山豆根多糖對(duì)感染PRRSV小鼠脾臟細(xì)胞因子水平的影響

李　飛，韋英益，楊　劍，陸晶瑩，譚紅連，胡庭俊

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

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山豆根多糖對(duì)感染PRRSV小鼠脾臟細(xì)胞因子水平的影響

李飛，韋英益，楊劍，陸晶瑩，譚紅連，胡庭俊*

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

探討山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響。將 70只昆明種小鼠隨機(jī)分為7組(A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組)，每組10只，雌雄各半，依據(jù)前期已經(jīng)建立氧化應(yīng)激模型的感染條件，D組、E組、F組、G組小鼠于試驗(yàn)第 1、2、3天分別采用口服、滴鼻和腹腔注射3種途徑聯(lián)合感染PRRSV病毒原液1.0 mL/只，A組、B組、C組給予生理鹽水1.0 mL/只。第 4、5、6天，A、D組小鼠分別腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/10 g。B組小鼠腹腔注射5.0 mg/kg的脂多糖(LPS)溶液，C組、E組、F組、G組小鼠分別腹腔注射不同劑量的山豆根多糖(200、50、100、200 mg/kg)。供試小鼠均于第14天處死，并取其脾臟制備勻漿。采用ELISA檢測(cè)脾勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1等細(xì)胞因子的水平。結(jié)果顯示，PRRSV感染小鼠后能升高小鼠脾臟勻漿內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平，50 mg/kg～100 mg/kg劑量的山豆根多糖能降低上述細(xì)胞因子的水平。結(jié)果表明，山豆根多糖能有效降低PRRSV感染小鼠脾臟細(xì)胞因子的水平。

山豆根多糖；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；小鼠；細(xì)胞因子

氧化應(yīng)激是病毒感染引起的病理過程中非常重要的一環(huán)。病毒感染常導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，病毒感染不僅可以引起活性氧自由基釋放；同時(shí)也導(dǎo)致產(chǎn)生過量的促炎細(xì)胞因子[1]。有大量研究證實(shí)，PRRSV感染免疫細(xì)胞后可使免疫細(xì)胞分泌高水平的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1[2-3]。同時(shí)，氧化應(yīng)激可以通過不同的機(jī)制來增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生很可能會(huì)進(jìn)一步增加氧化應(yīng)激水平，從而形成了一個(gè)惡性循環(huán)。前期研究表明多糖類藥物可從多方面對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而提高機(jī)體免疫力，還能提高機(jī)體抗炎、抗氧化能力[4]。本文在前期建立的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染小鼠脾淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激病理模型基礎(chǔ)上[5]，進(jìn)行山豆根多糖(Sophorasubprostratepolysaccharide,SSP)對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的研究，旨在探討病毒感染免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激與中藥活性多糖對(duì)PRRSV感染免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物山豆根多糖(SSP)，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室采用水提醇沉法提取并精制得到，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)得總糖含量為88.48%。

1.1.2病毒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PRRSV-GXA株毒株，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)藥理實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)Marc-145細(xì)胞增殖后測(cè)得病毒滴度為10-5.6TCID50/0.1 mL；非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(Marc-145) ，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室保存；昆明系小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重20 g±2 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3主要儀器和試劑Multimode Plate Reader多功能酶標(biāo)儀，Perkin Elmer公司產(chǎn)品；JY92-ⅡD細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒，深圳欣博盛生物科技有限公司產(chǎn)品；脂多糖(LPS)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1PRRSV感染昆明系小鼠、給藥方案及樣品采集時(shí)間將 70只昆明系小鼠隨機(jī)分為 7組(A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組)，每組 10 只，雌雄各半，根據(jù)本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果選擇建立氧化應(yīng)激病理模型的感染方案及最佳感染時(shí)間，D組、E組、F組、G組小鼠于試驗(yàn)第 1、2、3天分別采用口服、滴鼻和腹腔注射3種途徑聯(lián)合感染PRRSV病毒原液 1.0 mL/只，A組、B組、C組給予生理鹽水1.0 mL/只。第 4、5、6天，A組、D 組小鼠分別腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/10 g,B組小鼠腹腔注射5.0 mg/kg的LPS(脂多糖)溶液[6-8]， C組、E組、F組、G組小鼠分別腹腔注射不同劑量的山豆根多糖(200、50、100、200 mg/kg)[9]，具體處理如表1所示。PRRSV感染前停食12 h，停水6 h，感染后按常規(guī)飼養(yǎng)，于感染后第14天處死進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

表1　試驗(yàn)小鼠的分組及處理

1.2.2樣品處理每組10只小鼠脾臟分離后，滅菌生理鹽水洗凈表面血漬，用濾紙吸干液體，準(zhǔn)確稱取各樣品重量，按脾臟重(g)∶滅菌生理鹽水(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，制備100 g/L組織勻漿。5 000 r/min離心10 min，取上清分裝，保存于-80℃，以備ELISA檢測(cè)小鼠脾臟勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1水平，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.2.3統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan組間比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。#表示與病毒對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2　結(jié)果

2.1山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α水平的影響

PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可明顯升高細(xì)胞分泌TNF-α水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。用不同濃度山豆根多糖處理后，50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖能明顯降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，但是200 mg/kg的山豆根多糖能顯著升高PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α水平，與病毒對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且200 mg/kg的山豆根多糖能明顯升高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)(表2)。結(jié)果表明50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可以明顯降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α水平。

2.2山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-1β水平的影響

PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d對(duì)細(xì)胞分泌IL-1β水平無顯著影響，與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。用不同濃度山豆根多糖處理后，100 mg/kg山豆根多糖能顯著降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-1β水平，與病毒對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)(表2)。結(jié)果表明,100 mg/kg山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可以顯著降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-1β水平。

2.3山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6水平的影響

PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可在一定程度上升高細(xì)胞分泌IL-6水平，但與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。用不同濃度山豆根多糖處理后，50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖能明顯降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。200 mg/kg的山豆根多糖在一定程度上能升高PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6水平，但與病毒對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，且200 mg/kg的山豆根多糖在一定程度上也能升高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)(表2)。結(jié)果表明50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可以明顯降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6水平。

表2　山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與病毒對(duì)照組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05，**P<0.01；Compared with virus control group，#P<0.05，##P<0.01.

2.4山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-8水平的影響

PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可在一定程度上升高細(xì)胞分泌IL-8水平，但與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。用不同濃度山豆根多糖處理后，50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖能明顯降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-8水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。200 mg/kg的山豆根多糖在一定程度上能升高PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-8水平，但與病毒對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，且200 mg/kg的山豆根多糖在一定程度上也能升高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-8水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P>0.05)(表2)。結(jié)果表明50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可以明顯降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-8水平。

2.5山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10水平的影響

PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可明顯升高細(xì)胞分泌IL-10水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。用不同濃度山豆根多糖處理后，50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖能明顯降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，但是200 mg/kg的山豆根多糖能明顯升高PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，且200 mg/kg的山豆根多糖能明顯升高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)(表2)。結(jié)果表明50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可以明顯降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10水平。

2.6山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌MCP-1水平的影響

PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可明顯升高細(xì)胞分泌MCP-1水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。用不同濃度山豆根多糖處理后，50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖能明顯降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌MCP-1水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，但是200 mg/kg的山豆根多糖能明顯升高PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌MCP-1水平，與病毒對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，且200 mg/kg的山豆根多糖能明顯升高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌MCP-1水平，與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)(表2)。結(jié)果表明50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d可以明顯降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌MCP-1水平。

3　討論

豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)生過程中，氧化應(yīng)激和一些炎性細(xì)胞因子之間有著緊密的聯(lián)系，氧化應(yīng)激水平的增加促進(jìn)了炎性細(xì)胞因子分泌可能是豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制之一[10-11]。本研究PRRSV感染小鼠14 d極顯著升高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10、MCP-1水平，用不同濃度山豆根多糖處理后，50 mg/kg和100 mg/kg的山豆根多糖能極顯著降低PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1水平。表明一定濃度的山豆根多糖通過抑制PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因水平達(dá)到干預(yù)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激的目的。

天然多糖具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)并表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等多種功能活性[12-13]。多糖能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的增殖活性，調(diào)節(jié)NO、H2O2等活性因子的產(chǎn)生，以及MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10等細(xì)胞因子的釋放，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能[14]。本研究依據(jù)課題組前期成功建立的PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激病理模型，采用不同濃度的山豆根多糖對(duì)PRRSV感染小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 mg/kg～100 mg/kg的山豆根多糖作用PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞14 d，可以有效降低小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平。提示山豆根多糖通過降低炎性因子的水平有效干預(yù)PRRSV感染小鼠脾淋巴細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

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Effect of Sophora subprostrate Polysaccharide on Cytokine Secretion Levels in Spleen of Mice Infected with Porcinere Productive and Respiratory Syndrome Virus

LI Fei,WEI Ying-yi,YANG Jian,LU Jing-ying,TAN Hong-lian,HU Ting-jun

(College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi，530005，China)

To investigate the effect ofSophorasubprostratepolysaccharide(SSP)on the cytokine secretion level in splenic lymphocytes of mice infected with PRRSV,Kunming mice were set as target animals and 70 mice were divided into 7 groups randomly (A,B,C,D,E,F and G groups),ten mice each group with half male and half female.According to our preliminary experimental conditions for establishing the oxidative stress model,the animals in groups of D,E,F and G were treated with 1.0 mL virus stock by three ways of oral,intranasal adminstration and intraperitoneal injection on the day 1,day 2 and day 3.The animals in groups of A,B and C were treated with 1.0 mL of normal saline.The mice in groups of A and D were intraperitoneally injected with normal saline at 0.2 mL per 10 g body weight on day 4,day 5 and day 6.The animals in group B were treated with lipopolysaccharide(LPS) at dose of 5.0 mg/kg body weight by intraperitoneal injection on day 4,day 5 and day 6.The animals in groups of C,E,F and G were treated with SSP at doses of 200,50,100,200 mg/kg body weight respectively on day 4,day 5 and day 6.On day 14,the animals were sacrificed and homogenates of murine spleen were prepared using physiological saline.ELISA method was used to determine the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1 in the supernatant of homogenates.The levels of TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1 significantly increased in the animals infected with PRRSV,SSP treatments at doses of 50 mg/kg and 100 mg/kg body weight significantly decreased above cytokines in the infected mice on day 14 post infection.SSP played an important role in anti-inflammation and anti-viral infection in PRRSV infected mice.

Sophorasubprostratepolysaccharide;Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;mouse;cytokine

2016-01-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260619)

李飛(1988-)，男，河南南陽人，碩士研究生，主要從事中藥免疫藥理學(xué)研究。*通訊作者

S852.23

A

1007-5038(2016)09-0038-05