γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號逆轉馬兜鈴酸誘導的腎小管細胞表型轉化

洪煒龍，陸 紅，吳存造，夏 鵬，陳必成，白永恒（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院.外科實驗室，.醫(yī)學檢驗中心，.移植科，浙江溫州 5000）

γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號逆轉馬兜鈴酸誘導的腎小管細胞表型轉化

洪煒龍1，陸 紅2，吳存造3，夏 鵬3，陳必成1，白永恒1
（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.外科實驗室，2.醫(yī)學檢驗中心，3.移植科，浙江溫州 325000）

目的 探討γ-分泌酶抑制劑DAPT對馬兜鈴酸（AA）誘導引起腎小管上皮細胞表型轉化與膠原累積的作用及分子機制。方法 將體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E分為正常細胞對照組、AA 10 mg·L-1組、AA 10 mg·L-1+DAPT1和10 μmol·L-1組。24 h后，實時熒光定量PCR檢測Notch信號關鍵分子Notch1、Jagged1和Numb、表型轉化相關分子轉化生長因子β1（TGF-β1）、E-鈣黏著蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（Bmp7）和基質成分Ⅰ型膠原a1（Col1a1）和Ⅲ型膠原a1（Col3a1）mRNA的表達；細胞免疫熒光染色法檢測Notch1、Jagged1、α-SMA和Col3a1蛋白的表達。結果 與正常細胞對照相比，AA處理后，腎小管上皮細胞基質相關因子TGF-β1，α-SMA和Col3a1 mRNA表達上調，上皮標志物E-鈣黏著蛋白mRNA的表達受到抑制，而且導致了Notch1、Jagged1 mRNA表達的上調和Numb mRNA表達的下調（P＜0.05），提示AA促進腎小管上皮細胞表型轉化與基質累積，同時激活了Notch信號通路。DAPT干預AA作用后，Notch1（P＜0.01）和Jagged1（P＜0.05）的mRNA表達下調，Numb mRNA表達上調（P＜0.05），說明DAPT抑制了AA誘導的Notch信號通路活化。此外，與AA損傷組相比，DAPT也降低了TGF-β1，α-SMA，Col1a1和Col3a1 mRNA表達（P＜0.05），提高BMP-7和E-鈣黏著蛋白mRNA表達（P＜0.05），提示DAPT抑制了AA誘導的上皮細胞的表型轉化與基質累積。結論 DAPT抑制AA誘導的腎小管上皮細胞的表型轉化與基質累積，其可能機制是DAPT靶向干預Notch信號的活化。

DAPT；馬兜鈴酸；表型轉化；基質累積；Notch信號

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.005

Notch信號通路進化中高度保守，其調控細胞增殖、分化和凋亡的功能幾乎涉及所有組織和器官。正常表達的Notch信號在器官發(fā)育和器官修復再生過程中起著重要作用［1-2］，但持續(xù)異常激活的Notch信號可導致肝癌等多種腫瘤的發(fā)生［3］。Notch信號活化也參與了肝、肺等多種器官組織的纖維化［4-7］，但馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）所致的腎纖維化中的作用及分子機制尚未明確［1-2，8］。前期研究表明，AA可致腎小管上皮細胞表達并釋放轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），促使上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT），最終導致基質成分Ⅰ型膠原蛋白（typeⅠcollagen a1，Col1a1）和Ⅲ型膠原蛋白a1（Col3a1）過度累積［9-10］。在此過程中，損傷的上皮細胞反饋性誘導與增殖相關信號的活化，引起細胞的異常增殖，推動EMT和基質累積。（2S）-N-［N-（3，5-二氟苯乙?；?L-丙氨酰］-2-苯基甘氨酸叔丁酯｛N-［N-（3，5-difluorophenacetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT｝為一種γ-分泌酶抑制劑，研究表明，DAPT可阻斷由γ-分泌酶介導的Notch信號受體的酶切過程，使受體分子無法轉變成有效的活性片段，從而抑制Notch信號通路的激活。DAPT的特異性強，在有效范圍內尚不引起毒副作用，而且也已被證明在抗腫瘤方面具有潛在作用［11］。本研究應用DAPT，觀察其對AA所致的EMT、基質累積及Notch信號活化的影響。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑和主要儀器

大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。AA和DAPT（美國Sigma公司）；DMEM細胞培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶和Trizol提取液（美國Gibco公司）；抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（美國Santa Cruz公司）；抗Ⅲ型膠原抗體和TRITC（美國 Bioworld公司）；FITC（北京Solarbio公司）；RT-PCR試劑（美國Promega公司）。MyCycler梯度PCR儀，美國Bio-Rod公司；7500定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀，美國Thermo Scientific公司；AMEX-1200倒置相差顯微鏡，美國Advanced Microscop Group公司；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡，德國Leica公司。

1.2NRK-52E細胞培養(yǎng)和分組

用含5%胎牛血清的DMEM，置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。鋪6孔板，待細胞融合度約為70%時，開始正式實驗。分為正常細胞對照組；AA 10 mg·L-1組；AA 10 mg·L-1+DAPT 1和10 μmol·L-1組。培養(yǎng)24 h后，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)改變。

1.3實時RT-PCR檢測mRNA的表達

采用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，測定260/280 nm吸光度值以確定濃度和純度。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書將細胞RNA逆轉錄成cDNA，并用DEPC處理水稀釋10倍。針對Notch信號關鍵分子Notch1、Jagged1和Numb、表型轉化相關分子TGF-β1、E-鈣黏著蛋白、α-SMA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenic protein 7，Bmp7）Col1a1和Col3a1的mRNA設計特異性引物，以β肌動蛋白作為內參，用實時PCR相對定量法進行測定。引物序列如表1所示，由上海捷瑞公司合成。取逆轉錄產(chǎn)物1 μL進行實時PCR，PCR擴增體系：5 μL 2×SYBR綠色熒光定量試劑、上下游引物各1 μL，終濃度為200 nmol·L-1，1 μL cDNA，2 μL反應緩沖液。擴增程序為：95℃5 min，95℃10 s，60℃35 s，40個循環(huán)。通過溶解曲線評價PCR結果可靠性，采用2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。

1.4免疫熒光檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期NRK-52E細胞，設立正常細胞對照組，AA 10 mg·L-1損傷組和DAPT干預組并進行細胞爬片培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，4%甲醛固定，0.3%Triton-X破膜，0.5%正常山羊血清封閉。各細胞爬片滴加針對Notch1、Jagged1、α-SMA、Col3a1、波形蛋白（vimentin）和E-鈣黏著蛋白的一抗工作液，于4℃孵育過夜。用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）或四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC，紅色）標記的二抗工作液，于37℃孵育60 min。滴加DAPI至細胞爬片上，于室溫染色5 min。胞質綠色或紅色與胞核藍色為陽性著色。每組取10張片，每張取10個高倍視野（400×），用Image Pro Plus 6.0軟件分析熒光積分吸光度值（integrated absorbance，IA）。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件對結果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計分析結果以表示，兩組樣本間比較采用t檢驗與精確概率法，兩組樣本關聯(lián)性比較采用相關性分析，多組樣本間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

Tab.1 Specific mRNA primers for Notch-，epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）-and extra cellular matrixrelated genes

2　結果

2.1DAPT對馬兜鈴酸誘導NRK-52E細胞形態(tài)的影響

如圖1所示，正常細胞密度極高，細胞間接觸緊密，由于接觸抑制，細胞形態(tài)小，呈鋪路石狀；與正常細胞對照相比，AA處理NRK-52E細胞后，細胞數(shù)量急劇下降，細胞損傷表現(xiàn)明顯，失去貼壁作用，細胞漂浮在培養(yǎng)液中，并且細胞形態(tài)大，呈多形性。與AA 10 mg·L-1組相比，DAPT干預后，懸浮的細胞明顯減少，貼壁細胞數(shù)量增加。但同時，隨著DAPT濃度的增加，細胞數(shù)量也隨著下降，推測可能與其細胞增殖的抑制作用相關。

Fig.1 Effect of DAPT on morphology of NRK-52E cells injuried by aristolochic acid（AA）（×200）.The cells were cultured for 24 h.

2.2DAPT對馬兜鈴酸誘導的NRK-52E細胞基質累積和TGF-β1表達的影響

細胞免疫熒光結果顯示（圖2），與正常細胞對照相比，AA 10 mg·L-1作用下，Col3a1蛋白的表達顯著上調。AA 10 mg·L-1組的Col1a1和Col3a1 mRNA的表達水平升高（P＜0.05）（表2），提示AA誘導了腎小管上皮細胞基質過度的累積。DAPT干預后，Col3a1蛋白表達水平顯著下調（P＜0.05），Col1a1和Col3a1的mRNA水平也顯著下調（P＜0.05）。因此，DAPT對AA所致的基質累積起到了抑制作用，這種作用可能與下調的TGF-β1mRNA表達密切相關。

2.3DAPT對馬兜鈴酸誘導NRK-52E細胞中EMT相關mRNA的影響

實時PCR結果顯示（表3），與正常細胞對照相比，AA 10 mg·L-1組肌成纖維細胞標志物α-SMA的mRNA表達水平上調（P＜0.05），上皮細胞標志物E-鈣黏著蛋白的mRNA表達水平下調（P＜0.05）。免疫熒光結果顯示（圖3），AA 10 mg·L-1作用后，α-SMA的蛋白表達上調至正常細胞對照的9.705倍（P＜0.05）。DAPT干預后，E-鈣黏著蛋白mRNA表達提高（P＜0.05），而α-SMA mRNA表達下降（P＜0.05）。EMT抑制因子Bmp7 mRNA表達上調（P＜0.05）。因此，DAPT可拮抗AA所致的表型轉化進程。

Fig.2 Effect of DAPT on Col3A1 protein expression in NRK-52E cells injured by AA（×400）.See Fig.1 for the treatment.

Tab.2 Effect of DAPT on mRNA expression of Col1a1，Col3a1 and TGF-β11in NRK-52E cells injured by AA

2.4DAPT對馬兜鈴酸誘導NRK-52E細胞中Notch信號的影響

實時PCR結果顯示（表4），DAPT作用24 h后，隨著DAPT濃度增加，Numb mRNA表達顯著上調（P＜0.05），而Notch1和Jagged1的mRNA表達顯著下調（P＜0.01，P＜0.05），提示Notch信號通路被抑制。免疫熒光結果也顯示（圖4），DAPT可抑制AA 10 mg·L-1所致的Notch1和Jagged1蛋白表達升高。

Tab.3 Effect of DAPT on mRNA expression of EMT-related molecules in NRK-52E cells injured by AA

Fig.3 Effect of DAPT on protein expression of α -SMA in NRK-52E cells injured by AA（×400）.See Fig.1 for the cell tretament.

Tab.4 mRNA Expression of Notch signaling molecules in NRK-52E cells injured by AA

Fig.4 Effect of DAPT on protin expression of Notch1 and Jagged1 in NRK-52E cells injured by AA（×400）. See Fig.1 for the cell treatment.

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，γ-分泌酶抑制劑DAPT能顯著抑制AA所致腎纖維化過程中Notch信號的活化，同時緩解腎小管細胞纖維化進程，甚至在一定程度上使得纖維化過程中肌成纖維樣腎小管細胞重新獲得上皮細胞表型。

AA損傷后，Col1a1，Col3a1和TGF-β1mRNA表達上調，肌成纖維細胞標志物α-SMA mRNA表達上調，上皮細胞標志物E-鈣黏著蛋白表達下調，同時EMT抑制因子Bmp7 mRNA表達下調，此外，Notch1和Jagged1 mRNA表達上調，Numb mRNA表達下調。結果顯示，腎小管上皮細胞在受到AA損傷后，細胞外基質生成能力增強，上皮細胞表型特征減弱，而肌成纖維細胞樣表型特征增強，同時EMT抑制能力下調。此外，Notch信號被活化。據(jù)此結果推測，在受到AA損傷后，腎小管上皮細胞發(fā)生了EMT和基質累積，進而導致了纖維化，而且Notch信號通路的激活可能參與這一過程。而相比于AA損傷組，DAPT干預后，Col1a1，Col3a1和TGF-β1mRNA表達下調，α-SMA mRNA表達下調，E-鈣黏著蛋白mRNA表達上調，同時Bmp7 mRNA表達上調，此外，Notch1和Jagged1 mRNA表達下調，Numb mRNA表達上調。結果顯示，AA損傷的腎小管細胞在受到DAPT干預后，細胞外基質生成能力下降，上皮細胞表型特征增強，而肌成纖維細胞樣表型特征減弱，EMT抑制能力顯著上調，同時Notch信號受到抑制。據(jù)此結果推測，在受到DAPT干預后，AA損傷的腎小管上皮細胞所發(fā)生的EMT和基質累積受到顯著抑制，甚至出現(xiàn)逆轉。此外，據(jù)此結果推斷，Notch信號通路參與了AA誘導的腎小管細胞表型轉化。

本研究雖然可推斷DAPT抑制Notch信號逆轉AA誘導的腎小管細胞表型轉化，但要斷定Notch信號是否直接參與表型轉化和纖維化，并且要完整確認通過哪些通路來影響表型轉化和纖維化，需要做進一步研究。此外，本研究針對體外實驗，細胞模型的建立和藥物干預的生化因素較體內條件有大幅簡化，直觀地對Notch信號在AA誘導的腎小管細胞表型轉化過程的整個信號和分子網(wǎng)絡中的作用進行準確的測評和定位，有待進一步研究。

綜上所述，本研究初步從體外實驗角度闡釋DAPT可通過靶向阻斷Notch信號，下調了AA誘導的TGF-β1的表達和釋放，抑制EMT和膠原累積，最終緩解纖維化樣改變。然而，DAPT干預Notch信號進而發(fā)揮抗纖維化作用尚需未來的體內實驗予證實。本研究從信號轉導的調控途徑上查找有效的治療藥物，在一定程度上可為腎間充質纖維化的治療提供新的思路。

［1］ Boyle SC，Liu ZY，Kopan R.Notch signaling is required for the formation of mesangial cells from a stromal mesenchyme precursor during kidney development［J］.Development，2014，141（2）：346-354.

［2］Barak H，Surendran K，Boyle SC.The role of Notch signaling in kidney development and disease ［M］//Reichrath J，Reichrath S，ed.Notch Signaling in Embryology and Cancer.New York：Springer US Publisher，2012：99-113.

［3］Wu G，Wilson G，George J，Qiao L.Modulation of notch signaling as a therapeutic approach for liver cancer［J］.Curr Gene Ther，2015，15（2）：171-181.

［4］Bielesz B，Sirin Y，Si H，Niranjan T，Gruenwald A，Ahn S，et al.Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans［J］.J Clin Invest，2010，120 （11）：4040-4054.

［5］Sweetwyne MT，Tao JL，Susztak K.Kick it up a notch：Notch signaling and kidney fibrosis［J］.Kidney Int Suppl，2014，4（1）：91-96.

［6］Mu YP，Zhang X，Li XE，F(xiàn)an WW，Chen JM，Zhang H，et al.Astragaloside prevents BDL-induced liver fibrosis through inhibition of notch sig?naling activation［J］.J Ethnopharmacol，2015，169：200-209.

［7］Li S，Hu XF，Wang Z，Wu M，Zhang JN.Different profiles of notch signaling in cigarette smokeinduced pulmonary emphysema and bleomycininducedpulmonaryfibrosis［J］.InflammRes，2015，64（5）：363-371.

［8］Xiao ZC，Zhang J，Peng XG，Dong YA，Li HH，Du J.The notch gamma-secretase inhibitor amelio?rates kidney fibrosis via inhibition of TGF-beta/ Smad2/3 signaling pathway activation［J］.Int J Biochem Cell B，2014，55：65-71.

［9］Lu H，Hu LP，Hong D，Hong WL，Lin CC，Wang SL，et al.Sedum sarmentosum Bunge extract inhibits epithelial-mesenchymal transition and collagen accumulation in aristolochic acidtreated rat renal tubular epithelial cells［J］.Chin J Pathophysiol（中國病理生理雜志），2013，29（12）：2172-2178.

［10］Lu H，Chen BC，Hu LP，Hong WL，Lin CC，Bai YH. Protective effect of Sedum sarmentosum Bunge extract against aristolochic acid-induced rat renal tubular epithelial cell injury［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學與毒理學雜志），2013，27（6）：988-994.

［11］Fender AW，Nutter JM，F(xiàn)itzgerald TL，Bertrand FE，Sigounas G.Notch-1 promotes stemness and epithelial to mesenchymal transition in colorectal cancer［J］. J Cell Biochem，2015，116（11）：2517-2527.

γ-Secretase inhibitor DAPT reduces aristolochic acid-induced phenotypic transformation by inhibiting Notch pathway in renal tubular epithelial cells

HONG Wei-long1，LU Hong2，WU Cun-zao3，XIA Peng3，CHEN Bi-cheng1，BAI Yong-heng1
（1.Wenzhou Key Laboratory of Surgery，2.Department of Laboratory Medicine，3.Department of Transplantation，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of γ-secretase inhibitor N-［N-（3，5-difluorophen?acetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）on phenotypic transformation and matrix accu?mulation induced by aristolochic acid（AA）in renal tubular epithelial cells（NRK-52E）and explore the mechanism.METHODS NRK-52E cells were divided stochastically into normal cell control group，AA 10 mg·L-1group and AA 10 mg·L-1+DAPT 1 and 10 μmol·L-1group.After 24 h，the mRNA expressions of Notch1，Jagged1，Numb，E-cadherin，transforming growth factor-β1（TGF-β1），α-smooth muscle actin（α-SMA），bone morphogenic protein 7（Bmp7），typeⅠ a1（Col1a1）andⅢ collagens a1 （Col3a1）were quantified by quantitative real-time RT-PCR.The protein expressions of Notch1，Jagged1，α-SMA，and Col3a1 in NRK-52E cells were detected by immunofluorescence staining.RESULTS In NRK-52E cells，AA enhanced the expression of TGF-β1，α-SMA and Col3a1 mRNA（P＜0.05），reduced the expression of E-cadherin mRNA（P＜0.05），up-regulated the mRNA expression of Notch1 mRNA（P＜0.01）and Jagged1（P＜0.05），and down-regulated the mRNA expression of Numb mRNA（P＜0.05）compared with normal cell control group，indicating that phenotypic transformation and matrix accumu?lation occurred in AA-treated NRK-52E cells，accompanied by activated Notch signaling.Treatment with DAPT inhibited Notch signaling by decreasing the expression of Notch1 and Jagged1（P＜0.05），and increasing the expression of Numb mRNA（P＜0.05）.Furthermore，DAPT also down-regulated the expression levels of TGF-β1，α-SMA，Col1a1 and Col3a1 mRNA（P＜0.05），and up-regulated the expression level of Bmp7 and E-cadherin mRNA（P＜0.05）compared with AA group，suggesting that DAPT inhibited phenotypic transformation and matrix accumulation in AA-treated NRK-52E cells. CONCLUSlON AA induces phenotypic transformation and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells，which is inhibited by DAPT treatment.The possible mechanism is that DAPT suppresses the activation of Notch signaling，resulting in the reduction of epithelial-to-mesenchymal transition and matrix deposition.

DAPT；aristolochic acid；phenotype transformation；matrix accumulation；Notch signaling

The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LQ16H310005）；Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LY16H050007）；and Wenzhou Municipal Science and Technology Plan Project （Y20130149）

BAI Yong-heng，E-mail：greatsailor@163.com，Tel：（0577）88069338

R974，R966

A

1000-3002-（2016）03-0209-06

2015-10-23接受日期：2016-03-10）

（本文編輯：賀云霞）

浙江省自然科學基金（LQ16H310005）；浙江省自然科學基金（LY16H050007）；溫州市科技計劃項目（Y20130149）

洪煒龍，男，實驗師，主要從事?lián)p傷后修復機制及干預研究。

白永恒，E-mail：greatsailor@163.com