陜西榆林某羊場(chǎng)羊口瘡病毒的分離鑒定

周　銘，岳進(jìn)華，劉鶴媛，高　洋，李雯麗，楊啟明，陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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陜西榆林某羊場(chǎng)羊口瘡病毒的分離鑒定

周銘，岳進(jìn)華，劉鶴媛，高洋，李雯麗，楊啟明，陳德坤*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為獲得陜西榆林地區(qū)羊口瘡病毒野毒株，以榆林地區(qū)某羊場(chǎng)疑似羊口瘡(Orf)的山羊口唇部結(jié)痂為材料，將結(jié)痂研磨懸液接種于犢牛睪丸原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過(guò)特征性細(xì)胞病變(CPE)觀察、PCR檢測(cè)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等對(duì)分離的毒株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)研磨的病料懸液接種于犢牛睪丸原代細(xì)胞后，盲傳至第4代時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞病變，測(cè)得病毒滴度為107.66TCID50/mL。對(duì)分離毒株的B2L基因克隆測(cè)序、同源性對(duì)比分析結(jié)果顯示，該毒株與與國(guó)內(nèi)報(bào)道的多株羊口瘡毒株核苷酸序列均具有較高的同源性，其中與甘肅株( KC485343.1)福建株( KC568399.1)的同源性均達(dá)到99%。用純化病毒液劃痕接種2月齡羔羊后，在其唇部和腹股溝內(nèi)側(cè)出現(xiàn)丘疹和膿皰等ORFV感染的典型的羊口瘡癥狀。表明成功獲得了羊口瘡病毒陜西榆林株。

羊口瘡病毒；分離鑒定；聚合酶鏈反應(yīng)；動(dòng)物回歸試驗(yàn)

羊口瘡 (Orf )又稱(chēng)接觸傳染性膿皰病(Contagious ecthyma)，是由羊口瘡病毒(Orf virus)引起的一種接觸性傳染病，以在山羊和綿羊的鼻、口唇、舌、乳房等部位形成紅色丘疹、水皰、膿皰為主要發(fā)病特征[1]。該病對(duì)羔羊危害最為嚴(yán)重，在舍飼高密度飼養(yǎng)條件下通常導(dǎo)致群體性感染，羔羊病死率較高[2]。羊口瘡在世界各地均有發(fā)生，很多國(guó)家和地區(qū)均有過(guò)報(bào)道[3]。近年來(lái)，我國(guó)陜北地區(qū)羊口瘡頻頻發(fā)生，在陜西榆林地區(qū)某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，正常羊群羊口瘡檢出率高達(dá)70%，其中1月齡左右羔羊發(fā)病率達(dá)90%，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為此，本研究從榆林橫山縣某羊場(chǎng)采集疑似羊口瘡病例山羊唇部結(jié)痂，對(duì)病料樣品進(jìn)行羊口瘡病毒的分離鑒定，以期為羊口瘡的臨床診斷和安全高效的疫苗研制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采自陜西榆林橫山縣某白絨山羊養(yǎng)殖場(chǎng)中3月齡～5月齡的發(fā)病山羊，對(duì)具有典型羊口瘡臨床癥狀的發(fā)病山羊的唇部結(jié)痂進(jìn)行采集。

1.1.2試驗(yàn)用動(dòng)物1月齡健康羔羊，來(lái)自陜西千陽(yáng)縣奶山羊種羊場(chǎng)。

1.1.3細(xì)胞株和菌株本實(shí)驗(yàn)室制備保存的犢牛睪丸原代細(xì)胞；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要試劑胎牛血清、M199培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；胰酶、二甲基亞砜，Amresco公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)相關(guān)試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶、pEGM-T 載體、DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒和SanPrep柱式 DNA 凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病料采集與處理采集有典型羊口瘡臨床癥狀山羊唇部的結(jié)痂塊，置于15 mL離心管中，按結(jié)痂質(zhì)量與PBS體積比1∶2加入PBS(含10 mg/mL青霉素、鏈霉素)，于4℃放置過(guò)夜使結(jié)痂松軟，充分研磨后，2 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，無(wú)菌收集濾液，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2羊口瘡病毒分離待培養(yǎng)的犢牛睪丸原代細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞瓶底約70%～80%時(shí)，棄去細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，接種600 μL處理好的病毒液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中1.5 h后，棄去瓶?jī)?nèi)液體，加入維持液(含50 mL/L犢牛血清的M199培養(yǎng)基)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后收集病毒培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，為第1代無(wú)菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物。取600 μL第1代無(wú)菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物接種犢牛睪丸細(xì)胞，按照第1代細(xì)胞培養(yǎng)物制備方法，制備第2代無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)物。依此方法盲傳至第4代時(shí)，待70%細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變時(shí)，收集培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，收集凍融物，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3病理組織切片的制備采集病羊的口唇部病變皮膚并于40 g/L的多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm厚的連續(xù)切片，HE染色檢查。

1.2.4PCR鑒定采用NaI法提取能使?fàn)倥２G丸原代細(xì)胞產(chǎn)生病變的細(xì)胞毒基因組DNA，選羊口瘡病毒特異性基因B2L，參照登錄號(hào)為JN565696.1的羊口瘡病毒基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為dNTP Mixture 2 μL，10×buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，TaqDNA polymerase 0.25 μL，P1、P2各1 μL，提取的病毒DNA模板 1 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 35 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min。取20 μL PCR產(chǎn)物在20 g/L瓊脂凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化回收，將PCR純化產(chǎn)物送南京金斯瑞生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上已公布的參考序列進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5病毒滴度測(cè)定在96孔板上培養(yǎng)犢牛睪丸原代細(xì)胞至各孔細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，將病毒液連續(xù)10倍稀釋分別接種于96孔板中，每孔接種100 μL，每個(gè)稀釋度接種1列，11、12列為空白對(duì)照。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench氏法計(jì)算病毒TCID50值。

1.2.6動(dòng)物回歸試驗(yàn)將第5代羊口瘡病毒液分別劃痕接種于健康1月齡的羔羊的唇部和腹股溝，陰性對(duì)照組用生理鹽水以同樣的方法接種羔羊，試驗(yàn)組與對(duì)照組隔離飼養(yǎng)，每天觀察發(fā)病癥狀。

2　結(jié)果

2.1羊口瘡患病羊痂皮組織病理學(xué)觀察

對(duì)臨床患病羔羊嘴部痂皮組織制作石蠟切片，HE染色后，于顯微鏡下可觀察到表皮層破潰壞死，病變皮膚復(fù)層扁平上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性，基層下的結(jié)締組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞和大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

箭頭指示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

Arrow denotes infiltration of inflammatory cells

圖1感染羊口瘡病毒病羊唇部皮膚病理切片(HE)

Fig.1Histopathologic slices of labial skin in dairy goat infection with Orf virus(HE)

2.2分離病毒引起的細(xì)胞特征性病變

接種盲傳至第4代的羊口瘡病毒液72 h后，犢牛睪丸原代細(xì)胞產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變。病變細(xì)胞出現(xiàn)折光性增強(qiáng)、變圓、聚堆、拉網(wǎng)等現(xiàn)象(圖2)，后期犢牛睪丸原代細(xì)胞發(fā)生皺縮、脫落；而正常對(duì)照的犢牛睪丸原代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈梭型緊密排列(圖3)。

2.3分離毒株的PCR檢測(cè)

用編碼羊口瘡病毒表面囊膜蛋白的保守基因B2L，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)第5代細(xì)胞傳代病毒液中的羊口瘡病毒，獲得了與預(yù)期片段大小相同的目的基因片段。本試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，羊口瘡病毒分離株的B2L基因與GenBank上公布的甘肅株、福建株等的相似度為99%，確定擴(kuò)增的片段為羊口瘡病毒的基因片段。

圖2　接種病毒液72 h發(fā)生細(xì)胞病變的犢牛睪丸細(xì)胞Fig.2　Cattle testicular primitive cells with cytopathic effect 72 h after Orf virus inoulation at

圖3　培養(yǎng)72 h的正常犢牛睪丸原代細(xì)胞(10×)Fig.3　Normal cattle testicular primitive cells at 71 h(10×)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 700;1～2.B2L基因PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 700;1-2. PCR products of B2L gene

圖4羊口瘡病毒B2L基因 PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.4Electrophoresis of PCR products of Orf virus B2L gene

2.4病毒滴度測(cè)定結(jié)果

選取能引起犢牛睪丸原代細(xì)胞產(chǎn)生典型羊口瘡病變的第5代病毒液，按10-1～10-9稀釋度進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⒉煌♂尪鹊牟《疽航臃N到犢牛睪丸原代細(xì)胞上，測(cè)定TCID50。按Reed-Muench法，測(cè)得榆林分離株第5代病毒滴度分別為107.76TCID50/mL(表1)。

表1　第5代榆林分離株TCID50的測(cè)定

2.5病毒分離株動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將第5代羊口瘡病毒榆林株劃痕接種于1月齡的羔羊的唇部和腹股溝，連續(xù)觀察發(fā)病情況。結(jié)果顯示，在劃痕接種后第4天開(kāi)始產(chǎn)生羊口瘡特征性病變，唇部出現(xiàn)紅腫、產(chǎn)生膿皰，后漸漸潰破并結(jié)痂；腹股溝劃痕接種部位均出現(xiàn)紅斑、丘疹樣水皰，與自然感染羊口瘡的羊只發(fā)病癥狀一致，陰性對(duì)照組羔羊兩處接種部位均自然愈合(圖5)。

A.接種榆林株第5代病毒液的羔羊唇部發(fā)生羊口瘡病變；B.陰性對(duì)照;C.接種榆林株第5代病毒液的羔羊腹股溝發(fā)生羊口瘡病變；D.陰性對(duì)照

A.Orf lesions occurred in lips inoculated with P5 Orf virus Yulin strain;B.Negative control;C.Orf lesions occurred in inguen inoculated with P5 Orf virus Yulin strain;D.Negative control

圖5接種羊口瘡病毒榆林株第5代病毒液的羔羊發(fā)生羊口瘡

Fig.5Orf lesions occurred in lamb challenged with P5 Orf virus Yulin strain

3　討論

近年來(lái)，我國(guó)山羊主要養(yǎng)殖省份的羊口瘡發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)[4-6]。我們已從山東威海、陜西楊凌、云南瀘西等地的山羊養(yǎng)殖場(chǎng)分離到了羊口瘡病毒野毒株[7-8]，但在陜北地區(qū)尚未獲得羊口瘡野毒株。因此，有必要對(duì)該地區(qū)的羊口瘡病毒株進(jìn)行分離鑒定，為我國(guó)羊口瘡病原學(xué)研究、流行病統(tǒng)計(jì)及疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

目前常用的羊口瘡病毒鑒定方法是電子顯微鏡觀察、PCR檢測(cè)，以及用牛腎(MDBK)細(xì)胞，綿羊胚胎鼻甲(OFTu)細(xì)胞，羊、犢牛睪丸細(xì)胞等進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)[9-11]。但相同病料在不同的細(xì)胞上感染滴度有所不同，羅云等發(fā)現(xiàn)ORFV分離株在犢牛睪丸原代細(xì)胞上的感染滴度明顯高于MDBK細(xì)胞，這可能與ORFV對(duì)不同細(xì)胞的增殖適應(yīng)能力不同有關(guān)。B2L基因編碼羊口瘡病毒表面囊膜蛋白，編碼大小約為42 ku的免疫原性蛋白，對(duì)B2L基因擴(kuò)增的傳統(tǒng)PCR被廣泛用于ORFV的檢測(cè)[3,12-13]，常用B2L基因全序列進(jìn)行分子流行病學(xué)和進(jìn)化分析[3,14-15]。

我們從具有典型羊口瘡臨床癥狀的發(fā)病山羊唇部采集結(jié)痂病料，用羊口瘡病毒易感且感染滴度較高的犢牛睪丸原代細(xì)胞作為病毒增殖細(xì)胞，盲傳至第4代時(shí)出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變，病變細(xì)胞出現(xiàn)折光性增強(qiáng)、變圓、聚堆、拉網(wǎng)脫落現(xiàn)象。用編碼羊口瘡病毒表面囊膜蛋白的B2L基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果分析顯示，我們從榆林地區(qū)采集的羊口瘡唇部結(jié)痂病料中檢測(cè)到了ORFV特異性的B2L基因，且該分離株與GenBank上公布的其他國(guó)內(nèi)外參考毒株B2L基因相應(yīng)部分的核苷酸序列相似性很高，與31個(gè)羊口瘡毒株核苷酸序列同源性均達(dá)到99%，說(shuō)明不同地區(qū)來(lái)源的ORFV分離株的B2L基因高度保守。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，在犢牛睪丸原代細(xì)胞上增殖的第5代細(xì)胞適應(yīng)毒，能夠在劃痕接種3 d后引起羔羊發(fā)病，與臨床上自然感染羊口瘡的羊只發(fā)病癥狀相同，這也與何水林等[15]進(jìn)行的動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果相一致。由此可以證實(shí)，本次分離到的的陜西榆林地區(qū)病毒株為ORFV，為下一步進(jìn)行ORFV弱毒疫苗研制和毒力相關(guān)基因的研究提供了重要的材料。

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Isolation and Identification of Orf Virus in a Goat Farm of Yulin Shaanxi

ZHOU Ming,YUE Jin-hua,LIU He-yuan,GAO Yang,LI Wen-li,YANG Qi-ming,CHEN De-kun

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

In order to obtain a wild strain of Orf virus in Yulin,samples of the lip scab from a lamb with clinical symptoms of Orf in a goat farm in Yulin city were collected.After grinded and repeated freezing and thawing,the supernatant was inoculated in calf testis primary cells by passage culture,and then the virus was identified as Orf virus through the observation of cytopathic effects,PCR detection and animal regression test.The results suggested that calf testis primary cells infected with scab by grinding fluid displayed cytopathic effects at the fourth passages,and the virus titer was 107.66TCID50/mL.B2L gene of isolated virus was cloned and sequenced,and the homologous analysis revealed an identity of 99% with Gansu (KC485343.1) strain and Fujian (KC568399.1) strain.The 2 month-old lambs were inoculated with the cell cultures for the infection experiment,and typical Orf clinic symptoms such as papules and pustules appeared in lips and inguen after virus inoculation.In conclusion,a wild strain of Orf virus in Yulin was isolated in this study.

Orf virus；isolation and identification；PCR；animal regression test

2016-02-28

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015KTTSNY04-04)

周銘(1990-)，女，陜西漢中人，碩士研究生，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.1

A

1007-5038(2016)09-0031-04