偃麥草EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

王瑞晶，李培英，張延輝

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

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偃麥草EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

王瑞晶，李培英，張延輝

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中偃麥草(Elytrigiarepens)EST序列開發(fā)偃麥草EST-SSR引物，并對(duì)47份偃麥草資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，驗(yàn)證所開發(fā)EST-SSR引物在偃麥草上的可應(yīng)用性。結(jié)果顯示，在27 891條偃麥草EST序列中可以搜索到SSR位點(diǎn)1 068個(gè)；其中六核苷酸重復(fù)序列最多，占總SSR的53.83%；二、三、四、五、六核苷酸優(yōu)勢重復(fù)基元及出現(xiàn)頻率分別為AC/TG(2.72%)、CGC/GCG(1.87%)、CGAC/GCTG(5.24%)、CCGCC/GGCGG(0.37%)、CAGCTC/GTCGAG(3.37%)。開發(fā)的105對(duì)偃麥草EST-SSR引物中有64對(duì)引物(60.95%)可以有效擴(kuò)增；隨機(jī)選取18對(duì)多態(tài)性引物對(duì)47份偃麥草進(jìn)行遺傳多樣性分析，其多態(tài)性百分率為78.64%，多態(tài)性指數(shù)(PIC)為0.22～0.83。以上結(jié)果表明，開發(fā)的偃麥草EST-SSR標(biāo)記是有效的，有較高的應(yīng)用價(jià)值，為偃麥草遺傳多樣性、重要性狀關(guān)聯(lián)分析研究奠定了基礎(chǔ)。

偃麥草；EST-SSR；標(biāo)記開發(fā)；遺傳多樣性

偃麥草(Elytrigiarepens)系禾本科小麥族偃麥草屬多年生草本植物，是我國偃麥草屬的重要代表種，在新疆、青海、甘肅、東北、內(nèi)蒙古、西藏等地均有分布[1-2]。由于其具有根莖發(fā)達(dá)，抗旱、耐鹽、耐寒，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，被認(rèn)為是一種具有潛在開發(fā)價(jià)值的草種資源。偃麥草為異花授粉植物，異源六倍體，染色體組成為(S1S2X)2，遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜[3]。但是，目前應(yīng)用于偃麥草資源遺傳多樣性、抗性種質(zhì)資源鑒定的有效標(biāo)記數(shù)量有限[4-5]。EST-SSR是近年來開發(fā)的新型分子標(biāo)記，具有多態(tài)性高，共顯性、重復(fù)性好，數(shù)量豐富等優(yōu)點(diǎn)，能反映基因的編碼部分，在物種間通用性高，被用于許多作物的抗性遺傳分析、圖譜構(gòu)建及輔助育種工作，如玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)等[6-7]；在牧草和草坪方面，EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用已在苜蓿(Medicagosativa)、蘇丹草(Sorghumsudanense)等草種資源上開展[8-9]。

目前，在NCBI中登陸的偃麥草相關(guān)EST序列已達(dá)27 891條，但還未被開發(fā)利用，通過偃麥草EST開發(fā)新的EST-SSR標(biāo)記，是增加偃麥草有效分子標(biāo)記的一條重要途徑。因此，本研究擬在分析偃麥草EST序列中SSR發(fā)生頻率和特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)開發(fā)EST-SSR引物，并在47份偃麥草上進(jìn)行引物功效評(píng)價(jià)，為未來開展偃麥草遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀分子標(biāo)記等研究工作奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所用的47份偃麥草材料中，5份材料引自北京農(nóng)林科學(xué)院(國外引進(jìn))，其余42份引自新疆各地區(qū)，包括34份北疆(烏魯木齊、阿勒泰、伊犁等地)材料，5份南疆(庫爾勒、和田)材料和3份東疆(哈密)材料。其具體來源見表1。

1.2方法

1.2.1源于偃麥草EST的SSR查找從NCBI下載由Bushman等[10]提供的偃麥草EST序列27 891條，并以Fasta格式保存；利用在線微衛(wèi)星位點(diǎn)掃描工具SSRIT(simple sequence repeat identification tool) (http://www. gramene.org/db/searches/ssrtool)搜索SSR，搜索標(biāo)準(zhǔn)為重復(fù)序列不少于18～20 bp，即二、三、四、五、六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、7、5、4、3次。

1.2.2EST-SSR引物設(shè)計(jì)利用DNAstar軟件包中的Editseq將搜索到的SSR及側(cè)翼序列保存成Seq格式，保證整個(gè)序列長度小于300 bp。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)原則為：引物長度范圍18～22 bp；退火溫度53～62 ℃，上下引物間退火溫度相差不超過5 ℃；GC含量在40%～60%，最佳為50%；擴(kuò)增片段長度150～300 bp，盡量避免形成穩(wěn)定的引物二聚體(dimer and cross dimer)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)。遵循以上原則共設(shè)計(jì)105對(duì)偃麥草EST-SSR引物，送至上海鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成，并將引物按照“E+序號(hào)”形式重新命名，如E1。

1.2.3EST-SSR引物篩選

(1)DNA提取

從每份材料中選取健壯、無病蟲害的20個(gè)單株嫩葉混合，采用改良的CTAB法[11]對(duì)供試偃麥草基因組DNA進(jìn)行提取。分別用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測DNA純度和濃度。純化后的DNA用1×TE溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR擴(kuò)增與電泳檢測

PCR反應(yīng)體系為15 μL：DNA總量為50 ng，1.5 μL 10×PCR buffer，1.2 μL dNTPs(0.2 mmol·L-1)，正反引物(0.1 μmol·L-1)各1 μL，Taq DNA聚合酶(0.5 U)0.1 μL，ddH2O補(bǔ)充至15 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在TC5000(Techne，Britain)PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，58 ℃(部分引物退火溫度使用62 ℃)退火45 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃保持10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，所用的電泳緩沖液為1×TBE，在160 V恒壓下電泳1 h，采用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行銀染顯色，拍照。

1.2.4數(shù)據(jù)分析根據(jù)EST-SSR引物在供試材料上的擴(kuò)增情況，建立0、1矩陣，有帶記為1，無帶記為0。利用Anderson等[12]的方法計(jì)算多態(tài)信息含量(polymorphism information contene，PIC)，計(jì)算公式如下：

式中：Pij表示標(biāo)記i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率，標(biāo)記i的總帶型從1到n。

采用NTSYSpc 2.11統(tǒng)計(jì)分析軟件，分析47份材料間的Dice遺傳相似系數(shù)，基于Dice遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA系統(tǒng)聚類[13]，分析群體間的遺傳分化關(guān)系。

表1　供試材料的編號(hào)及來源

續(xù)表1

材料名稱Germplasmcode采集地點(diǎn)或引種地Collectingorintroducingsite經(jīng)度(E)Longitude緯度(N)Latitude海拔Elevation/m36哈密市Hami---14*北京市農(nóng)林科學(xué)院BeijingAcademyofAgricultureandScience---15*北京市農(nóng)林科學(xué)院BeijingAcademyofAgricultureandScience---17*北京市農(nóng)林科學(xué)院BeijingAcademyofAgricultureandScience---21*北京市農(nóng)林科學(xué)院BeijingAcademyofAgricultureandScience---32*北京市農(nóng)林科學(xué)院BeijingAcademyofAgricultureandScience---

注:*為引種，**為多年馴化。

Note：* mean introduction，** mean domestication.

2　結(jié)果與分析

2.1偃麥草EST序列中的SSR頻率

從27 891條偃麥草EST序列中共搜索到1 068條SSR，SSR出現(xiàn)頻率為3.83%，平均距離為19.05 kb。其中，主要重復(fù)類型是六核苷酸，共575個(gè)，占SSR總數(shù)的53.83%；其次為四核苷酸(16.01%)、三核苷酸(15.82%)、二核苷酸(9.55%)、五核苷酸(4.78%)(表2)。

偃麥草SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在3～43(表2)，其中3次重復(fù)的SSR最多，有536個(gè)，占50.19%；其次為5次重復(fù)和7次重復(fù)的SSR，分別占15.07%和11.61%；重復(fù)次數(shù)≥11次的SSR共80個(gè)，占7.49%。二、三、四、五、六核苷酸基序的最大重復(fù)次數(shù)分別為43、12、8、6、8次。檢索到的SSR序列中，98.32%的SSR長度為20～30 bp，僅有少部分SSR(1.68%)長度在30 bp以上。

2.2不同類型基序SSR的分布特征

在搜索出的1 069個(gè)偃麥草SSR中，共檢測到322種重復(fù)基元，其中二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元分別有5、22、41、40、214種(表3)。四核苷酸CGAC/GCTG出現(xiàn)頻率最高，為5.24%，其它重復(fù)基元中的優(yōu)勢重復(fù)基元及出現(xiàn)頻率分別為AC/TG(2.72%)、CGC/GCG(1.87%)、CCGCC/GGCGG(0.37%)、CAGCTC/GTCGAG(3.37%)；優(yōu)勢重復(fù)基元SSR數(shù)量總和占總SSR的13.58%。

在所有重復(fù)基元中，重復(fù)次數(shù)跨度最大的為二核苷酸重復(fù)基元CA/GT，跨度為11～43，AG/TC、AC/TG、AT/TA跨度也相對(duì)較大，其它重復(fù)基元跨度相對(duì)較小(表4)。三核苷酸基元重復(fù)次數(shù)多以7～11次為主；四核甘酸、五核苷酸、六核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)跨度分別為5～8、4～6、3～5。

表2　偃麥草EST序列中不同核苷酸基序的SSR頻率分布

2.3EST-SSR引物多態(tài)性評(píng)價(jià)

隨機(jī)挑選8份偃麥草材料對(duì)合成的105對(duì)偃麥草EST-SSR引物進(jìn)行初步篩選，有22對(duì)引物沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，19對(duì)引物沒能產(chǎn)生預(yù)期的擴(kuò)增片段或條帶較弱，認(rèn)為其無效，64對(duì)引物可以有效擴(kuò)增，占60.95%。64對(duì)引物在偃麥草中共擴(kuò)增出158條清晰帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增2.47條，單個(gè)引物對(duì)最高擴(kuò)增條帶數(shù)為8條，最低擴(kuò)增條帶數(shù)為2條，擴(kuò)增片段大小范圍為70～600 bp。其中以三核苷酸重復(fù)的EST-SSR引物擴(kuò)增率最高，為72.41%，五核苷酸重復(fù)的引物擴(kuò)增率最低，為40.00%，相差32.41個(gè)百分點(diǎn)(表5)。

從擴(kuò)增產(chǎn)物來看，基于四核苷酸序列，且重復(fù)基元重復(fù)次數(shù)在5～8次的引物，其主帶信息清晰，雜帶較少(圖1)；其次是基于三核苷酸重復(fù)次數(shù)為7～8的引物(圖2)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，基于四核苷酸和三核苷酸所設(shè)計(jì)的引物在47份偃麥草中平均多態(tài)位點(diǎn)百分率較高，分別為79.86%和77.78%。

2.4基于EST-SSR的聚類分析

從64對(duì)有效引物中隨機(jī)選取18對(duì)EST-SSR引物對(duì)47份供試偃麥草材料進(jìn)行遺傳多樣性分析(表6)。

表3　重復(fù)基元類型的優(yōu)勢重復(fù)基元的比較分析

表4　基元類型的重復(fù)次數(shù)分布

表5　不同核苷酸重復(fù)EST-SSR的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1　引物E98對(duì)01-34種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果

圖2　引物E57對(duì)01-34種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果

18對(duì)引物共產(chǎn)生82個(gè)條帶，其中有63條顯示多態(tài)性，多態(tài)性百分率為78.64%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，有5對(duì)引物的多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)到了100.0%。多態(tài)信息含量(PIC)是表示微衛(wèi)星位點(diǎn)變異程度高低的一個(gè)指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)該位點(diǎn)為高度多態(tài)性；當(dāng)0.25

以NSTYSpc2.11軟件計(jì)算的遺傳相似系數(shù)為依據(jù)，利用UPGMA法對(duì)47份偃麥草材料進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖(圖3)，各材料間遺傳相似性系數(shù)介于0.69～0.95，平均相似系數(shù)為0.82。47份材料聚類結(jié)果與地理來源沒有絕對(duì)相關(guān)性。在相似系數(shù)為0.74處，將47份供試偃麥草材料分為三大類群：第一大類包括采自北疆的14份材料，采自南疆的全部材料、采自東疆的ER36以及引自北京農(nóng)林科學(xué)院的(ER14、ER15、ER17)，在相似系數(shù)為0.75處，第一大類又被劃分成兩個(gè)亞類，而采自南疆的5份材料也被劃分到兩個(gè)亞類中；第二大類包括采自北疆的ER12，采自東疆的ER24、ER35及引自北京農(nóng)林科學(xué)院的ER21、ER32，而在相似系數(shù)為0.757處，ER16被單獨(dú)聚為一類；第三大類僅包括采自北疆的ER41，表明其與其它材料有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。另外，有16份材料的相似系數(shù)為0.906，具有較近的親緣關(guān)系；ER41、ER22、ER48、ER16與其它材料的遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，遺傳背景豐富，可用于新品系選育。

3　討論

3.1SSR的分布特征

EST-SSR引物源于表達(dá)序列，不同植物開發(fā)的EST序列中SSR分布的頻率差異很大。本研究對(duì)目前為止NCBI所公布的27 891條偃麥草EST序列中的SSR的分布特征進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)1 068個(gè)SSR，占偃麥草EST數(shù)據(jù)庫的3.83%，與劉林等[15]對(duì)小麥SSR序列分析中的結(jié)果基本一致，但高于陳海梅等[16]而略低于陳軍方等[17]對(duì)小麥SSR序列的分析結(jié)果。這樣的區(qū)別一方面可能是由于所使用的數(shù)據(jù)庫不同所導(dǎo)致，陳海梅等[16]和陳軍方等[17]分別使用的是GenBank和EST協(xié)作網(wǎng)上的EST數(shù)據(jù)庫，而本研究使用的是NCBI上的偃麥草EST數(shù)據(jù)庫；另一方面搜索SSR時(shí)所選用的參數(shù)不同也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果有所差異。陳海梅等[16]僅對(duì)二、三、四、五核苷酸重復(fù)序列進(jìn)行搜索，所以其SSR出現(xiàn)頻率低于本研究；而陳軍方等[17]設(shè)置的三核苷酸最少重復(fù)次數(shù)低于本研究的，故其SSR出現(xiàn)頻率低于本研究0.27%。

就EST中不同類型SSR的出現(xiàn)頻率看，多數(shù)研究表明，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)SSR的出現(xiàn)頻率高[18]，而本研究發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復(fù)SSR出現(xiàn)頻率最高，占所有SSR的53.83%。除劉林等[15]對(duì)小麥EST-SSR引物進(jìn)行開發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)六核苷酸出現(xiàn)頻率較高之外，其它研究中未見報(bào)道，主要是因?yàn)槎鄶?shù)研究者在搜索SSR時(shí)沒有把六核苷酸列入搜索對(duì)象中。但是六核苷酸重復(fù)序列也存在豐富的多態(tài)性，對(duì)基因功能的影響也很大，應(yīng)該列入SSR搜索對(duì)象。本研究搜索到的SSR中，五核苷酸出現(xiàn)頻率最低，與孫清明等[19]的研究結(jié)果一致。

表6　18對(duì)偃麥草EST-SSR引物信息

圖3　47份供試偃麥草材料的EST-SSR聚類圖

3.2EST-SSR引物的有效性分析

目前對(duì)于SSR長度與引物多態(tài)性的關(guān)系，有3種研究結(jié)果[19]：1)SSR越長，多態(tài)性頻率越高；2)SSR越短，多態(tài)性頻率越高；3)SSR重復(fù)次數(shù)與多態(tài)性間不存在相關(guān)性。本研究并未發(fā)現(xiàn)SSR長度與多態(tài)性存在相關(guān)性。但是從擴(kuò)增效果來看，基于四核苷酸序列和三核苷酸所設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增結(jié)果主帶信息清晰，雜帶較少。利用高粱(S.bicolor)EST-SSR標(biāo)記對(duì)蘇丹草的通用性研究中得到了同樣的結(jié)果[9]。

基因型不同的品種，基因組內(nèi)核苷酸序列也存在差異，當(dāng)用相同的SSR引物對(duì)不同基因組進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)，由于基因組上與引物互補(bǔ)DNA片段的數(shù)目、位點(diǎn)不同，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、數(shù)目也不同，因此，擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性能反映材料的遺傳多樣性。用6對(duì)EST-SSR引物在9個(gè)抗蚜苜蓿品種(系)中檢測到了63條多態(tài)性擴(kuò)增帶，每對(duì)引物平均擴(kuò)增10.50條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為91.30%[20]。用23對(duì)來自高粱、玉米、水稻的EST-SSR引物在43份西南扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)中檢測到261條多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為80.4%[21]。本研究利用18對(duì)偃麥草EST-SSR引物在47份供試偃麥草材料中共產(chǎn)生63條多態(tài)性條帶，且多態(tài)性百分率為78.64%。而在偃麥草分子標(biāo)記研究方面，已經(jīng)報(bào)道的僅有李培英[22]從100對(duì)RAPD引物中篩選出18對(duì)多態(tài)性RAPD引物，在32份偃麥草材料中檢測到257條多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為93.70%，明顯高于EST-SSR。究其原因認(rèn)為，一方面RAPD受條件影響較大，其穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，導(dǎo)致有效引物數(shù)量稍低；另一方面EST-SSR是來源于序列相對(duì)保守的基因組編碼區(qū)，多態(tài)性主要基于微衛(wèi)星重復(fù)序列數(shù)目的變化而有所差異，其多態(tài)性可能與功能基因有關(guān)，其多態(tài)性標(biāo)記具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

3.3偃麥草遺傳相似性分析

一般來說，位點(diǎn)的平均PIC可被用來估算群體的遺傳多樣性水平，PIC平均值越高，表明群體的變異程度越高，遺傳多樣性越豐富[8]。本研究選取的18對(duì)EST-SSR引物，多態(tài)信息指數(shù)范圍在0.22～0.83，平均為0.62，具有較為豐富的遺傳多樣性。表明開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記有較高的應(yīng)用價(jià)值，可用于偃麥草資源遺傳多樣性分析。

通過分析47份供試材料的遺傳相似性，得到UPGMA親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。其聚類結(jié)果和材料來源地并非完全吻合，表現(xiàn)為材料ER12和ER27，分別來自北疆和南疆，但其遺傳相似系數(shù)大于0.92；部分來源地相同的材料雖然被聚在同一大類，但不屬于同一亞類(采自南疆的5份材料)，說明雖然來源于同一地理區(qū)域的材料間遺傳上具有一定的相似性，但也可能由于分布地域微環(huán)境的影響，導(dǎo)致材料間存在一定的遺傳分化。也有研究表明，野生偃麥草的群體之間的親緣關(guān)系與地理距離沒有絕對(duì)的相關(guān)性[3]。其原因可能為：1)雖然野生偃麥草具有較高的遺傳多樣性，但是等位基因處于不平衡狀態(tài)，易受環(huán)境影響而改變，境內(nèi)地型復(fù)雜，自然環(huán)境多樣都會(huì)對(duì)其遺傳多樣性造成影響；2)偃麥草具有很強(qiáng)的無性繁殖能力，可能在材料交流過程中使其轉(zhuǎn)入異地?cái)U(kuò)展繁殖；3)材料在進(jìn)化過程中，個(gè)別基因發(fā)生了變異，且該突變體能較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境并得到保存；4)在取樣過程中，每份材料采集的單株數(shù)量也會(huì)影響到等位基因的檢測，使得野生偃麥草的遺傳相似性和地理來源關(guān)系復(fù)雜化。

4　結(jié)論

偃麥草EST含有豐富的、多種類型的SSR位點(diǎn)，通過EST序列開發(fā)偃麥草SSR標(biāo)記是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)和有效的途徑。本研究明確了偃麥草EST序列中SSR的總體特征，開發(fā)了64個(gè)具有多態(tài)性的偃麥草EST-SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記為偃麥草遺傳多樣性、重要性狀關(guān)聯(lián)分析研究奠定了基礎(chǔ)。

References：

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(責(zé)任編輯武艷培)

Development ofElytrigiarepensEST-SSR markers and its application

Wang Rui-jing, Li Pei-ying, Zhang Yan-hui

(College of Pratacultural and Environmental Science, Xinjiang Agricultural University,Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology of Xinjiang, Urumqi 830052, China)

To develop new simple sequence repeat (SSR) markers forElytrigiarepens, EST-SSR primers ofE.repenswere designed using the EST sequences ofE.repensin NCBI database.The genetic diversity of 47Elytrigiasamples were analyzed using EST-SSR markers to determine the function of EST-SSR inE.repens. Results showed that: From the 27891ElytrigiaEST sequences released in NCBI, 1 068 SSRs were searched. Among those EST-SSRs, the frequency of hexamer motifs was the highest, which is 53.83% of the total number of SSRs,whereas the frequency of dimer, trimer tetramer, pentamer, hexamer were AC/TG(2.72%), CGC/GCG(1.87%), CGAC/GCTG(5.24%), CCGCC/GGCGG(0.37%), CAGCTC/GTCGAG (3.37%), respectively. 105 pairs of EST-SSR primers were designed and synthesized, and 64 pairs (60.95%) of EST-SSR primers led to PCR amplification products. 18 EST-SSR primers were randomly selected and used to analyze the genetic diversity of 47Elytrigiasamples. The results showed that the polymorphic percentage was 78.64%，polymorphic information content (PIC) was in the range of 0.22～0.83. Taken together, all results indicate that the EST-SSR markers ofE.repensdeveloped in this study is highly effective and valuable, and they can be used in the research of genetic diversity and association analysis for important trait inE.repens.

Elytrigiarepens; EST-SSR; marker development; genetic diversity

Li pei-yingE-mail:nmlpy_1234@sina.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0571

2015-10-19接受日期：2016-06-01

國家自然科學(xué)基金(31360580)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(XJAUGRI2015002)

王瑞晶(1991-)，女，山西運(yùn)城人，在讀碩士生，主要從事草種質(zhì)的選育與遺傳多樣性研究。E-mail：wrj9275@163.com

李培英(1975-)，女，內(nèi)蒙古察右前旗人，教授，博士，主要從事草種資源評(píng)價(jià)、草新品種選育及草坪學(xué)的教學(xué)與科研工作。E-mail：nmlpy_1234@sina.com

S540.1;Q943

A

1001-0629(2016)8-1526-10

王瑞晶，李培英，張延輝.偃麥草EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用.草業(yè)科學(xué),2016,33(8)：1526-1535.

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