枯草芽孢桿菌產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

朱曉立，俞巍蔚

枯草芽孢桿菌產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

朱曉立1，俞巍蔚2

（1.廣東輕工職業(yè)技術學院食品與生物工程系，廣東廣州 510300；
2.廣州市蔚林生物科技有限公司，廣東廣州 510640）

在三角瓶培養(yǎng)條件下，采用單因素實驗對枯草芽孢桿菌 B53 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源進行了優(yōu)化。在此基礎上進行了正交實驗，確定了菌株B53最佳的產孢發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米漿17g/L、NaCl 3g/L，MgSO40.2g/ L。在最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，芽孢濃度為9.6×109個/mL。

枯草芽孢桿菌；芽孢；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，革蘭氏陽性菌，芽孢（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大，生長溫度：最高溫度45～55℃；最低溫度 5～20℃。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。枯草芽孢桿菌已廣泛應用于畜牧業(yè)、酶制劑產業(yè)、病蟲害防治等領域［1］。通過提高枯草芽孢桿菌芽孢比例，使得活菌制劑的活菌數量得到保障［2］。芽孢具有較好的抗逆性，可以抵抗外界的環(huán)境壓力，可以提高活菌制劑的穩(wěn)定性，保證其使用效果［3］。

本研究用的枯草芽孢桿菌是能生產堿性蛋白酶的菌株，可有效降解飼料中的某些抗營養(yǎng)因子，提高飼料轉化率。這株枯草芽孢桿菌具有廣闊的發(fā)展前景，能在農業(yè)生物防治、畜牧、水產養(yǎng)殖等方面廣泛應用，產生一定的社會效益和生態(tài)效益。

1　材料與方法

1.1菌株

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis B53由廣東輕工職業(yè)技術學院食品與生物工程系保存。

1.2培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：葡萄糖1g/L，酵母膏0.5g/L，大豆蛋白胨1g/L，MgSO40.2g/L，瓊脂20g/L

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，可溶性淀粉5g/L，MgSO40.2g/L

搖瓶基礎培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，NaCl 3g/L，大豆蛋白胨5g/L，MgSO40.2g/L

以上培養(yǎng)基pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.3培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從斜面中勾取一環(huán)菌種接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)24h。

搖瓶培養(yǎng)：取3mL種子液接入已裝有27mL搖瓶培養(yǎng)基的三角瓶中（接種量為10%），放在搖床中，150r/min，37℃振蕩培養(yǎng)6h后，每隔3h取一次樣進行稀釋涂布，進行單因素探究。

1.4菌體及芽孢計數

采用平板稀釋涂布法測菌數；80℃水浴15min，用平板稀釋法檢測芽孢生成量。

1.5單因素實驗

1.5.1最佳碳源的確定

分別用玉米淀粉，果糖，木糖，乳糖，糖蜜，蔗糖等代替1.2中的搖瓶基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖，其中相對分子質量保持一致，其他組分均相同，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，用稀釋平板計數法來測定發(fā)酵液中菌數和芽孢數，確定最佳碳源。

1.5.2最佳碳源濃度的確定

在確定好最佳碳源后，選取碳源濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，進行最佳碳源濃度的確定。培養(yǎng)方法同1.3，檢測方法同1.4。

1.5.3最佳氮源的確定

分別用尿素，硫酸銨，檸檬酸銨，酵母粉，玉米漿，NH4H2PO4，（NH4）2HPO4等代替1.2中的搖瓶基礎培養(yǎng)基中的大豆蛋白胨，其中相對分子質量保持一致，其他成分均相同，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，用稀釋平板計數法來測定發(fā)酵液中菌數和芽孢數，確定最佳氮源。

1.5.4最佳氮源濃度的確定

在確定好最佳氮源后，選取氮源濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，進行最佳氮源濃度的確定。培養(yǎng)方法同1.3，檢測方法同1.4。

1.6正交試驗設計

利用篩選出的一種碳源，以及兩種氮源，設計三因素四水平。搖瓶培養(yǎng)到第24h取樣檢測。培養(yǎng)方法同1.3，檢測方法同1.4。

2　結果與討論

2.1單因素實驗

2.1.1碳源種類及碳源濃度對芽孢數量的影響

7種碳源對枯草芽孢桿菌芽孢生成影響如表1所示。單糖容易利用，二糖和多糖要經過微生物水解為單糖才可被微生物利用，所以在相同時間內菌體生長和芽孢生成的速度有所不同，單糖作為碳源時菌體生長較快。

表1　不同碳源對菌體芽孢生成的影響

木糖和乳糖作為唯一碳源時，菌體芽孢生成很少，最高僅能達到106，說明這兩種碳源不能被菌體較好的利用，促進菌體生長和芽孢生成。糖蜜、果糖、蔗糖和玉米淀粉作為唯一碳源，菌體芽孢雖然能達到107，但是培養(yǎng)時間較長。葡萄糖作為唯一碳源，菌體芽孢生成速率較快，12h達到108，15h峰值達到6.2×108個/mL。在7種碳源中，葡萄糖極易被菌體利用，有利于芽孢產生，是最佳碳源。

選取不同濃度葡萄糖進行菌體芽孢生成結果，如表2所示。20g/L葡萄糖條件下，芽孢在15h達到9.3×108個/mL。隨著葡萄糖濃度增加，芽孢生成量總體下降，40g/L 和50g/L時，芽孢數量級僅達到107。葡萄糖濃度過高，對菌體芽孢的生成有抑制作用。因此，選取20g/L葡萄糖濃度進行后續(xù)研究。

表2　不同碳源濃度對菌體芽孢生成的影響（葡萄糖）

2.1.2氮源種類及氮源濃度對芽孢數量的影響

9種氮源對枯草芽孢桿菌芽孢生成影響如表3所示。尿素、（NH4）2HPO4、檸檬酸銨做為唯一氮源，在培養(yǎng)期間最高芽孢濃度的數量級相對很低，說明多摩爾數的NH4+不利于菌體利用，生成芽孢。氯化銨和硫酸銨作為唯一氮源，芽孢濃度最高能達到107，NH4H2PO4作為唯一氮源達到2.1×108個/mL，但是相對有機氮源仍然較低。大豆蛋白胨、玉米漿、酵母粉做為作一氮源時，培養(yǎng)12h后芽孢濃度數量級均能達到108，大豆蛋白胨15h芽孢濃度達到最高的6.2×108個/mL，玉米漿18h芽孢濃度達到最高的7.5×108個/mL，而酵母粉芽孢最高濃度僅為3.0×108。大豆蛋白胨和玉米漿都富含蛋白質和氨基酸，對菌體的生長都起到很大的作用，是飼料行業(yè)較為理想的選擇，而玉米漿中含有生物素，在制藥行業(yè)中可用于抗生素的生產，對菌體的生長也起到了很好的保障。因此，選取大豆蛋白胨和玉米漿作為最佳氮源。

表3　不同氮源對菌體芽孢生成的影響

表4　不同氮源濃度對菌體芽孢生成的影響（大豆蛋白胨）

表5　不同氮源濃度對菌體芽孢生成的影響（玉米漿）

15g/L玉米漿條件下，芽孢濃度在18h達到7.3×108個/mL。隨著玉米漿濃度增加到20g/L，芽孢生成量總體下降，芽孢最高濃度推達到3.7×108個/mL。因此，選取15g/L玉米漿濃度進行后續(xù)研究。

2.2正交試驗設計

將篩選出的最優(yōu)碳源、兩個氮源為三因素，設計三因素四水平，其中葡萄糖：10g/L、15g/L、20g/L、25g/L，大豆蛋白棟8g/L、10g/L、12g/L、14g/L，玉米漿13g/L、15g/L、17g/L、19g/L，共16瓶，培養(yǎng)24h取樣進行芽孢檢測。結果如表6所示。

表6　正交試驗菌體芽孢生成量 　 g/L

從結果可以看出，三個因素對菌體芽孢生成量影響的順序為：玉米漿＞大豆蛋白＞葡萄糖經過極差分析得出，有利于芽孢生成的因素組合：葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米漿17g/L。

3　結論

采用單因素的探究和正交試驗來對枯草芽孢桿菌進行搖瓶培養(yǎng)，通過稀釋平板法來測定發(fā)酵液中芽孢數。單因素研究從7種碳源和9種氮源中選取葡萄糖、大豆蛋白胨和玉米漿。正交試驗優(yōu)化后菌體芽孢最多的培養(yǎng)基為：葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米漿17g/L，NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L。在此條件下的重復實驗結果，24h菌體芽孢達到9.6×109個/mL。

［1］ 趙朋超，王建華，權春善，等.枯草芽孢桿菌抗菌肽生物合成的研究進展［J］.中國生物工程雜志，2010，30（10）：108-113.

［2］ 甄靜，郭直岳，謝寶恩，等.枯草芽孢桿菌XK-1產芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國農學通報，2012，28（27）：146-151.

［3］ 郭夏麗，狄源寧，王巖，等.枯草芽孢桿菌產芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國土壤與肥料，2012，（03）：99-103.

Study on Optimization of Spore Production in Fermentation Medium about Bacillus subtilis B53

Zhu Xiao-li，Yu Wei-wei

The carbon and nitrogen sources were optimized by single factor experiment under the condition of triangular flask culture.On the basis of the orthogonal experiment，the optimum fermentation medium of strain B53 was determined（glucose 25g/ L，soybean peptone 14g/L，corn syrup 17g/L，NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L）.Under the optimum conditions，the spore concentration was9.6×109/m L.

Bacillus subtilis；spore；fermentation medium；optimization

S816.3

A

1003-6490（2016）06-0105-02

2016-06-06

廣東輕工職業(yè)技術學院企業(yè)橫向項目（HX2011-002）。

朱曉立（1980—），男，河北唐山人，高級工程師，主要研究方向為為發(fā)酵工程。