羥基磷灰石/殼聚糖/當(dāng)歸多糖微球制備及性能

楊晨光，王小春，王克益，趙磊（Yang Chenguang， Wang Xiaochun， Wang Keyi， Zhao Lei）

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羥基磷灰石/殼聚糖/當(dāng)歸多糖微球制備及性能

楊晨光，王小春，王克益，趙磊
（Yang Chenguang， Wang Xiaochun， Wang Keyi， Zhao Lei）

以羥基磷灰石和殼聚糖為支架，當(dāng)歸多糖作為釋放藥物，構(gòu)建一種新型促進(jìn)造血緩釋微球，作為填充骨缺損的生物材料。利用四水合硝酸鈣及磷酸，以氨水為沉淀劑，共沉淀法制備羥基磷灰石，水提醇沉法提取當(dāng)歸多糖。采用W/O型反相乳化交聯(lián)法制備羥基磷灰石復(fù)合微球，在不同轉(zhuǎn)速下交聯(lián)攪拌，通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)其載藥量和包埋率及多糖的得率。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)速500r/min下的微球，粒徑在52um左右，形狀最佳。其載藥量為32.9%，包埋率為74.4%，可用作骨缺損修復(fù)，骨內(nèi)造血的研究。

羥基磷灰石；殼聚糖；當(dāng)歸多糖；緩釋微球

羥基磷灰石（hydroxyapatite）是人體和絕大部分動(dòng)物骨、牙齒等組織的主要無(wú)機(jī)成分，由于其良好的生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度，在生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。共沉淀法作為其主要合成方法，流程簡(jiǎn)單，成本低廉，粒徑較小等優(yōu)點(diǎn)［1-3］。當(dāng)歸是當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（oliv.）Diels的干燥根，主要生產(chǎn)在中國(guó)甘肅省岷縣，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便等功效［4］。多年研究表明，當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸補(bǔ)血活血的有效成分［5-6］。

1 、材料與方法

1.1 試劑和儀器

四水合硝酸鈣，磷酸，氨水，液狀石蠟，司班80，戊二醛，氯仿，乙醇，殼聚糖，當(dāng)歸藥材粉。RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；B-220恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；AB104-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-9200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 羥基磷灰石的制備

按照摩爾比Ca：P=1.67的比例，配置Ca（NO3） 4H2O和H3PO4兩種溶液混合均勻，逐滴加入氨水沉淀，直到pH=10，靜置24小時(shí)，抽濾用蒸餾水洗滌至中性，100℃烘干12小時(shí)。用研缽磨粉備用。

1.2.2 當(dāng)歸多糖的制備

取當(dāng)歸粉100g，用1000ml80%乙醇在80℃下回流提取2次，每次2小時(shí)；藥渣過(guò)濾經(jīng)烘干后，加入10倍體積蒸餾水回流提取2次，每次2小時(shí)；抽濾，合并濾液并濃縮，濃縮液中加入3倍體積95%乙醇，靜置24小時(shí)，抽濾出沉淀，依次用丙酮，無(wú)水乙醇洗滌，得當(dāng)歸多糖粗品。將多糖粗品用50ml蒸餾水溶解，加入正丁醇：氯仿（1：4）混合溶液，劇烈震搖10min離心，分離水層與油層交界處的變形蛋白，重復(fù)3次；收集上層多糖溶液，加入95%乙醇沉淀，過(guò)濾得到沉淀物，干燥得多糖。

1.2.3 羥基磷灰石/殼聚糖/當(dāng)歸多糖微球制備

向100ml2%乙酸溶液中加入3g殼聚糖，完全溶解后加入3g當(dāng)歸多糖和3g羥基磷灰石，混勻后傾倒入300ml液狀石蠟中。攪拌60min后加入10ml司班80高速攪拌乳化。乳化穩(wěn)定后加入10ml25%戊二醛在50℃下交聯(lián)10小時(shí)。抽濾得到的懸濁液，用氯仿和無(wú)水乙醇依次洗滌，在50℃干燥復(fù)合微球［7］。重復(fù)三次，每次交聯(lián)的攪拌速度分別調(diào)整在300，400，500r/min。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別精密稱(chēng)取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL容量瓶中，加水至1mL，然后分別加入5 %苯酚溶液1mL，濃硫酸5mL，振搖均勻，100℃水浴鍋中保溫20min，取出后冷卻至室溫，同時(shí)做一空白對(duì)照，于490nm處測(cè)定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程。

1.2.5 載藥量和包埋率測(cè)定

取微球0.1g，充分研碎后，用生理鹽水定容至100ml，浸泡24小時(shí)，取上清液3ml，測(cè)其在490nm下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出藥物濃度，算出載藥量和包埋率。

載藥量是藥物在微球中的含量

（式中x 為多糖濃度，D為載藥量）

包埋率是包封進(jìn)去的藥量和投入的藥量的比值

（式中y為微球質(zhì)量，M為投入多糖量）

2 、結(jié)果與分析

如圖1所示，制得羥基磷灰石粉末，接近納米級(jí)，顆粒較細(xì)。氨水作為沉淀劑，應(yīng)逐滴加入，使反應(yīng)充分；調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值時(shí)，需充分?jǐn)嚢?，確保pH穩(wěn)定10。圖2交聯(lián)攪拌速度為300r/min，微球的平均粒徑為370um，大部分粒徑太大，不作為使用對(duì)象。圖3攪拌速度為400r/min，微球的平均粒徑為263um，形狀大小仍不夠均一。圖4攪拌速度為500r/min，平均粒徑52um，普遍顆粒較小，圓潤(rùn)，色澤透明，可用于實(shí)驗(yàn)。三種材料溶解的時(shí)候要確保完全溶解，并且乳化和交聯(lián)的溫度要始終保持50℃，否則不會(huì)成球。攪拌速度過(guò)小，微球粒徑大，也不易成型。攪拌速度過(guò)大，混合液黏稠，會(huì)引起液滴飛濺，影響微球得率。用氯仿，無(wú)水乙醇洗滌微球時(shí)，保證微球無(wú)滑手感，無(wú)液狀石蠟等有機(jī)溶劑殘留。

圖1：羥基磷灰石粉末；圖2，3，4：攪拌速度300， 400， 500 r/min下的微球顯微圖片

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖5所示，當(dāng)歸多糖提取率經(jīng)計(jì)算得2.73%；表1表明，攪拌速度500r/min的載藥量為32.9%，包埋率為74.4%，比其他攪拌速度下的效果更好。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表1 不同攪拌轉(zhuǎn)速下微球的載藥量和包埋率

3 、 結(jié)論

羥基磷灰石/殼聚糖/當(dāng)歸多糖復(fù)合微球通過(guò)反相乳化交聯(lián)法，在交聯(lián)攪拌速度達(dá)到500r/min下能夠制備出均勻圓球狀，粒徑較小的微球。其載藥量為32.9%，包埋率為74.4%，可用作骨缺損修復(fù)的研究。

［1］石和彬，鐘宏，劉羽，田興，顧金燕，楊昌盛. 共沉淀法制備納米羥基磷灰石［J］. 化學(xué)與生物工程，2012，08：16-20.

［2］門(mén)智新，孫奉?yuàn)?，何? 沉淀法制備羥基磷灰石反應(yīng)條件控制研究［J］. 無(wú)機(jī)鹽工業(yè)，2011，01：27-29.

［3］楊輝，李歡.多孔羥基磷灰石中空微球制備及緩釋性能［J］. 人工晶體學(xué)報(bào)，2013，11：2412-2417.

［4］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，I部［S］.北京：北京化學(xué)工業(yè)出版社，1995：109.

［5］ 王亞平，祝彼得. 當(dāng)歸多糖藥理研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1991，11（4）：61.

［6］ 石清照，汪暉，徐之良，等. 當(dāng)歸多糖對(duì)免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠骨髓細(xì)胞周期蛋白D2表達(dá)的影響［J］. 兒科藥學(xué)雜志. 2005，1（1），1.

［7］ 李湘南，陳曉明，彭志明，李世普. 納米羥基磷灰石/殼聚糖載藥微球的制備及性能［J］. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，05：1232-1237.

hydroxyapatite and chitosan as drug scaffold， angelica polysaccharide， which promotes hematopoiesis， as releasing the drug， construct a new release microspheres for bone defects as a filler biomaterial. Use calcium nitrate tetrahydrate and phosphoric acid， ammonia as the precipitating agent， prepare thydroxyapatite by coprecipitation， and Angelica polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation method. Prepared hydroxyapatite composite microspheres by using a W/O emulsion inverted crosslinked， stiring at different speeds， measured the absorbance for drug loading and encapsulation efficiency and yield of the polysaccharide by UV spectrophotometry. The results showed that the microspheres at the speed of 500r / min， the diameter is about 52um， the best shape. Its drug loading was 32.9%， embedding was 74.4%， which can be used to repair bone defects and bone study hematopoiesis.

hydroxyapatite； chitosan； Angelica polysaccharide； release microspheres