蛋清酶水解工藝優(yōu)化及水解物對小鼠生理指標(biāo)的影響

霍永久， 占今舜， 金曉君， 趙國琦

（揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

蛋清酶水解工藝優(yōu)化及水解物對小鼠生理指標(biāo)的影響

霍永久， 占今舜， 金曉君， 趙國琦

（揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

通過正交試驗得出Neutrase蛋白酶水解蛋清的最佳條件，然后選取2月齡雄性小鼠40只，隨機分成4組，每組10只，連續(xù)灌喂蛋清水解物4周，檢測小鼠的血清生化指標(biāo)和肝臟抗氧化指標(biāo)。結(jié)果表明，酶水解的優(yōu)化條件為：溫度55℃、pH 6.0、酶量為5 g/dL、蛋清體積比為1∶5。在此條件下，水解物的蛋白質(zhì)殘留率為24.28%，水解度達3.71%。水解物的相對分子質(zhì)量大部分集中在1 000以下，其中180～300、300～500、500～1 000所占的比率分別為28.03%、41.84%、23.69%。N-6h組小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖和總膽固醇含量顯著低于對照組（P＜0.05）。N-3h組小鼠肝臟的T-SOD和GSH-PX活力顯著高于對照組（P＜0.05）；N-6h組小鼠肝臟的MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05）。綜上，蛋清水解物能夠改善小鼠生理功能，其中酶解3 h時的產(chǎn)物效果較好。

蛋清蛋白；酶水解；抗氧化；生化指標(biāo)

蛋清蛋白中含有豐富的蛋白質(zhì)和多種必需氨基酸，且氨基酸組成比例均衡，是人體吸收利用最高的一種蛋白質(zhì)。在食品行業(yè)，利用蛋黃生產(chǎn)卵磷脂、膽堿等活性物質(zhì)較多，而對蛋清的重視程度不夠，其常作為廢棄物被丟棄，因此亟需開展蛋清的綜合利用研究［1-3］。據(jù)報道，從蛋清中提取出的活性物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、抑制脂質(zhì)過氧化、清除自由基等功能［4-6］。國內(nèi)外已有利用蛋清蛋白肽液生產(chǎn)功能性飲料，如利用鵪鶉蛋清多肽制作保健飲料［7］。蛋清蛋白具有不耐熱、易凝固等特性，限制了其在食品加工中的應(yīng)用。然而，通過酶水解方法制作低分子化的蛋清降解蛋白質(zhì)，可以改善蛋清蛋白的功能性質(zhì)，拓寬其應(yīng)用范圍。Neutrase是由枯草芽孢桿菌深層發(fā)酵培養(yǎng)、經(jīng)提取精制而成的一種內(nèi)切蛋白酶，主要具備蛋白酶活性以及少量的酯酶活性，具有廣泛的特異性，對動植物蛋白質(zhì)、多肽、酯、酰胺等都有較強的酶解能力。目前，采用 Neutrase蛋白酶對杏仁、燕麥麩皮和骨膠原蛋白質(zhì)進行水解已有報道［8-10］。本課題研究中采用Neutrase蛋白酶酶解雞蛋清蛋白，對水解溫度、pH、酶用量及蛋清濃度幾個水解參數(shù)進行優(yōu)化，探索適宜的水解條件。另外，利用小鼠作為模型，研究蛋清水解物對小鼠生理指標(biāo)的影響，為進一步生產(chǎn)蛋清蛋白活性物質(zhì)和開發(fā)功能性飲料食品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1 酶水解蛋清蛋白的工藝流程 超市所購新鮮雞蛋 （洗凈，消毒）→分離蛋清和蛋黃→稀釋蛋清→95℃加熱變性20 min→調(diào)節(jié)pH→酶解反應(yīng)→終止酶解反應(yīng)

1.1.2 單因素試驗 在單因素試驗中分別研究酶解的溫度、pH、酶用量及蛋清濃度對水解雞蛋清蛋白反應(yīng)的影響，以水解度為指標(biāo)，確定適宜的酶解條件。

1.1.3 正交試驗 在Neutrase酶（由諾維信生物科技有限公司提供）水解雞蛋清蛋白單因素試驗的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)殘留率和水解度為考察指標(biāo)，對水解溫度、pH、Neutrase酶用量和蛋清體積比4個因素進行正交設(shè)計，以確定Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的最佳水解工藝參數(shù)，因素水平如表1所示。

表1 L9（3）4正交試驗設(shè)計Table1 L9（3）4orthogonal design

1.1.4 動物試驗設(shè)計 將揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供的2月齡雄性小鼠預(yù)飼4 d以適應(yīng)新環(huán)境 （自然光照，室內(nèi)溫度20～25℃，濕度（50±10）%。第5天早上8：00斷食，并于當(dāng)日11：00稱質(zhì)量，棄去體質(zhì)量超過平均體質(zhì)量±2.00 g范圍者，將小鼠分為4組（見表2），每組10只，每天自由采食、飲水。

表2 小鼠灌胃蛋清蛋白試驗分組Table2 Group design for gavage egg white protein

每天用灌胃針按表2進行灌喂，灌喂量為0.3 mL，連續(xù)灌喂4周，灌喂順序按照分組順序進行，以確保每天在同一時間給藥。每天加料、換水、定時通風(fēng)換氣，每兩天換一次墊料。

1.2 試驗指標(biāo)測定

1.2.1 水解度及蛋白質(zhì)殘留率 總氮含量由凱式半自動定氮儀測得，方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。

氨基氮含量由甲醛滴定法測得。準(zhǔn)確吸取試樣5 mL（氨基氮含量約1～5 mg）于小燒杯中，加5滴體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫，將燒杯置于磁力攪拌器上，pH計電極插入燒杯內(nèi)試樣中適當(dāng)位置，開動磁力攪拌器，先用0.1 mol/L HCl或NaOH將溶液pH調(diào)至8.5，保持1 min不變，然后慢慢注入預(yù)先調(diào)好的中性甲醛溶液10 mL，1 min后用NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定pH值8.5，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。計算公式如下：

上式中：ρTN為總氮質(zhì)量濃度，ρAN為氨基氮質(zhì)量濃度，均為mg/5 mL計量；wHD為水解度；wPR為蛋白質(zhì)殘留率；ρCN為離心沉淀物的含氮量。

1.2.2 蛋清蛋白水解物相對分子質(zhì)量分布檢測蛋白水解物相對分子質(zhì)量采用高效液相色譜法進行檢測。水解物溶液經(jīng)0.45 μm微孔過濾膜過濾后上TSK 2000型凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm），流動相為乙腈-水-三氟乙酸=45∶55∶0.01（體積比），柱溫為 30℃，體積流量為 0.5 mL/min，檢測波長為220 nm。以細(xì)胞色素C（MW12 500），桿菌酶（MW1450），乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451），乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）為標(biāo)準(zhǔn)品，測定水解物的相對分子質(zhì)量分布。

1.2.3 氨基酸分析 總氨基酸和游離氨基酸分析采用Agilen 1100型高效液相分析儀進行測定。樣品處理和檢測方法由揚州大學(xué)分析測試中心提供。高效液相色譜儀條件：C18柱4.0 mm×125 mm；柱溫40℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長338 nm和262 nm（Pro）；流動相A 20 mmol/L醋酸鈉液；流動相B 20 mmol/L醋酸鈉液；V（甲醇）∶V（乙腈）=1∶2∶2。

1.2.4 生化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的測定 試驗結(jié)束時，小鼠禁食12 h后摘除眼球取血，血液于室溫靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，吸取血清，-40℃保存待測。眼眶取血后立即采用頸椎脫臼法處死，取出肝臟并用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗，濾紙吸干表面水分后稱質(zhì)量，再用預(yù)冷的生理鹽水制成10 g/dL的肝臟勻漿，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液，-40℃保存待測。血清生化指標(biāo)由江蘇省蘇北醫(yī)院完成，肝臟抗氧化指標(biāo)根據(jù)南京建成生物工程有限公司提供的試劑盒說明書上方法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用軟件SPSS 15.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan法進行均值的多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溫度對 Neutrase酶水解蛋清蛋白的影響Neutrase酶解雞蛋清在pH 7.0，酶質(zhì)量濃度6 g/dL，蛋清體積比1∶4的條件下，溫度分別設(shè)為40、45、50、55、60、65℃進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，Neutrase蛋清蛋白酶解液的水解度呈顯著上升趨勢，當(dāng)溫度達到50℃，其水解度高于其它組，當(dāng)溫度再繼續(xù)升高時，水解度呈顯著下降，這可能是Neutrase在50℃以上的條件下已部分失活，導(dǎo)致水解度降低。

圖1 溫度對Neutrase酶水解蛋清蛋白的影響Fig.1 Effectoftemperature on Neutraseenzyme hydrolyzing egg white proteins

2.1.2 pH對 Neutrase酶水解蛋清蛋白的影響Neutrase酶解雞蛋清在溫度50℃，酶用量6 g/dL，蛋清體積比1∶4的條件下，pH分別設(shè)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖2所示，隨著pH值升高，水解度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)pH為6.0時，水解度最高，說明其為酶水解蛋清的最佳pH。當(dāng)pH過低或過高，均會抑制Neutrase酶的活性。

2.1.3 Neutrase酶用量對水解蛋清蛋白的影響Neutrase酶解雞蛋清在溫度50℃，pH 7.0，蛋清體積比1∶4的條件下，Neutrase酶用量分別設(shè)為3、4、5、6、7、8 g/dL進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖3所示，在一定范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加，Neutrase蛋清蛋白酶解液的水解度呈現(xiàn)增加的趨勢。當(dāng)酶用量超過5 g/dL時，各組之間的水解度差異不大，這是因為當(dāng)酶用量達一定水平時底物被酶所飽和，使得酶促反應(yīng)速率減慢，水解度不再增加。

圖2 pH對Neutrase酶水解蛋清蛋白的影響Fig.2 Effect of pH on Neutrase enzyme hydrolyzing egg white proteins

圖3 Neutrase酶質(zhì)量濃度對水解蛋清蛋白的影響Fig.3 Effect of Neutrase enzyme dosage on hydrolyzing egg white proteins

2.1.4 蛋清濃度對Neutrase酶水解蛋清蛋白的影響 Neutrase酶解雞蛋清在溫度50℃，pH 7.0，酶用量5 g/dL的條件下，蛋清體積比分別設(shè)為1∶3、1∶4、1∶5進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖4所示，隨著蛋清體積比的降低，Neutrase蛋清蛋白酶解液的水解度呈現(xiàn)出增加的趨勢，說明底物濃度越稀，增加了Neutrase蛋白酶與蛋清蛋白碰撞的機會，使得水解度增加。

圖4 蛋清體積比對Neutrase酶水解蛋清蛋白的影響Fig.4 Effect of concentration of egg white on Neutrase enzyme hydrolyzing egg white proteins

2.2 正交試驗結(jié)果

從表3和4可知，以蛋白質(zhì)殘留率為考察指標(biāo)，影響Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的主次因素依次為：pH＞酶用量＞蛋清體積比＞溫度。Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的最優(yōu)組合為A1B1C3D3，即溫度45℃、pH 6.0、酶量為5 g/dL、蛋清體積比為1∶5。以水解度為考察指標(biāo)，影響Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的主次因素依次為：蛋清濃度＞酶用量＞pH＞溫度。Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即溫度55℃、pH 6.0、酶量為5 g/dL、蛋清體積比為1∶5。綜合蛋白質(zhì)殘留率和水解度兩個考察指標(biāo)，盡可能降低蛋白質(zhì)殘留率即提高底物蛋清蛋白的利用率的同時，盡量提高水解度，確定Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的最佳水解工藝參數(shù)為：溫度55℃、pH 6.0、酶量為5 g/dL、蛋清體積比為1∶5。在此條件下，Neutrase酶水解雞蛋清蛋白的蛋白質(zhì)殘留率為24.28%，水解度達3.71%。

表3 以蛋白質(zhì)殘留率為考察指標(biāo)正交試驗L9（3）4結(jié)果Table3 Effect of L9（3）4orthogonal design

表4 以水解度為考察指標(biāo)正交試驗L9（3）4結(jié)果Table4 Effect of L9（3）4orthogonal design

2.3 Neutrase酶水解蛋清蛋白水解物相對分子質(zhì)量分布分析

由圖5和表5可知，Neutrase酶在溫度55℃、pH 6.0、酶量為5 g/dL、蛋清體積比為1∶5的條件下酶水解雞蛋清蛋白6 h，水解物的相對分子質(zhì)量大部分集中在1 000以下，即以2～8個氨基酸的短肽形式存在，其中180～300、300～500、500～1 000所占的比率分別為28.03%、41.84%、23.69%。

2.4 Neutrase酶水解蛋清蛋白水解物氨基酸分析

由表6可知，總游離氨基酸質(zhì)量濃度為0.886 3 mg/mL，占總氨基酸含量的4.32%，水解物中大部分是由2個以上氨基酸的肽形式存在。

圖5 酶解物相對分子質(zhì)量分布曲線Fig.5 Elution curve of zymolyte molecular weight

表5 酶解物相對分子質(zhì)量分布Table5 Distribution of zymolyte molecular weight

表6 酶水解物氨基酸分析Table6 Amino acid analysis of zymolyte

2.5 酶解物對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表7可知，N-3h和N-6h組小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量和葡萄糖濃度均顯著小于對照組和蛋清蛋白組（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著；N-6h組小鼠血清中的總膽固醇含量顯著低于對照組（P＜0.05），其中對照組含量最高。其他各項指標(biāo)各處理組之間差異不顯著。

2.6 酶解物對小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表8可知，N-3h組小鼠肝臟的T-SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著；對照組小鼠肝臟的GSH-PX活力顯著低于其他各組（P＜0.05），其中N-3h組最高；蛋清蛋白組和N-6h組小鼠肝臟的MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05），其中N-6h組最低。

表7 酶解物對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table7 Effect of zymolyte on blood biochemical indexes of mice

續(xù)表7

表8 酶解物對小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table8 Effect of zymolyte on liver anti-oxdiotant indexes of mice

3 討論

天然蛋清中存在抑制蛋白酶的物質(zhì)，酶解前通過加熱處理能降低或消除蛋清內(nèi)的蛋白酶抑制物質(zhì)，而且還能使變性后的蛋白質(zhì)暴露出更多的酶作用點，進而促進酶解反應(yīng)。然而，加熱處理需要采取適當(dāng)?shù)姆绞?，否則加熱過度會阻礙酶的水解作用。楊萬根等［11］研究蛋清酶解前的變性條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下變性獲得的去抑制效果顯著優(yōu)于酸性條件，且隨著溫度的升高，去抑制效果顯著增加，95℃時的去抑制作用尤為明顯。因此，本試驗中采用的熱處理條件為95℃，20 min。王昌濤等［8］發(fā)現(xiàn)Neutrase蛋白酶水解燕麥麩在條件為加酶量9 g/ dL、反應(yīng)時間 3 h、料水比1∶25（g/mL）、pH 7、溫度45℃時達最大值。安廣杰和徐清萍［9］發(fā)現(xiàn) Neutrase水解牛骨素制備明膠最佳工藝為溫度50℃、pH 5.5、加酶量2 g/dL、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%、水解時間3 h。王淑媛等［12］利用中性蛋白酶，在條件為pH 6.7～7，溫度45℃，時間4 h，料液比為1∶20（g/mL），水解濃縮玉米蛋白質(zhì)效果最好。另外，張祥奎和譚書明［13］的研究結(jié)果表明，酶法水解蛋清蛋白制備多肽的優(yōu)化水解工藝條件為加酶量0.8 g/dL，水解溫度55℃，時間5 h，pH 6.5。周利亙等［14］研究發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶水解制備蛋清蛋白肽的最佳工藝條件為底物溶液pH 7.0，加酶量5 000 U/g，水解溫度55℃，水解6 h。從以上可知，根據(jù)底物類型的不同，Neutrase酶解底物的最適溫度可能范圍為45～55℃，最佳pH范圍為5.5～7.5。在中性條件下，其將蛋白質(zhì)肽鍵分解為蛋白胨、多肽以及游離氨基酸，是一種廣泛應(yīng)用于食品、制藥、飼料、化妝品等行業(yè)的生物催化劑。本試驗中Neutrase酶在55℃，pH 6.0、酶量5 g/dL，蛋清體積比為1∶5的優(yōu)化條件下，酶解雞蛋清蛋白的蛋白質(zhì)殘留率為24.28%，即有一部分蛋白質(zhì)未能與Neutrase酶發(fā)生酶促反應(yīng)。

蛋清蛋白雖是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，但是直接食用會導(dǎo)致其利用率低和出現(xiàn)過敏反應(yīng)。然而，經(jīng)過酶解，蛋清蛋白分解成多肽，不僅改進了營養(yǎng)價值，易吸收和低致敏性，還能起到改善機體的免疫功能和提高抗氧化功能等作用［15-16］。遲玉杰等［17］研究發(fā)現(xiàn)，蛋清蛋白肽相對分子質(zhì)量越小，其抗氧化活性越強。蛋清蛋白肽通過作為氫供體、自由基穩(wěn)定劑及以螯合金屬離子的方式來抑制過氧化作用。另外，隨著蛋清肽濃度增大，抗氧化性增大［18-19］。研究表明，給小鼠飼喂蛋清蛋白水解物能夠增強血漿的自由基清除，提高血清中GSH-PX活性，降低血清中MDA含量［5，20］。本試驗中，利用Neutrase酶解雞蛋清3 h和 6 h的產(chǎn)物能夠提高小鼠肝臟 T-SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量，結(jié)果與其一致，說明蛋清酶解物具有提高小鼠肝臟的抗氧化能力。另外，酶解3 h的蛋清產(chǎn)物肝臟T-SOD和GSH-PX活性均高于酶解6 h的產(chǎn)物，表明酶解時間不同，其產(chǎn)物不同，導(dǎo)致其作用不同。谷丙轉(zhuǎn)氨酶是一種轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中。當(dāng)肝細(xì)胞或某些組織損傷或壞死，均會導(dǎo)致血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高。從本試驗結(jié)果看，蛋清酶解物可以降低血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力，說明其對肝臟等組織具有保護作用。體內(nèi)的組織、細(xì)胞活動所需的能量主要來自于葡萄糖，當(dāng)血液中葡萄糖含量降低，會提高動物的采食量。在本試驗中，蛋清酶解物降低血糖的含量，說明其能夠提高小鼠采食量，促進生長。王瑩等［21］研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解蛋清后的蛋清肽能降低血清尿素氮的含量，但差異不顯著。本試驗結(jié)果與其不同，可能是因為不同酶解蛋清所得蛋清肽不同所致。膽固醇具有形成膽酸、合成激素和構(gòu)成細(xì)胞膜的作用，但當(dāng)其過量時會導(dǎo)致動脈粥樣硬化、形成靜脈血栓等。在本試驗中，蛋清酶解物能夠顯著降低血清總膽固醇的含量，降低甘油三酯的含量。說明蛋清酶解物具有預(yù)防心腦血管疾病的作用。

4 結(jié)語

Neutrase酶解蛋清蛋白的優(yōu)化條件為：

溫度55℃、pH 6.0、加酶量為5 g/dL、蛋清體積比為1∶5。另外，蛋清水解物能夠改善小鼠血清的生化指標(biāo)，提高其抗氧化功能，其中酶解3 h時的產(chǎn)物效果比較好。

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Study on the Optimal Hydrolysis Condition of Egg White and Effect of Protein Hydrolysate on Physiological Indexes of Mice

HUO Yongjiu， ZHAN Jinshun， JIN Xiaojun， ZHAO Guoqi
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

To obtain the optimal hydrolysis condition of egg white by Neutrase enzyme，forty 2-month male mice were divided into 4 groups，control group，egg white protein group，N-6h group and N-3h group，respectively.The mice were injected with 0.3mL egg white peptide by gavage.The serum biochemical indexes and liver anti-oxidase vitality were measured after four weeks.The results showed that the optimal hydrolysis technology of were as follows，temperature at 55℃，pH 6.0，5%of enzyme dosage and concentration of egg white for 1∶5.Under this condition，the residual rate and hydrolyzing degree of protein were 24.28%and 3.71%，respectively.The molecular weight of hydrolysate were mainly less than 1 000，the percentage of 180～300，300～500 and 500～1000 were 28.03%，41.84%and 23.69%，respectively.The serum glutamic-pyruvic transaminase，glucose，total cholesterol content of mice and the liver MDA content in N-6h group were lower and the liver T-SOD and GSH-PX vitality of mice in N-3h group were higher as compared to the control group （P＜0.05）.In conclusion，the hydrolysate of egg white could improve physiological function of mice，and the effect of 3h enzymolysis product was better.

egg white protein，enzyme hydrolysis，anti-oxidation，biochemical index

TS 253

A

1673—1689（2016）08—0855—09

2015-03-09

江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工作資助項目（PAPD）。

霍永久（1971—），男，江蘇東海人，農(nóng)學(xué)博士，副教授，主要從事豬營養(yǎng)、生產(chǎn)與環(huán)境研究。E-mail：huoyj@126.com