白木香葉正丁醇部分指紋圖譜研究※

周海玲　馬麟　易智彪

（1廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，廣州510120；2廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，東莞523808）

白木香葉正丁醇部分指紋圖譜研究※

周海玲1馬麟1易智彪2*

（1廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，廣州510120；2廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，東莞523808）

目的建立白木香葉正丁醇部位HPLC指紋圖譜，并進行方法學考察，為白木香葉的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。方法采用HPLC分析方法，色譜柱為kromasil-C18，流動相：乙腈-0.3%磷酸緩沖鹽梯度洗脫，固定流速：0.8 mL/min；檢測波長：340 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。結(jié)果在10份檢測樣品中，標示出13個共有峰，構成白木香葉指紋圖譜。結(jié)論該方法準確可靠，所得指紋圖譜共有模式可作為白木香葉質(zhì)量控制的依據(jù)。

白木香葉；指紋圖譜；中藥化學

瑞香科常綠喬木白木香［Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg.］，被列為國家二級重點保護植物，是《瀕危野生植物種國際公約》中的保護樹種，是我國特有而珍貴的藥用植物［1-4］。白木香葉為白木香的非藥用部位，其相關研究還很少。本文通過采用高效液相色譜法研究不同產(chǎn)區(qū)白木香葉正丁醇提取部位的指紋圖譜，獲得其共有模式，為白木香葉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20A（UV/Vis）高效液相色譜儀（日本島津公司，包括：四元高壓梯度泵，在線真空脫氣機，DAD二級管陣列檢測器，LCsolution Ver 1.X色譜工作站）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A（國家藥典委員會）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS224S sartorius十萬分之一分析天平（鶴壁市鑫泰高科儀器制造有限公司）。

分析甲醇（天津富宇精細化工有限公司，批號120902）；色譜乙腈（德國merck公司，批號：1.00003.4004）；

1.2藥材白木香葉分別采集于廣東省不同地區(qū)，標號為S1～S10，采集時間均為2013年6月。

表1　白木香葉藥材來源

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液制備精密稱取芒果苷對照品12.7 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.254 mg/mL的芒果苷對照品溶液。封口膠密封后置于4℃冰箱內(nèi)，避光保存。

2.2供試品的制備精密稱取干燥的白木香葉粉末3 g，置于150 mL錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲30 min，冷卻后抽濾，濾液減壓濃縮至無醇味，依次用乙醚以及水飽和后的正丁醇按體積比1∶1各萃取3次，合并正丁醇萃取液，濃縮定容至25 mL，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3色譜條件色譜柱為kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.3%磷酸緩沖鹽梯度洗脫，固定流速：0.8 mL/min，柱溫：25℃；檢測波長：340 nm；進樣量：10 μL。

表2　梯度洗脫程序（%）

2.4方法學考察

2.4.1精密度實驗取S1供試品溶液1份，每次進樣10 μL，連續(xù)進樣5次，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間以及相對峰面積的RSD值均小于3%，說明該系統(tǒng)精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性實驗取S1供試品溶液1份，分別于0、3、6、9、12 h進樣測定，每次進樣10 μL，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間以及相對峰面積的RSD值均小于3%，說明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復性實驗精密稱取6份S1干燥白木香葉粉末各3 g，分別按2.3項操作，制備供試品溶液，每份供試品進樣10 μL，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間以及相對峰面積的RSD值均小于3%，說明本方法重復性良好。

2.5指紋圖譜建立取不同產(chǎn)地的白木香葉，按2.2項下方法制備供試品溶液，各取10 μL分別進樣，按2.3的色譜條件進行HPLC分析，建立指紋圖譜。以芒果苷為內(nèi)參比峰標示出白木香葉的HPLC指紋圖譜中13個共有峰作為構成指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰，同時將所得到的色譜圖數(shù)據(jù)導入指紋圖譜評價系統(tǒng)，進行色譜峰匹配，建立白木香葉指紋圖譜共有模式，并計算相似度。

3　討論

3.1洗脫程序的確定采用kromasil-C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸緩沖鹽為流動相進行梯度洗脫，固定流速為0.8 mL/min，進樣量10 μL。通過大量預實驗反復多次對流動相比例進行調(diào)整，最終確定洗脫程序見表2。

3.2緩沖鹽濃度的選擇結(jié)合文獻研究發(fā)現(xiàn)，采用磷酸緩沖鹽或高濃度的甲酸緩沖鹽可明顯改善白木香葉中各成分的分離洗脫效果［5-7］。但由于過高的酸度容易使緩沖鹽結(jié)晶析出，造成色譜柱的堵塞，從而影響實驗進程以及色譜柱壽命，故本實驗選用濃度為0.1%、0.3%、0.5%的磷酸緩沖鹽，考察緩沖鹽濃度對各成分分離效果的影響，確定最佳緩沖鹽比例為0.3%。

3.3色譜柱的選擇分別考察kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、Thermo-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱對3.1所確定洗脫程序的分離效果，結(jié)果顯示kromasil-C18色譜柱對目標峰分離效果較好。

3.4柱溫的選擇在確定上述色譜分析條件的基礎上，分別在25℃、28℃、30℃柱溫條件下對該洗脫程序的分離效果進行驗證。結(jié)果顯示25℃柱溫（室溫條件）已經(jīng)可以達到較好的分離效果，故后續(xù)試驗均選擇在室溫條件下進行。

3.5波長的選擇以及特征峰的確定在確定上述色譜分析條件的基礎上，采用DAD二級管陣列檢測器對不同波長下供試品溶液HPLC圖譜進行對比，根據(jù)實際情況綜合考慮選定出峰數(shù)較多，并且響應值較為均衡的波長作為最佳測定波長，并在該波長下標記13個響應值較大的峰作為特征峰，并將對照品峰進行標識，最終選擇340 nm波長作為測定波長。

3.6參照峰的選擇芒果苷是白木香葉中的一種特征成分，其對照品在各特征峰中峰面積所占比例最大，且響應值最為穩(wěn)定，故選擇芒果苷峰作為本指紋圖譜的參照峰。

3.7指紋圖譜的建立及相似度分析按上述色譜條件分別將10批供試品進樣分析，記錄色譜圖，并計算相對保留時間以及相對峰面積值，結(jié)果見表3及表4。

表3　10批白木香葉共有峰相對保留時間（%）

表4　10批白木香葉共有峰相對峰面積（%）

使用國家藥典委員會所提供的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對各批次白木香葉正丁醇部位HPLC指紋圖譜進行分析處理，得到各樣品HPLC色譜圖及能夠反映各樣品共性特征的白木香葉正丁醇部位指紋圖譜，見圖1。同時以生成的對照圖譜為對照計算各批次樣品的相似度均大于95%，說明各產(chǎn)地的藥材有較好的一致性，具體結(jié)果見表5。

圖1　白木香葉正丁醇部位指紋圖譜

表5　不同批次白木香葉正丁醇部位特征指紋圖譜進行相似度評價

3　結(jié)論

本研究前期通過大量的預實驗對指紋圖譜條件進行優(yōu)化探索，最終建立了白木香葉正丁醇部位HPLC特征指紋圖譜，通過對不同產(chǎn)地10批白木香葉藥材的正丁醇部位進行特征性測定，共標記13個共有峰，各批次樣品共有峰的相對保留時間RSD值都小于3%。相似度評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各批次藥材共有峰相似度均在0.95以上，表明在該色譜條件下，不同產(chǎn)地的10批藥材之間相似度良好，完全符合中藥特征性指紋圖譜的技術規(guī)范。因此，本實驗通過建立白木香葉正丁醇部位HPLC指紋圖譜，對白木香葉正丁醇部位各化學成分進行監(jiān)控，從而為后續(xù)抗炎物質(zhì)基礎的探討提供譜圖依據(jù)，同時也對白木香葉的質(zhì)量進行了初步研究。

［1］梅全喜，李漢超，汪科元，等.南藥沉香的藥用歷史與產(chǎn)地考證［J］.今日藥學，2011，21（1）：3-5.

［2］梅全喜，李漢超，汪科元.南藥中山沉香的產(chǎn)地考證與發(fā)展構想［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：2049-2051.

［3］朱曉光.嶺南本草古籍三種［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1999：73.

［4］黃海波，劉心純，樓步青.香港商品偽沉香鑒別研究［J］.廣東藥學，2002，12 （4）：5-7.

［5］聶春曉，宋月林，陳東，等.白木香葉化學成分的研究［J］.中國中藥雜志. 2009，34（7）：858-860.

［6］馮潔，楊秀偉.白木香葉化學成分的研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（2）：230-234.

［7］馮潔，楊秀偉.白木香葉脂溶性化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2011，36 （15）：2092-2095.

古醫(yī)籍中附子之區(qū)別

《本經(jīng)》言附子，即今《藥典》所收載之毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx的子根加工炮制品，拉丁名：Aconitilateralis Radix Praeparata.

《金匱要略》所載川烏，《本經(jīng)》所言是烏頭，則是《藥典》所載毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的母根加工炮制品，處方用名：“川烏”，拉丁名：Aconiti Radix.

《本經(jīng)》言天雄，即指現(xiàn)今臨床應用之“天雄”，系毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDobx.的塊根（既不是子根，也不是專指其母根），即不生子根的塊根加工品，毒性更強，其拉丁名：AconitiSingularis Radix.其功能與附子相類。

附子溫中之臨床解讀

《本經(jīng)》言“溫中”，是指治療中焦脾胃陽虛陰盛的方法。臨床癥見食不消化，嘔吐清水，大便清稀，舌淡苔白，脈沉細等?！爸小?，即中焦脾胃等，也包含溫腎，指其溫的作用在內(nèi)。常用方劑簡介如下。

附子理中丸（《太平惠民和劑局方》方）：附子、人參、干姜、炙甘草、白術各三兩，主治中焦虛寒之證。

腎氣丸（《金匱要略》方）：干地黃八兩，山藥四兩，山茱萸四兩，澤瀉三兩，茯苓三兩，牡丹皮三兩，桂枝（肉桂）、附子各一兩。功在“補腎助陽”，治療腎陽不足證。

——摘自祝之友《解讀神農(nóng)本草經(jīng)》

Study on Fingerprint of Butanol Extracts of Leaves of Aquilaria Sinensis（Lour）Gilg

ZHOU Hailing1，MA Lin1，YI Zhibiao2*
（1.Department of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicin，Guangzhou 510120，China；2.Institute of Mathematical Science and engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Dongguan 523808，China）

Objective To develop an HPLC fingerprint in the leaves of Aquilaria sinensis and carry out methodology investigation，and to provide a theoretical basis for the quality control of the leaves of Aquilaria sinensis.Methods By HPLC analysis method，it was carried out on a kromasil-C18 column with an isocratic elution at a flow rate of 0.8mL/min.The mobile phase was composed of acetonitrile and 0.3%H3PO4.The delection wavelength was 340 nm.The column temperature was 25℃.The sample volume was 10μL.Results In 10 samples，13 peaks existed，which composed of fingerprint of leaves of Aquilaria sinensis.Conclusion This method is accurate and reliable.The common pattern of the fingerprint can be used as the basis for quality control of Aquilaria sinensis.

leaves of Aquilaria sinensis（Lour）Gilg；fingerprint；chemistry of Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.18.058

1672-2779（2016）-18-0130-03

（本文編輯：李海燕本文校對：龔又明2016-06-14）

廣東省中醫(yī)藥管理局科研課題（No：20142074）；廣東省高新區(qū)發(fā)展專項（No：2012B011000050）

zhibiaoyi@163.com