosynthesis of ω3/ω6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs). This study focused on the relationship between the primary structure and function for MaFADS6-Ι based on site-directed mutagenesis. Non-chain plasmid amplification method was used in this study to target downstream of cytochrome b5 region (HPGG) in the expression unit (MaFADS6-Ι) of pYES2/NT C-MaFADS6-Ιby site-directed mutagenesis. Each recombinant plasmid was transformed and expressed inSaccharomycescerevisiae. The results showed that the catalytic activity of all mutant using α- linolenic acid (ALA) as substrate has not changed. Two catalytic sites, K61 and D68, played a key role for its catalysis on linoleic acid (LA). The LA conversion rate of four corresponding mutants was (6.2 ± 0.5)% (K61T), (0.3 ± 0.0)% (K61F), (8.2 ± 0.7)% (D68N) and (6.6 ± 0.8)% (D68L), respectively, which reduced by more than 50% compared to the original conversion rate. G63 and T69 were two sites which not directly affect the catalysis of LA, but LA conversion of G63T mutant was (8.5 ± 0.9)% which decreased 49.9% compared the original conversion rate due to polarity change of mutation site. LA conversion rates of V66 mutants were (22.3 ± 2.6)% (V66T) and (20.7 ± 2.5)% (V66A), which decreased by 36.1% and 37.8% compared to the original conversion rate. Enzymatic activities were significantly reduced after mutation of two key site of amino acid sequence of MaFADS6-Ι, K61 and D68. It provided a theoretical basis for the study on relationship between primary structure of MaFADS6-Ιand its function.

Δ6 desaturase;Mortierellaalpina; site-directed mutagenesis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609001

碩士研究生(陳海琴教授為通訊作者,E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21276108)

2016-02-03，改回日期：2016-03-21