表達(dá)二穗短柄草CBF2基因擬南芥抗旱性分析

張彥妮，焦孟月，劉奕佳

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

?

表達(dá)二穗短柄草CBF2基因擬南芥抗旱性分析

張彥妮，焦孟月，劉奕佳

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以表達(dá)二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)CBF2基因的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為材料，通過模擬干旱脅迫分析其種子和幼苗對(duì)甘露醇滲透脅迫的響應(yīng)和成苗對(duì)盆栽條件下水分脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明，滲透壓為-0.62 MPa時(shí)種子萌發(fā)率開始下降，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率略高于野生擬南芥，但差異不顯著(P>0.05)。以根的增長(zhǎng)量作為評(píng)價(jià)幼苗抗旱性的主要標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)滲透壓小于-0.37 MPa時(shí)，根長(zhǎng)增長(zhǎng)量隨著脅迫強(qiáng)度的增加而明顯減小，轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)增長(zhǎng)量始終顯著高于野生型擬南芥(P<0.05)。擬南芥成苗干旱脅迫至25 d，野生擬南芥成活率為11.7%，轉(zhuǎn)基因植株平均成活率為41.6%；隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因擬南芥過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性均顯著高于野生植株，丙二醛含量及相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于野生植株。結(jié)果表明，二穗短柄草CBF2基因提高了擬南芥幼苗及成苗的抗旱性。

CBF2基因；二穗短柄草；擬南芥；抗旱性

干旱是影響植物生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子之一，也是對(duì)全球影響最廣泛的自然災(zāi)害[1]。我國(guó)是一個(gè)干旱災(zāi)害頻發(fā)的國(guó)家，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年我國(guó)干旱災(zāi)害造成的損失超過各種自然災(zāi)害損失總和的15%[2-3]。因此，提高植物的抗旱性在育種工作中尤為重要。隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程技術(shù)成為改良植株抗旱性、培育抗旱新品種的重要途徑之一。相比功能基因，轉(zhuǎn)錄因子在一定條件下可以調(diào)控多個(gè)逆境相關(guān)基因的表達(dá)，因此，利用轉(zhuǎn)錄因子來(lái)提高植株的抗逆性將是一條更有效的途徑[4]。AP2、bZIP、NAC、MYB、Cys2/His2鋅指等不同類型的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物應(yīng)答干旱脅迫，這些轉(zhuǎn)錄因子通過激活或抑制下游干旱應(yīng)答基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物的抗旱性，且能獲得持久的抗逆性，具有廣闊的應(yīng)用前景[5-9]。

DREB/CBF(dehydration responsive element binding protein/C-repeat binding factor)屬于AP2類轉(zhuǎn)錄因子，被稱為低溫反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。CBF基因家族目前發(fā)現(xiàn)編碼6個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄活化因子，分別稱為CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6[10-11]。當(dāng)某些植物受到干旱、鹽堿、冷脅迫時(shí)DREB/CBF上調(diào)表達(dá)，可激活其它一系列依賴DRE/CRT順式作用元件的抗逆功能基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)干旱、低溫及高鹽堿等逆境的抗性，例如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中超表達(dá)的CBF4激活了包含低溫馴化及干旱適應(yīng)的下游基因C-重復(fù)/脫水應(yīng)答元件，從而提高了植株的抗寒性、抗旱性[10,12]。目前，CBF家族轉(zhuǎn)錄因子抗寒功能及應(yīng)用的研究比較廣泛，研究表明，DREB/CBF基因的表達(dá)可以被多種脅迫誘導(dǎo)，CBF1及CBF3多在鹽脅迫下表達(dá)，而CBF2主要在干旱及高鹽脅迫下表達(dá)[13-14]。通過對(duì)干旱脅迫時(shí)CBF4種基因在不同葡萄(Vitisvinifera)品種中表達(dá)模式的研究發(fā)現(xiàn)，干旱條件下CBF2在葉片及根系中均表達(dá)，且相比衰老組織，幼嫩組織中的表達(dá)量較多[15-16]。此外，受ABA的誘導(dǎo),CBF2的表達(dá)量也會(huì)增加，原因是植物對(duì)ABA的響應(yīng)促進(jìn)了CBF啟動(dòng)子活性的提高[12,17-18]。CBF2在CBF1和CBF3表達(dá)上具有負(fù)的調(diào)控作用，并且對(duì)擬南芥的耐脅迫性起著重要作用[18]。

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是禾本科短穗草屬一年生野生草本植物，具有極強(qiáng)的抗寒性，對(duì)干旱、鹽堿也有一定的抗性[19]。目前已證明，二穗短柄草CBF3轉(zhuǎn)錄因子在提高植物的抗寒性方面具有重要作用[20]，但對(duì)二穗短柄草CBF2轉(zhuǎn)錄因子抗性的研究較少。本研究以已轉(zhuǎn)入二穗短柄草CBF2基因的擬南芥為研究材料，通過對(duì)比干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生植株形態(tài)及生理指標(biāo)的差異，探討該基因?qū)Ω珊档目剐裕瑥亩鵀樵摶虻目购敌詰?yīng)用及基因作用機(jī)理等研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為培育抗旱新品種提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

二穗短柄草CBF2轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代種子T3-3、T3-6、T3-9為試驗(yàn)材料，以野生擬南芥(WT,由加州大學(xué)戴維斯分校Blumwald Eduardo教授贈(zèng)送的種子的后代)為對(duì)照。

1.2方法

1.2.1種子消毒取適量擬南芥種子(儲(chǔ)存在4 ℃的冰箱中以保證發(fā)芽整齊)至離心管中，先用75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗一次，再用5%的次氯酸鈉消毒12 min，無(wú)菌水沖洗3次。

1.2.2種子滲透脅迫處理將已消毒的轉(zhuǎn)基因和野生擬南芥種子，播于滲透壓分別為0、-0.12、-0.25、-0.37、-0.49、-0.62、-0.74 MPa的1/2MS培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱(23～24 ℃)中暗培養(yǎng)3 d，后置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計(jì)不同濃度甘露醇下轉(zhuǎn)基因和野生擬南芥種子的萌發(fā)率。

萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/播種種子總數(shù)×100%。

1.2.3幼苗的滲透脅迫處理將在1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因與野生擬南芥幼苗移入滲透壓分別為0、-0.12、-0.25、-0.37、-0.49、-0.62、-0.74 MPa的1/2MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，垂直培養(yǎng)10 d后，測(cè)量不同濃度甘露醇處理下轉(zhuǎn)基因和野生幼苗的根長(zhǎng)增長(zhǎng)量。

根長(zhǎng)增長(zhǎng)量=垂直培養(yǎng)10 d后主根長(zhǎng)度-垂直培養(yǎng)10 d前主根長(zhǎng)度。

1.2.4成苗的干旱脅迫處理當(dāng)幼苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)將其移入花盆中(培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)，放入長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后，停止?jié)菜?，? d觀察記錄轉(zhuǎn)基因和野生擬南芥的形態(tài)變化，24 d時(shí)統(tǒng)計(jì)其成活率。

成活率=成活植株株數(shù)/移栽植株總株數(shù)×100%。

1.2.5干旱脅迫處理轉(zhuǎn)基因擬南芥成苗的生理指標(biāo)測(cè)定分別取干旱處理0、4、8、12、20 d的轉(zhuǎn)基因和野生擬南芥成苗葉片為待測(cè)樣品，每份待測(cè)樣品取自于一株植物，每個(gè)處理重復(fù)3次，即每個(gè)處理取3株植物。采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)總活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)總活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量，采用電導(dǎo)儀法測(cè)定電導(dǎo)率[21]。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel整理數(shù)據(jù)，使用SPSS軟件對(duì)每個(gè)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，然后對(duì)同一脅迫條件下不同株系間的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1滲透脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)

當(dāng)滲透壓為0、-0.12、-0.25、-0.37、-0.49 MPa時(shí)，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子萌發(fā)率均為100%(圖1)。當(dāng)滲透壓達(dá)-0.62 MPa時(shí)，野生型擬南芥種子平均萌發(fā)率降至76.4%，轉(zhuǎn)基因擬南芥T3-3、T3-6、T3-9的種子平均萌發(fā)率分別為89.3%、93.1%和95.7%(圖1)，但轉(zhuǎn)基因株系與野生型差異不顯著(P>0.05)。而此時(shí)已萌發(fā)的野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥株系表型差異明顯，野生型擬南芥幼苗較轉(zhuǎn)基因幼苗更小，且葉片數(shù)量少。轉(zhuǎn)基因擬南芥株系T3-3、T3-6、T3-9之間種子萌發(fā)率和表型均無(wú)明顯差異。當(dāng)滲透脅迫達(dá)-0.74 MPa時(shí)，野生型擬南芥種子萌發(fā)率降為33.3%，而轉(zhuǎn)基因擬南芥株系T3-3、T3-6、T3-9的種子萌發(fā)率分別為38.7%、37.1%和39.0%，轉(zhuǎn)基因與野生型相比差異仍不顯著。因此，轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)階段并未表現(xiàn)出明顯強(qiáng)于野生型的抗旱能力。

2.2滲透脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的形態(tài)指標(biāo)分析

當(dāng)滲透壓為-0.25 MPa時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長(zhǎng)增長(zhǎng)量與未干旱脅迫下幼苗相比差異不顯著(P>0.05)，野生型幼苗根長(zhǎng)增長(zhǎng)量明顯下降，其根長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著低于同一滲透壓下的轉(zhuǎn)基因幼苗(P<0.05)(圖2)。當(dāng)滲透壓為-0.37、-0.49、-0.62、-0.74 MPa時(shí)，根長(zhǎng)增長(zhǎng)量隨著滲透脅迫的增強(qiáng)而明顯減小，轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)增長(zhǎng)量始終顯著高于野生型擬南芥的(P<0.05)(圖2)。而在滲透壓-0.49、-0.74 MPa時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T3-3的根長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著低于轉(zhuǎn)基因株系T3-6和T3-9的(P<0.05)。隨著滲透脅迫的增強(qiáng)，以未進(jìn)行干旱脅迫的幼苗為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因與野生擬南芥幼苗根增長(zhǎng)量不斷減少，植株形態(tài)差異不明顯。表明，CBF2基因在一定程度上增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥在幼苗期的抗旱能力，且轉(zhuǎn)基因株系T3-6和T3-9相對(duì)于株系T3-3的基因表達(dá)性狀更穩(wěn)定。

2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥成苗的抗旱性形態(tài)指標(biāo)分析

水分脅迫結(jié)果表明,干旱8 d時(shí)，野生型擬南芥表型開始發(fā)生變化，其植株葉片開始失綠、變黃，而轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系正常生長(zhǎng)(圖3)。此后8-20 d，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)皆下降，葉片漸枯、萎蔫，至處理20 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥皆已出現(xiàn)死亡植株，此時(shí)野生型擬南芥的枯黃現(xiàn)象更為嚴(yán)重，與轉(zhuǎn)基因各株系之間具有一定的表型差異(圖3)。24 d時(shí)統(tǒng)計(jì)成活率，野生型擬南芥的成活率僅為11.7%，而轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系T3-3、T3-6和T3-9株系成活率分別為38.3%、44.5%和41.9%。表明CBF2基因在增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株抗旱性方面具有一定的作用。

圖1　甘露醇滲透脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥萌發(fā)率的影響

注：不同字母表示同一脅迫條件下不同植株材料間差異顯著(P<0.05)。WT,野生型擬南芥;T3-3, T3-6和T3-9為轉(zhuǎn)基因型擬南芥。圖2同。

Note: Different lower case letters under the same stress condition indicate significant difference among different plant materials at 0.05 level. WT, wildA.Tthaliana; T3-3, T3-6 and T3-9 are transgenicA.thaliana. The same in Fig.2.

圖2　甘露醇滲透脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生擬南芥根長(zhǎng)增長(zhǎng)影響

2.4干旱脅迫處理轉(zhuǎn)基因擬南芥成苗的生理指標(biāo)分析

2.4.1干旱脅迫對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化物酶(POD)總活性的影響隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因各株系和野生型擬南芥的SOD、POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，未處理時(shí)各株系間酶活性差異不顯著(P>0.05)(圖4、5)。脅迫至8 d，轉(zhuǎn)基因與野生擬南芥SOD、POD的活性達(dá)到最高，隨后活性降低，可能是干旱脅迫下擬南芥啟動(dòng)了其脅迫響應(yīng)機(jī)制。與野生擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因植株SOD、 POD活性始終略高于野生型植株內(nèi)酶活性，但差異不顯著。

圖3　自然干旱處理8天和20天下轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的表型

圖4　干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥SOD的影響

注：CK1為野生型未處理植株，CK2為轉(zhuǎn)基因株系T3-9未處理植株。圖5、6、7同。

Note: CK1represent wild typeA.thalianaof normal growth, CK2represent T3-9 transgenicA.thalianaof normal growth. The same in Fig.5, Fig.6, Fig.7.

圖5　干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥POD的影響

圖6　干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥MDA的影響

2.4.2干旱脅迫對(duì)丙二醛含量的影響隨著干旱脅迫時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因各株系和野生型擬南芥的丙二醛(MDA)含量均呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)(圖6)。處理8-20 d內(nèi)，轉(zhuǎn)基因擬南芥MDA含量始終顯著低于野生型擬南芥植株(P<0.05)。在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度始終顯著低于野生型擬南芥，間接說明轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)產(chǎn)生的超氧負(fù)離子更少，干旱脅迫使其受害的程度更小。CBF2基因能夠減緩植物呼吸平衡的破環(huán)，即提高了植株的抗旱性。

2.4.3干旱脅迫對(duì)電導(dǎo)率的影響隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因各株系和野生型擬南芥的相對(duì)外滲電導(dǎo)率均不斷升高(圖7)。脅迫8-20 d內(nèi)，轉(zhuǎn)基因各株系電導(dǎo)率均顯著低于野生型擬南芥(P<0.05)。與野生擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系的相對(duì)電導(dǎo)率上升趨勢(shì)更平緩，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更好，膜結(jié)構(gòu)受到的功能破壞更小，即轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性提高。

圖7　干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥相對(duì)電導(dǎo)率的影響

3　討論與結(jié)論

在干旱環(huán)境下，種子能否保持活力及幼苗能否繼續(xù)生長(zhǎng)是植物存活的關(guān)鍵，目前對(duì)轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)期的抗性研究較少，而種子萌發(fā)期抗旱性鑒定是整體抗旱性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容[22-24]。滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)水分脅迫的主要生理機(jī)制，通過滲透調(diào)節(jié)植物在干旱條件下維持一定的膨壓，從而維持細(xì)胞生長(zhǎng)、氣孔開放和光合作用等生理過程的進(jìn)行[25]。本研究對(duì)種子及幼苗抗性的研究采用滲透調(diào)節(jié)模擬干旱的方法，研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下CBF2轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)率略高于野生擬南芥的，但差異不顯著，CBF2基因在改善擬南芥種子的抗旱性上，沒有表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。干旱脅迫下，幼苗根的生長(zhǎng)對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)發(fā)育具有十分重要的意義[26]。因此，本研究以根長(zhǎng)增長(zhǎng)量作為分析幼苗抗旱性的主要指標(biāo)。當(dāng)滲透壓達(dá)-0.25 MPa時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系根長(zhǎng)增長(zhǎng)量皆顯著高于野生型(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因擬南芥顯示出較強(qiáng)的抗旱性，即CBF2基因增強(qiáng)了植株幼苗時(shí)期的抗旱能力。

對(duì)轉(zhuǎn)基因與野生擬南芥成苗進(jìn)行相同時(shí)間的水分脅迫，脅迫8和20 d時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系與野生型擬南芥表型差異明顯， 24 d時(shí)統(tǒng)計(jì)成活率，野生擬南芥成活率為11.7%，轉(zhuǎn)基因不同株系的平均成活率為41.6%。脅迫條件下，細(xì)胞及酶活性變化以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)累積情況需要依靠植物的生理生化指標(biāo)進(jìn)行研究[27]。干旱脅迫打破了植物細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡，導(dǎo)致活性氧積累，引起膜脂過氧化作用[28]。POD、SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的關(guān)鍵酶，可以減輕或避免活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害。本研究中，轉(zhuǎn)基因及野生各株系在干旱脅迫下POD、SOD活性均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，脅迫至8 d，POD、SOD活性達(dá)到最高，表明8 d后抗氧化酶防止膜脂過氧化和保護(hù)膜系統(tǒng)的能力降低[29]。轉(zhuǎn)基因各株系POD、SOD的活性在脅迫8-20 d內(nèi)顯著高于野生植株，表明轉(zhuǎn)基因植株中清除活性氧的能力較強(qiáng)。MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率表明逆境對(duì)植株的傷害程度，有研究表明[30-31]MDA的含量、相對(duì)電導(dǎo)率的大小與植物抗旱系數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)，本研究中，轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量與外滲電導(dǎo)率顯著低于野生植株(P<0.05)的，表明轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜遭受的破壞較小。綜上所述，CBF2基因在提高擬南芥成苗抗旱能力上發(fā)揮了作用，與李新玲等[31]對(duì)CBF2基因研究結(jié)果類似。

此外，轉(zhuǎn)基因擬南芥不同株系之間抗旱性也存在差異，T3-3株系的抗旱性較其它株系較弱。如干旱脅迫下，T3-3的根長(zhǎng)增長(zhǎng)量明顯低于轉(zhuǎn)基因株系T3-6和T3-9的，原因可能是轉(zhuǎn)基因株系T3-6和T3-9相對(duì)于株系T3-3基因表達(dá)性狀更穩(wěn)定。

對(duì)已轉(zhuǎn)入二穗短柄草CBF2基因的擬南芥種子、幼苗及成苗進(jìn)行干旱脅迫處理，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性在幼苗及成苗期得到了提高，即CBF2具有提高植株抗旱性的功能，為研究CBF2基因其它功能奠定了基礎(chǔ)，也為利用轉(zhuǎn)基因綜合改良觀賞植物的抗逆性提供了新思路。

References：

[1]張強(qiáng),韓蘭英,張立陽(yáng),王勁松.論氣候變暖背景下干旱和干旱災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)特征與管理策略.地球科學(xué)進(jìn)展,2014,29(1):80-90.

Zhang Q,Han L Y,Zhang L Y,Wang J S.Analysis on the character and management strategy of drought disaster and risk under the climatic warming.Advances in Earth Science,2014,29(1):80-90.(in Chinese)

[2]涂長(zhǎng)望,黃士松.中國(guó)夏季風(fēng)之進(jìn)退.氣象學(xué)報(bào),1944(1):1-20.

Tu C W,Huang S S.Summer monsoon retreat of China.Meteorologica Sinica,1944(1):1-20.(in Chinese)

[3]李茂松,李森,李育慧.中國(guó)近50年來(lái)旱災(zāi)災(zāi)情分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2003,24(1):7-10.

Li M S,Li S,Li Y H.Studies on drought in the past 50 years in China.Agricultural Meteorology,2003,24(1):7-10.(in Chinese)

[4]Ashraf M,Akram N A.Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:An analytical comparison.Biotechnology Advances,2009,27(6):744-752.

[5]Fujita Y,Fujita M,Satoh R,Maruyama K,Parvez M M,Seki M,Hiratsu K,Ohme-Takagi M,Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozakia K.AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis.Plant Cell,2005,17(12):3470-3488.

[6]Cominelli E,Galbiati M,Vavasseur A,Contl L,Sala T,Vuylsteke M,Leonhardt N,Dellaporta S,Tonelli C.A Guard cell specificMYBtranscription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance.Current Biology,2005,15(13):1196-1200.

[7]Umezawa T,Fujita M Y,Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.Engineering drought tolerance in plants:Discovering and tailoring genes to unlock the future.Current Opinion in Biotechnology,2006,17(2):113-122.

[8]Bartels D,Sunkar R.Drought and salt tolerance in plants.Critical Reviews in Plant Sciences,2005,24(1):23-58.

[9]徐立明,張振葆,梁曉玲,盧文,張辰路,黃鳳珠,王雷,張素芝.植物抗旱基因工程研究進(jìn)展.草業(yè)學(xué)報(bào),2014,23(6):293-303.

Xu L M,Zhang Z B,Liang X L,Lu W,Zhang C L,Huang F Z,Wang L,Zhang S Z.Advances in genetic engineering for drought tolerance in plants.Acta Prataculturae Sinica,2014,23(6):293-303.(in Chinese)

[10]Haake V,Cook D,Riechmann J L,Pineda O,Thomashow M F,Zhang J Z.Transcription factorCBF4 is a regulator of drought adaptation inArabidopsis.Plant Physiology,2002,130(2):639-648.

[11]Sakuma Y,Liu Q,Dubouzet J G,Abe H,Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozaki K.DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain ofArabidopsisDREBs,transcription factors involved in dehydration and cold-inducible gene expression.Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,290(3):998-1009.

[12]Xiao H G,Tattersall E A R,Siddiqua M,Cramer G R,Nassuth A.CBF4 is a unique member of theCBFtranscription factor family ofVitisviniferaandVitisriparia.Plant,Cell and Environment,2008,31(1):1-10.

[13]Gilmour S J,Zarka D G,Stockinger E J,Salazar M P,Houghton J M,Thomashow M F.Low temperature regulation of theArabidopsisCBFfamily of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-inducedCORgene expression.Plant Journal,1998,16(4):433-442.

[14]Zandkarimi H,Ebadi A,Salami S A,Alizade H,Baisakh N.Analyzing the expression profile ofAREB/ABFandDREB/CBFgenes under drought and salinity stresses in grape(VitisviniferaL.).PLoS One,2015,10(7):1-16.

[15]Novillo F,Medina J,Rodriguez-Franco M,Neuhaus G,Salinas J.Genetic analysis reveals a complex regulatory network modulatingCBFgene expression andArabidopsisresponse to abiotic stress.Journal of Experimental Botany,2012,63(1):293-304.

[16]Kang J Y,Choi H I,Im M Y,Kim S Y.Arabidopsisbasic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling.Plant Cell,2002,14(2):343-357.

[17]劉艷香,董寬虎.轉(zhuǎn)錄因子CBF及其抗寒作用機(jī)制.草業(yè)科學(xué),2009,26(5):86-94.

Liu Y X,Dong K H.Transcription factor CBF and its cold tolerance mechanism.Pratacultural Science,2009,26(5):86-94.

[18]Novillo F,Alonso J M,Ecker J R,Salinas J.CBF2/DREB1Cis a negative regulator ofCBF1/DREB1BandCBF3/DREB1Aexpression and plays a central role in stress tolerance inArabidopsis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,2004,101(11):3985-3990.

[19]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志.北京:科學(xué)出版社,2002:382.

Editorial Committee of Chinese Journal of Plant of Chinese Academy of Sciences.Flora of China.Beijing:Science Press,2002:382.(in Chinese)

[20]李川.二穗短柄草抗寒凍機(jī)理研究及作為早熟禾亞科研究模式植物的綜合評(píng)估.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2012.

Li C.Comparative analyses reveal potential uses ofBrachypodiumdistachyonas a model for cold stress responses in Pooideae.PhD Thesis.Ya’an:Sichuan Agricultural University,2012.(in Chinese)

[21]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).北京:高等教育出版社,2000:164-165,167-169,260-263.

Li H S.Plant Physiology and Biochemistry Experimental Principles and Techniques.Beijing:Higher Education Press,2000:164-165,167-169,260-263.(in Chinese)

[22]秦文靜,梁宗鎖.四種豆科牧草萌發(fā)期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及抗旱性評(píng)價(jià).草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(4):61-70.

Qin W J,Liang Z S.Response and drought resistance of four leguminous pastures to drought during seed germination.Acta Prataculturae Sinica,2010,19(4):61-70.(in Chinese)

[23]冷益豐,張彪,趙久然,楊俊品,劉亞,康繼偉,陳潔,唐海濤,譚君,何文鑄.轉(zhuǎn)基因玉米種子萌發(fā)期抗旱性鑒定.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2013,31(1):177-182.

Leng Y F,Zhang B,Zhao J R,Yang J P,Liu Y,Kang J W,Chen J,Tang H T,Tan J,He W Z.Identification of drought resistance of transgenic maize during seed germination stage.Agricultural Research in the Arid Areas,2013,31(1):177-182.(in Chinese)

[24]張彥妮,李博,何淼.PEG干旱脅迫對(duì)大花飛燕草幼苗生理特性的影響.草業(yè)科學(xué),2014,31(3):446-450.

Zhang Y N,Li B,He M.Physiological characteristics ofDelphiniumgrandiflorumunder drought stress.Pratacultural Science,2014,31(3):446-450.(in Chinese)

[25]萬(wàn)里強(qiáng),李向林,石永紅,何峰,賈亞雄.PEG脅迫下4個(gè)黑麥草品種生理生化指標(biāo)響應(yīng)與比較研究.草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(1):83-88.

Wan L Q,Li X L,Shi Y H,He F,Jia Y X.A study on the response and on the comparison of physiological and biochemical indexes of fourLoliumperennevarieties under PEG stress.Acta Prataculturae Sinica,2010,19(1):83-88.(in Chinese)

[26]劉穎,張巨明.暖季型草坪草對(duì)干旱脅迫的反應(yīng).草業(yè)科學(xué),2013,30(11):1732-1738.

Liu Y,Zhang J M.Review on the response of warm-season turfgrass to drought stress.Pratacultural Science,2013,30(11):1732-1738.(in Chinese)

[27]李長(zhǎng)慧,李淑娟,雷有升,胡凱,王佩羽.4種高原鄉(xiāng)土禾草的抗旱生理比較.草業(yè)科學(xué)，2013,30(9):1386-1393.

Li C H,Li S J,Lei Y S,Hu K,Wang P Y.Study on drought resistance of four native grass species.Pratacultural Science,2013,30(9):1386-1393.(in Chinese)

[28]林武星,谷凌,朱煒,聶森.干旱脅迫對(duì)臺(tái)灣海桐生長(zhǎng)和生理生化特性的影響.草業(yè)科學(xué),2014,31(10):1915-1922.

Lin W X,Gu L,Zhu W,Nie S.Effects of drought stress on growth and physiological and biochemical characteristics ofPittosporumpentandrum.Pratacultural Science,2014,31(10):1915-1922.(in Chinese)

[29]郭中校,張連學(xué),王明海,徐寧,包淑英,王桂芳,徐仲偉.綠豆品種抗旱性早期鑒定方法研究.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)報(bào),2012,40(7):77-84.

Guo Z X,Zhang L X,Wang M H,Xu N,Bao S Y,Wang G F,Xu Z W.Study on early identification method of drought tolerance of mung bean cultivars.Journal of Northwest A & F University:Natural Science Edition,2012,40(7):77-84.(in Chinese)

[30]張永峰,殷波.混合鹽堿脅迫對(duì)苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響.草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(1):46-50.

Zhang Y F,Yin B.Influences of salt and alkali mixed stresses on anti oxidative activity and MDA content ofMedicagosativaat seedling stage.Acta Prataculturae Sinica,2009,18(1):46-50.(in Chinese)

[31]李新玲,徐香玲,王全偉.擬南芥CBF2基因的抗旱性研究.生物技術(shù)通報(bào),2010(10):96-103.

Li X L,Xu X L,Wang Q W.Study on desiccation tolerance ofCBF2 gene inArabidopsisthaliana.Biotechnology Bulletin,2010(10):96-103.(in Chinese)

(責(zé)任編輯武艷培)

Drought Resistance ofArabidopsisthalianaexpressingCBF2 gene inBrachypodiumdistachyon

Zhang Yan-ni, Jiao Meng-yue, Liu Yi-jia

(Landscape Architecture College of Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

TheArabidopsisthalianaexpressingCBF2 gene inBrachypodiumdistachyonwas used as the experimental material. The response of the germination rate of transgenicA.thalianaseeds and seedlings growth to drought was analyzed by simulated mannitol osmotic stress, and the drought resistance of the mature seedlings was detected by pot experiments. Results showed the seed germination rate declined with the increase of the osmotic pressure, and it become significant when it reached -0.62 MPa. The germination rate of transgenic seed was slightly higher than wild seeds, but the difference was not significant. When the osmotic pressure was higher than -0.37 MPa, the root length increment significantly reduced with the increase of stress intensity, and the root length increment of transgenic plants was significantly higher than wildA.thaliana. The survival rate of wildA.thalianawas 11.7%, while the average survival rate of transgenic plants was 41.6% when theA.thalianaseedlings was dealing with drought stress for 25 days. POD and SOD activity of transgenicA.thalianawas significantly higher than wild plants, and MDA content and relative electrical conductivity were significantly lower than wild plants with the extension of drought stress time. Our results suggested that theCBF2 gene inB.distachyoncan significantly enhanced the drought resistance of transgenicA.thalianaseedlings and mature seedlings.

CBF2 gene;Brachypodiumdistachyon;Arabidopsisthaliana; drought resistance

Zhang Yan-niE-mail:zhangyanni808@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0542

植物生產(chǎn)層

2015-10-10接受日期：2016-06-05

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(DL12CA17)；黑龍江省留學(xué)歸國(guó)基金(LC201410)；黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目(12543012)

張彥妮(1974-)，女，山西大同人，副教授，博士，主要從事園林植物繁殖栽培及育種。E-mail:zhangyanni808@126.com

Q945.78

A

1001-0629(2016)8-1518-08

張彥妮，焦孟月，劉奕佳.表達(dá)二穗短柄草CBF2基因擬南芥抗旱性分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(8)：1518-1525.

Zhang Y N,Jiao M Y,Liu Y J.Drought resistance ofArabidopsisthalianaexpressingCBF2 gene inBrachypodiumdistachyon.Pratacultural Science，2016,33(8)：1518-1525.