m iR-342-3p抑制SM 22α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

尚　丹　李美紅　許　馨　曹山虎　孫紹光1.北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站，河北石家莊050000；2.山東省招遠(yuǎn)市人民醫(yī)：藥劑科，山東招遠(yuǎn)265400；.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北石家莊050017

m iR-342-3p抑制SM 22α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

尚丹1*李美紅2*許馨3曹山虎3孫紹光3
1.北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站，河北石家莊050000；2.山東省招遠(yuǎn)市人民醫(yī)：藥劑科，山東招遠(yuǎn)265400；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北石家莊050017

目的探究miR-342-3p是否通過(guò)作用于SM22α啟動(dòng)子，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控SM22α的表達(dá)。方法通過(guò)軟件RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn)，大鼠SM22α啟動(dòng)子中存在一個(gè)miR-342-3p的識(shí)別位點(diǎn)。將miR-342-3pmimics與報(bào)告基因載體pGL3-SM22α-Promoter共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性來(lái)分析miR-342-3p對(duì)SM22α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。將miR-342-3p mimics轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)SM22α mRNA和蛋白質(zhì)水平，分析miR-342-3p對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中SM22α表達(dá)的影響。結(jié)果與miR-control相比，miR-342-3p能夠使SM22α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性降低（0.54±0.03）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與miR-control相比，miR-342-3p能夠使血管平滑肌細(xì)胞中SM22αmRNA水平降低（0.45±0.04）倍，SM22α蛋白質(zhì)水平下降（0.41± 0.05）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論miR-342-3p通過(guò)抑制SM22α啟動(dòng)子活性，從轉(zhuǎn)錄水平降低SM22α的表達(dá)，為miRNA調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化研究提供了新角度。

microRNA；miR-342-3p；SM 22α；啟動(dòng)子

［Avsteact］Ov jective To explore whethermiR-342-3p could repress the expression of SM22αat the transcriptional level by targeting its promoter.M ethods Therewas a potential binding site ofmiR-342-3p in the SM22αpromoter analyzed by using RNAhybrid software.293A cells were co-transfected with miR-342-3p mimics and pGL3-SM22α-Promoter reporter gene vectors，luciferase activity was detected to analyze whether the SM22αpromoter activity is repressed bymiR-342-3p.Vascular smoothmuscle cellswere transfected withmiR-342-3p mimics，SM22αmRNA and protein levelswere detected by using qRT-PCR and Western blot，to explore the influence ofmiR-342-3p on the expression of SM22αin vascular smooth muscle cells.Results Compared with miR-control，SM22αpromoter transcriptional activity was reduced（0.54±0.03）folds bymiR-342-3p，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The SM22αmRNA in vascular smooth muscle cellswas decreased（0.45±0.04）folds，and the SM22αprotein levelwas decreased（0.41±0.05）folds bymiR-342-3p，compared withmiR-control，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.Conclusion miR-342-3p represses the expression of SM22αat the transcriptional level by targeting its promoter，which provides a novel perspective for the study ofmiRNA in vascular smooth muscle cell phenotypic switch regulation.

［Key woeds］microRNA；miR-342-3p；SM22α；Promoter

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的、長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的調(diào)控性非編碼RNA。miRNA的主要作用模式是通過(guò)堿基不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式介導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）與胞質(zhì)中靶mRNA的3'UTR結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的翻譯［1］。值得關(guān)注的是，成熟miRNA不但分布在細(xì)胞質(zhì)中，還廣泛分布在細(xì)胞核內(nèi)，并且很多miRNA在核內(nèi)的濃度遠(yuǎn)高于在胞質(zhì)中的濃度［2-3］。研究證實(shí)，胞核中的miRNA通過(guò)與基因啟動(dòng)子結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。例如，miR-320通過(guò)與POLR3D基因啟動(dòng)子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄［4］；miR-373與E-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)基因的表達(dá)［5］；miR-744和miR-1184均可與cyclin B1啟動(dòng)子結(jié)合并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄上調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生［6］；miR-130a與水通道蛋白AQS4 M1基因啟動(dòng)子結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄水平，參與調(diào)控細(xì)胞液體平衡［7］。

目前，關(guān)于miRNA能否從轉(zhuǎn)水水平參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化完全未知。SM22α（smooth muscle 22）是一種重要的分化型血管平滑肌細(xì)胞的表型標(biāo)志物，參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和表型轉(zhuǎn)化，在動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病中發(fā)揮重要作用［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠SM22α啟動(dòng)子中存在一個(gè)miR-342-3p識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)報(bào)告基因分析等實(shí)驗(yàn)證明，miR-342-3p能夠抑制SM22α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)SM22α的表達(dá)，進(jìn)而可能參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。本研究為miRNA調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究提供了新角度。

員資料與方法

1.1主要儀器與試劑

實(shí)時(shí)定量PCR儀型號(hào)為ABI7300，凝膠成像儀為L(zhǎng)i-COR公司Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，管式冷光儀為Berthold Technologies公司Flash&Glow LB955。質(zhì)粒提取純化試劑盒、質(zhì)粒pGL3和pRL-TK、雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試試劑盒購(gòu)自Promega公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 3000、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自Life Science公司；miRNA mimics購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；大鼠血管平滑肌細(xì)胞株（A7R5）和293A細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；重組質(zhì)粒pGL3-SM22α-Promoter［10］為河北醫(yī)科大學(xué)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建保存。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠血管平滑肌細(xì)胞株（A7R5）和293A均使用含有10%胎牛血清和雙抗的高糖DMEM，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3miRNA的轉(zhuǎn)染

將A7R5細(xì)胞接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，每瓶加入15μL脂質(zhì)體溶于100μL無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5min。每瓶加入40 nmol/LmiRNA溶于100μL無(wú)血清無(wú)抗生素高糖DMEM培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5 min。將上述脂質(zhì)體和核酸輕輕混勻，室溫靜置20min。每瓶換新鮮的無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液1.8 mL，將混合液加入，混勻后置培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6 h，更換為常規(guī)高糖DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收細(xì)胞，進(jìn)行RNA或蛋白質(zhì)提取。

1.4293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染與報(bào)告基因分析

將293A細(xì)胞接種到24孔板，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔加入5μL脂質(zhì)體Lipofectamine 3000、400 ng質(zhì)粒pGL3-SM22α-Promter、50 ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK和20 nmol/LmiRNA，其他操作與上述A7R5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染相同。培養(yǎng)24 h后，按Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。

1.5RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)定量PCR

采用Trizol一步法提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR操作均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。使用的PCR引物序列為SM22α上游引物：5＇-CGAGGAAGGAGCACGAAG-3＇，SM22α下游引物：5＇-TCCTGCGTTGCTGTCTGT-3＇，β-actin上游引物：5＇-TGTGCCCATCTATGAGGGTTACG-3＇，β-actin下游引物：5＇-AAGAGGATGCGGCAGTGGC-3＇。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸15 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)行溶解曲線分析。采用相對(duì)定量方法（2-△△Ct）對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6W estern blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白定量。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，每個(gè)泳道加入30μg蛋白樣本。采用半干轉(zhuǎn)膜法。使用含5%脫脂奶粉的TTBS于37℃封閉PVDF膜2 h。將膜置入TTBS適當(dāng)稀釋的一抗溶液中，4℃孵育過(guò)夜。TTBS室溫洗膜3次，每次10min。將膜置入1∶2000稀釋的熒光標(biāo)記二抗溶液中，于室溫避光孵育1 h。避光洗膜后，使用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取其均值。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠SM 22α啟動(dòng)子與m iR-342-3p的結(jié)合位點(diǎn)

采用RNAhybrid［11］軟件分析發(fā)現(xiàn)，大鼠SM22α啟動(dòng)子（-103～-122）含有一個(gè)miR-342-3p識(shí)別位點(diǎn)；通過(guò)Targetscan［12］軟件分析大鼠SM22α3'UTR上未發(fā)現(xiàn)miR-342-3p的識(shí)別位點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2m iR-342-3p對(duì)大鼠SM 22α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

為了論證miR-342-3p與大鼠SM22α啟動(dòng)子是否存在直接相互作用，本研究將miR-342-3p mimics、miR-control分別與pGL3-SM22α-Promoter和pRLTK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，通過(guò)熒光素酶活性分析顯示，與miR-control相比，miR-342-3p能夠使SM22α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性降低（0.54±0.03）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。細(xì)胞表型標(biāo)志基因α-SMA蛋白質(zhì)水平下降了（0.28± 0.04）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

圖1　大鼠SM 22琢啟動(dòng)子與m iR-342-3p的結(jié)合位點(diǎn)

圖2　m iR-342-3p對(duì)大鼠SM 22琢啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響（n=3）

2.3m iR-342-3p對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中SM 22α mRNA和蛋白質(zhì)水平的影響

為了論證miR-342-3p是否在血管平滑肌細(xì)胞中調(diào)控通過(guò)與啟動(dòng)子互作從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控SM22α的表達(dá)，本研究向A7R5細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-342-3p mimics、miR-control。qRT-PCR檢測(cè)顯示，與miR-control相比，miR-342-3p使SM22αmRNA水平降低了（0.45±0.04）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。另外，Western blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-342-3p血管平滑肌細(xì)胞中SM22α蛋白質(zhì)水平下降了（0.41± 0.05）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血管平滑肌

圖3　m iR-342-3p對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中SM 22琢m RNA和蛋白質(zhì)水平的影響（n=3）

3　討論

miRNA除了通過(guò)與啟動(dòng)子結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的表達(dá)外［4-7］，還能夠通過(guò)以下調(diào)控模式參與眾多生物學(xué)過(guò)程：①miRNA能夠進(jìn)入線粒體，與靶mRNA 5'UTR結(jié)合，激活靶基因的翻譯。例如，miR-1與Ago2協(xié)同結(jié)合于線粒體中ND1和COX1 mRNA的5'UTR，增強(qiáng)它們的翻譯效率，調(diào)控骨骼肌、心肌細(xì)胞的分化過(guò)程［13］。②miRNA能夠與胞核中靶primiRNA結(jié)合，參與miRNA的加工調(diào)控。例如，miR-709可以與核內(nèi)pri-miR-15a/16-1結(jié)合，抑制miR-15a/16-1的成熟，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡［14］。③miRNA通過(guò)與靶mRNA的開放閱讀框結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制其翻譯。例如，miR-134、miR-296和miR-470能夠結(jié)合于Nanog、Oct4和Sox2等基因mRNA的開放閱讀框，抑制蛋白表達(dá)水平，參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化［15］。④miRNA除了識(shí)別靶mRNA的3'UTR外，還能與靶mRNA的5'UTR結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的翻譯。例如，miR-10a能夠結(jié)合于多種核糖體蛋白mRNA的5'UTR，增強(qiáng)它們的翻譯效率［16］。⑤miRNA與lncRNA發(fā)生互作。例如，miR-133和miR-135可通過(guò)與linc-MD1的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MAML1和MEF2C的表達(dá)，參與肌肉分化調(diào)控過(guò)程［17］。⑥miRNA與假基因發(fā)生互作。例如，miR-19b和miR-20a可與PTENP1假基因3'UTR結(jié)合降低其豐度，進(jìn)而調(diào)控抑癌基因PTEN活性［18］。⑦miRNA通過(guò)與蛋白因子結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。例如，miR-328可以與蛋白質(zhì)HnRNPE2結(jié)合，使其與CEBPA mRNA解離，促進(jìn)細(xì)胞分化［19］。

miRNA廣泛參與了VSMC表型轉(zhuǎn)化、增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程［20-25］，在動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，但這些成果主要關(guān)注miRNA對(duì)胞質(zhì)中mRNA 3'UTR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控模式，而未對(duì)上述其他調(diào)控模式進(jìn)行探討。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-342-3p能夠降低血管平滑肌細(xì)胞中SM22αmRNA和蛋白質(zhì)水平。通過(guò)分析在SM22αmRNA 3'UTR中未發(fā)現(xiàn)miR-342-3p的識(shí)別位點(diǎn)，而在大鼠SM22α啟動(dòng)子中存在1個(gè)miR-342-3的識(shí)別位點(diǎn)。由此推測(cè)miR-342-3可能通過(guò)與SM22α啟動(dòng)子相互作用，從轉(zhuǎn)錄水平，而不是轉(zhuǎn)錄后水平，調(diào)控SM22α的表達(dá)。為了論證上述推測(cè)，本研究通過(guò)報(bào)告基因分析，證明miR-342-3能夠抑制SM22α啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。提示miR-342-3p通過(guò)作用于SM22α啟動(dòng)子，從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)SM22α的表達(dá)。

總之，本研究證明miR-342-3p不通過(guò)作用于大鼠SM22αmRNA 3'UTR，而是通過(guò)作用于大鼠SM22α啟動(dòng)子，從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)SM22α的表達(dá)，進(jìn)而可能參與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化調(diào)控，為miRNA調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究提供了新角度。

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m iR-342-3p eepeesses teansceiptional activity of SM 22αpeomotee

SHANG Dan LIMeihong XU Xin CAO Shanhu SUN Shaoguang

1.Shijiazhuang Health and Epidemic Prevention Station，Beijing Railway Bureau，Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Pharmacy，Zhaoyuan People's Hospital，Shandong Province，Zhaoyuan 265400，China；3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Basic Medical College，Hebei Medical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China

R34

A

1674-4721（2016）08（c）-0012-051*2*333

2016-05-23本文編輯：程銘）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81200215）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013206151）；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（1120140198）。

*共同第一作者

孫紹光（1978.4-），男，博士，副教授；研究方向：調(diào)控性非編碼RNA。