實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻*

劉 洋，胡佩茹1，馬思三1，葉金云**

（1：湖州師范學(xué)院生命科學(xué)院，湖州313000）

（2：浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州313000）

（3：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州313000）

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻*

劉 洋1，2，3，胡佩茹1，馬思三1，葉金云1，2，3**

（1：湖州師范學(xué)院生命科學(xué)院，湖州313000）

（2：浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州313000）

（3：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州313000）

南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻的豐度對于周邊縣市取水口的水質(zhì)安全和太湖水質(zhì)有著重要影響.以藻毒素合成酶基因mcyE/ndaF為靶基因，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測產(chǎn)毒微囊藻的方法，并對南太湖入湖口7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)水樣中產(chǎn)毒微囊藻的豐度進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：該實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性強(qiáng)及準(zhǔn)確性、重復(fù)性較好.建立銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.454x+49.88，斜率為-3.454，R2=0.991，擴(kuò)增效率E為94.6%，定量檢測區(qū)間為1.689×104～1.689×108拷貝數(shù)/μl.對南太湖入湖口7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)檢測表明，夾浦和合溪2個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻數(shù)量最高，預(yù)測產(chǎn)毒微囊藻濃度分別為（1.99±0.35）×105和（1.47±0.23）×105cells/ml.7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻的種類較為一致，均為銅綠微囊藻.該方法可以快速準(zhǔn)確地檢測水體中微囊藻毒素產(chǎn)毒藻種種類和數(shù)量，為藍(lán)藻水華監(jiān)測、預(yù)警提供技術(shù)依據(jù).

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；產(chǎn)毒微囊藻；入湖口；南太湖；銅綠微囊藻

?2016 by Journal of Lake Sciences

微囊藻毒素（Microcystin，MC）是一些產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)生的單環(huán)七肽，共有100多種異構(gòu)體.它是一種肝毒素，長期飲用有微囊藻毒素的水，會引發(fā)肝損傷甚至肝癌［1-3］.微囊藻毒素主要由微囊藻屬（Microcystis）、魚腥藻屬（Anabaena）、束絲藻屬（Aphanizomenon）、念珠藻屬（Nostoc）、席藻屬（Phormidium）和浮絲藻屬（Planktothrix）等一些藻種產(chǎn)生［4］.產(chǎn)毒微囊藻的暴發(fā)，對于人類的公共安全、水生動物及牲畜造成極大的危害［5］.在我國大部分富營養(yǎng)化水體中，銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）在數(shù)量和發(fā)生頻率上均占優(yōu)勢.

太湖是我國第三大淡水湖泊，水域面積約2428 km2.近年來，由于太湖流域經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，向水體中排放了大量污染物，造成水體污染和富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重，藍(lán)藻水華暴發(fā)頻繁［6］.南太湖位于太湖南岸，一般指浙江省內(nèi)沿岸部分湖面，管轄水域面積約300 km2，湖岸線長64 km.苕溪水系和長興水系是南太湖主要的入湖水系，這2條水系共有大錢港、新港口、小梅口、楊家浦、合溪、新塘和夾浦7個(gè)入湖口.南太湖入湖水系與太湖水域季節(jié)性水交換頻繁，洪水期由入湖水系向太湖蓄水，河道枯水期，太湖水體倒灌入入湖河道［7-8］.南太湖附近幾個(gè)縣市飲用水取水口位于這幾條入湖溪流內(nèi).因太湖水倒灌，太湖藍(lán)藻對南太湖入湖河道水質(zhì)的影響巨大，嚴(yán)重威脅該區(qū)域供水安全［8］.因此，及時(shí)監(jiān)測該區(qū)域的藍(lán)藻發(fā)生情況，對保證該區(qū)域的供水安全具有重要意義.

藍(lán)藻水華監(jiān)測，傳統(tǒng)方法主要通過顯微鏡鏡檢法，對水體中的藻細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，后來又有通過藻類的16S rDNA序列分析進(jìn)行藻種分類，然而這些方法不能區(qū)分產(chǎn)毒微囊藻及非產(chǎn)毒微囊藻，并在藍(lán)藻暴發(fā)之前對其進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測［9-10］.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、準(zhǔn)確性好的分子檢測方法，已被用于產(chǎn)毒微囊藻的監(jiān)測［9］.微囊藻毒素由一些藻毒素合成酶基因簇控制，該基因簇由mcyA～mcyJ等10個(gè)基因構(gòu)成.通過檢測微囊藻毒素的產(chǎn)毒基因mcyA、mcyB、mcyD可以用于監(jiān)測水體中的產(chǎn)毒微囊藻細(xì)胞［11-14］.mcyE基因可以用于設(shè)計(jì)種特異性引物，用于監(jiān)測水體中的產(chǎn)生微囊藻毒素的不同產(chǎn)毒藻種［15-16］.Ouahid等利用mcyE等藻毒素合成酶基因監(jiān)測水體中的產(chǎn)毒微囊藻［17］.Al-Tebrineh等利用mcyE和ndaF基因設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，同時(shí)監(jiān)測水體中的不同微囊藻毒素產(chǎn)毒藻種［15］.

由于不同水域環(huán)境中水體的產(chǎn)毒微囊藻的種類及分布不同，本研究利用mcyE/ndaF基因?yàn)槟繕?biāo)模版，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對南太湖入湖口7個(gè)水質(zhì)監(jiān)測點(diǎn)水體中的產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行檢測，為該區(qū)域的藍(lán)藻水華監(jiān)測、預(yù)警和水質(zhì)安全提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1藻種來源和培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用藻種購買于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫，藻種編號為魚腥藻（Anabaena sP.）FACHB-82、水華束絲藻（Aphanizomenon flos-aque）FACHB-1039、銅綠微囊藻 FACHB-315、柱胞魚腥藻（Anabaena cylindrica）FACHB-170、席藻（Phormidium sP.）FACHB-1099、水華束絲藻FACHB-245、顫藻（Oscillatoria sP.）FACHB-1053，于BG-11培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，顫藻FACHB-528在SE培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng).培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為30 μE/（m2·s），光暗比12 h：12 h.

1.2藻細(xì)胞基因組DNA的提取

1.2.1基因組DNA提取 分別采用2種方法提取藻細(xì)胞基因組DNA：方法1按植物基因組DNA提取試劑盒（SK8203，上海生工）的操作程序，提取藻細(xì)胞基因組DNA.取藻液10 ml，12000轉(zhuǎn)/min離心15 min，棄上清，取沉淀用于基因組DNA提??；方法2基因組DNA的快速提取，參考文獻(xiàn)［18］.

1.2.2DNA濃度與純度檢測 分別取藻類基因組的DNA各5 μl，加入495 μl TE緩沖液稀釋，用微量核酸蛋白測定儀（Beckman coulter DU-530，美國）測定DNA濃度，測定A260和A280，DNA濃度計(jì)算公式為：［DNA］= A260×稀釋倍數(shù)100×40 μg/ml.

1.3PCR引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)mcyE和ndaF基因設(shè)計(jì)普通PCR和熒光定量PCR引物，具體參考文獻(xiàn)［15］，引物序列見表1.

16S rDNA和mcyE/ndaF基因的PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L引物-F 1 μl，10 μmol/L引物-R 1 μl，10×PCR buffer 2 μl，10 μmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，模版DNA 1 μl，Tag酶（5U/μl）0.5 μl，dd H2O 17μl，總體積25 μl，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，退火溫度分別為50℃和56℃，30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃，5 min.將PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳.

表1　普通PCR和熒光定量PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers used in conventional PCR and qPCR

1.4熒光定量PCR

在Bio-rad CFX3700儀器上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：Hotstart fluo-PCR mix（SK2956A，上海生工）10 μl，10 μmol/L cyano-real mcyE-F 0.5 μl，10 μmol/L cyano-real mcyE-R 0.5 μl，0.1%（w/v）BSA 2 μl，10%（w/v）PVP-30 2 μl，模版DNA 1 μl，dd H2O 4 μl，總體積20 μl，PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，退火過程中收集熒光.每個(gè)樣品重復(fù)3次.熔解曲線的過程：95℃ 15 s，從60℃開始升高至95℃，每30 s溫度升高0.5℃，進(jìn)行熔解曲線分析.

1.5特異性檢測

提取不同藻種基因組DNA，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR擴(kuò)增，并以16S rDNA為對照，檢測引物的特異性.

1.6熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別以銅綠微囊藻FACHB-315基因組DNA進(jìn)行10倍稀釋，測定DNA濃度，以基因拷貝數(shù)的對數(shù)值與反應(yīng)循環(huán)數(shù)（Ct）值之間建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.基因拷貝數(shù)的計(jì)算公式為：DNA的拷貝數(shù)=6.02×1023（coPies/mol）× DNA濃度（g/μl）/基因組DNA分子量，微囊藻基因組為4.70 Mb，1 bP堿基分子量為660 g/mol.

擴(kuò)增效率E=10-1/S-1，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程的斜率.

1.7環(huán)境樣品檢測

在南太湖入湖口的7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行采樣，采樣時(shí)間為2014年8月3日，水溫26℃.用采水器采集表層20 cm水樣.每升水樣加15 ml左右魯哥試劑.1000 ml水樣直接靜置沉淀24 h，用虹吸管小心抽掉上清液，余下20～25 ml沉淀物轉(zhuǎn)入50 ml離心管中，4℃保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后利用顯微鏡鏡檢法進(jìn)行藻細(xì)胞檢測.用0.45 μm濾膜過濾收集藻細(xì)胞，置于-20℃條件下保存水樣和藻細(xì)胞.按基因組DNA快速提取法提取DNA，并進(jìn)行熒光定量PCR，檢測樣品中產(chǎn)毒微囊藻.每個(gè)樣品重復(fù)3次.

2　結(jié)果與分析

2.1引物特異性檢測

提取不同產(chǎn)毒藻種的基因組DNA進(jìn)行微囊藻毒素產(chǎn)毒基因mcyE/ndaF和16S rDNA基因PCR擴(kuò)增，其中銅綠微囊藻FACHB-315為微囊藻毒素產(chǎn)毒藻種，魚腥藻 FACHB-82、顫藻FACHB-528、水華束絲藻FACHB-245、顫藻FACHB-1053、席藻FACHB-1099為魚腥藻毒素產(chǎn)毒藻種，柱胞魚腥藻FACHB-1039為柱胞藻毒素產(chǎn)毒藻種.僅在微囊藻毒素產(chǎn)毒藻種銅綠微囊藻FACHB-315擴(kuò)增出125 bP左右目標(biāo)條帶，其他產(chǎn)毒藻種未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明引物特異性較好；所有藻種的16S rDNA基因均擴(kuò)增出80 bP左右的目標(biāo)條帶，表明藻種基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增體系無問題（圖1）.對這些產(chǎn)毒藻種的熒光定量PCR結(jié)果表明，只有其中銅綠微囊藻FACHB-315有熒光檢測信號，其余藻種均未能擴(kuò)增出信號.

2.2熒光定量PCR靈敏度與重復(fù)性

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以銅綠微囊藻FACHB-315基因組DNA 10倍梯度稀釋后作為熒光定量PCR模版DNA，進(jìn)行qPCR測定.以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct為縱坐標(biāo)建立實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2.利用該qPCR反應(yīng)條件檢測微囊藻毒素產(chǎn)毒藻種，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.454，R2=0.991，擴(kuò)增

圖1　藍(lán)藻毒素基因PCR擴(kuò)增（M：DNA ladder（100 bP Takara）；1魚腥藻FACHB-82；2顫藻FACHB-528；3水華束絲藻FACHB-1039；4銅綠微囊藻FACHB-3155；5柱胞魚腥藻FACHB-170；6席藻FACHB-1099；7水華束絲藻FACHB-245；8顫藻FACHB-1053；瓊脂糖凝膠含量為3%）Fig.1 PCR amPlification of microcystin-Producing gene

效率E=101/3.454-1=94.6%，定量檢測區(qū)間為1.689×104～1.689×108拷貝數(shù)/μl.

圖2　mcyE/ndaF基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線（A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR曲線；B：標(biāo)準(zhǔn)曲線）Fig.2 Standards curves of qPCR targeted with mcyE/ndaF gene

2.2.2熔解曲線 以銅綠微囊藻FACHB-315基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，并進(jìn)行熔解曲線分析，由圖3可見，熔解曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，熔解溫度為80±0.5℃，表明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物特異，無非特異性擴(kuò)增.

2.2.3重復(fù)性 將不同濃度的銅綠微囊藻FACHB-315基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR測定，結(jié)果如表2所示.基因組標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)數(shù)變異系數(shù)分別為0～5.62%，表明基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性良好，符合制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求.

2.3全細(xì)胞熒光定量PCR檢測

將銅綠微囊藻FACHB-315藻細(xì)胞進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取1 ml藻樣，提取基因組DNA，進(jìn)行qPCR，結(jié)果如表3，可檢測的藻細(xì)胞濃度最低為3.26×104，mcyE/ndaF基因拷貝數(shù)為5.415×105，藻細(xì)胞濃度與mcyE/ndaF基因的相關(guān)性良好（圖2），可以根據(jù)樣品中的mcyE/ndaF基因拷貝數(shù)，利用y=-3.454x+49.88方程推測藻細(xì)胞濃度.

表2　熒光定量PCR重復(fù)性檢測Tab.2 RePetitiveness test of qPCR

表3　全細(xì)胞熒光定量PCR檢測Tab.3 qPCR detection with whole cell

2.4南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻檢測

南太湖入湖口水質(zhì)對于周邊縣市的飲用水安全及太湖水質(zhì)有著重要影響，本研究選取南太湖入湖口7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)，在太湖藍(lán)藻容易暴發(fā)的8月進(jìn)行取樣，利用熒光定量PCR方法檢測產(chǎn)毒微囊藻豐度，結(jié)果見表4，夾浦和合溪監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻豐度最高.通過熒光定量PCR溶解曲線分析表明，這7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻的熔解溫度為80.5℃，表明產(chǎn)毒微囊藻的種類較為一致，均為銅綠微囊藻.

表4　熒光定量PCR方法檢測南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻Tab.4 Detection of microsystin-Producing algae with qPCR methods

3　討論

在藍(lán)藻水華暴發(fā)影響水質(zhì)安全之前，快速準(zhǔn)確地對產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行監(jiān)控是非常重要的.傳統(tǒng)監(jiān)測方法不能區(qū)分藍(lán)藻水華中的產(chǎn)毒微囊藻與非產(chǎn)毒微囊藻.以微囊藻毒素產(chǎn)毒和節(jié)球藻毒素基因mcyE/ndaF為靶基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以快速準(zhǔn)確的檢測水體中的產(chǎn)毒微囊藻，可以同時(shí)檢測多種產(chǎn)微囊藻毒素和節(jié)球藻素的不同藻種細(xì)胞，特異性強(qiáng)，靈敏度高、準(zhǔn)確性好［15-16］.本研究以微囊藻屬、魚腥藻屬、柱孢藻屬等8種不同藻種，以mcyE/ndaF為靶基因進(jìn)行常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測，表明引物特異性非常高.該結(jié)果與Al-Tebrineh等［15］的研究結(jié)果一致.

通過對產(chǎn)毒微囊藻銅綠微囊藻FACHB-315進(jìn)行靈敏度和重復(fù)性檢測，發(fā)現(xiàn)利用qPCR對銅綠微囊藻的范圍為1.689×104～1.689×108拷貝數(shù)/μl，靈敏度低于Vaitomaa等的報(bào)道［19］，其對于銅綠微囊藻的檢測范圍為6.6×102～6.6×106mcyE基因拷貝/反應(yīng)體系，可能與藻基因組提取質(zhì)量有關(guān).本研究采用了一種DNA快速提取方法，該方法可以高效快速地提取藻細(xì)胞DNA，整個(gè)過程僅需20 min，DNA提取質(zhì)量經(jīng)檢測，純度未達(dá)到A260/A280大于1.8，但可以用于高通量的普通PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng).在熒光定量PCR反應(yīng)中需加入2種試劑，即聚烙吡咯烷酮（PVP-30）和牛血清蛋白BSA，該試劑可以顯著增強(qiáng)反應(yīng)的靈敏度，降低反應(yīng)對于模版質(zhì)量的要求，與Xin等［18］的研究結(jié)果一致，對于高通量的熒光定量PCR反應(yīng)十分重要.

全細(xì)胞熒光定量PCR表明，藻細(xì)胞濃度與mcyE/ndaF基因的相關(guān)性良好.因此應(yīng)用該方法不僅可以用于水華發(fā)生時(shí)對銅綠微囊藻定量檢測，而且可以用于低密度時(shí)對該藻進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并及時(shí)做出預(yù)警.

本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測太湖藍(lán)藻水華高發(fā)季節(jié)，南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻的數(shù)量，研究結(jié)果表明，南太湖入湖口產(chǎn)毒微囊藻主要由銅綠微囊藻構(gòu)成，在夾浦和合溪2個(gè)監(jiān)測點(diǎn)銅綠微囊藻豐度較高，分別為（1.99±0.35）×105和（1.47±0.23）×105cells/ml，這與楊曉紅等［8］的研究結(jié)果一致.該方法可以快速準(zhǔn)確地對產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行監(jiān)測、預(yù)警，對于保證該區(qū)域的飲用水安全及了解南太湖入湖水系對太湖水質(zhì)的影響具有十分重要的意義.

4　結(jié)論

建立了以mcyE/ndaF基因?yàn)榘谢虻漠a(chǎn)毒微囊藻實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y= -3.454x+49.88，斜率為-3.454，R2=0.991，擴(kuò)增效率E=101/3.454-1=94.6%，定量檢測區(qū)間為1.689×104～1.689×108拷貝數(shù)/μl.對南太湖入湖口7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行了檢測，其中夾浦和合溪2個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻豐度最高，分別為（1.99±0.35）×105和（1.47±0.23）×105cells/ml.7個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的產(chǎn)毒微囊藻種類較為一致，均為銅綠微囊藻.

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Detection of microcystin-producing Microcystis ceLLs at the entrance of rivers to southern Lake Taihu by reaL-time fLuorescence quantitative PCR

LIU Yang1，2，3，HU Peitu1，MA Sisan1&YE Jinyun1，2，3**
（1：School of Life Science，Huzhou Normal University，Huzhou 313000，P.R.China）
（2：Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resource Conservation and Development，Huzhou 313000，P.R.China）
（3：Key Laboratory of Aquatic Animal Genetic Breeding and Nutrition，Chinese Academy of Fishery Science，Huzhou 313000，P.R.China）

The amount of Microsystis cells at the entrance of rivers to southern Lake Taihu has imPortant influence on the drinking water security and water quality to county nearby and Lake Taihu.A real-time fluorescence quantitative PCR method was established using the microcystin synthetase gene mcyE/ndaF as target in this study.The quantity of Microsystis cells at the entrance of rivers to southern Lake Taihu was assayed.Results showed that the sPecificity，accuracy and rePetitiveness of the method were good.The standard curve to detect Microcystis aeruginosa was y=-3.454x+49.88.The sloPe，correlation coefficient and amPlication efficiency were-3.454，0.991 and 94.6%，resPectively.It was revealed that the amount of microcystin Producing blue-green algae at site of JiaPu and Hexi was the highest among the 7 samPling sites，reaching（1.99±0.35）×105and（1.47±0.23）×105cells/ml，resPectively.The main microcystin Producing sPecies was Microcystis aeruginosa in all the samPling sites.This method could be used raPidly and accurately to detect the quantity and tyPe of the microcystin Producing blue-green algae，and Provide evidence for algal bloom and early warning.

Real-time fluorescence quantitative PCR；microcystin Producing cells；the entrance of lake；southern Lake Taihu；Microcystis aeruginosa

10.18307/2016.0202

*浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目-分析測試科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C37091）資助.2015-04-21收稿；2015-06-19收修改稿.劉洋（1975～），男，博士，講師；E-mail：liuyang_07@126.com.

**

；E-mail：ziff2006@163.com.