南瓜子葉節(jié)再生體系的建立

張加一，劉 霞，胡芳芳，程永安

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 陜西楊凌 712100）

隨著植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，運(yùn)用生物技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新、改良南瓜品種已經(jīng)成為南瓜遺傳育種研究的新途徑。建立高效的南瓜再生體系是南瓜功能基因鑒定、轉(zhuǎn)基因等研究的基本條件之一。目前關(guān)于子葉節(jié)再生體系的研究主要集中在大豆[1-3]、黃瓜[4-6]、甜瓜[7-9]、西瓜[10-12]等作物上，有關(guān)南瓜子葉節(jié)離體培養(yǎng)的研究已有報(bào)道[13-14]，但再生體系并未完善，誘導(dǎo)出芽率不穩(wěn)定，生長緩慢。筆者對南瓜子葉節(jié)再生體系進(jìn)行了優(yōu)化，以6種南瓜的子葉為試驗(yàn)材料，進(jìn)行誘導(dǎo)再生。目的是建立一套高效的南瓜子葉節(jié)再生體系，為進(jìn)一步開展南瓜遺傳轉(zhuǎn)化和生物育種技術(shù)工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試南瓜品種為‘上桔’‘金栗’‘銀栗’‘貝栗灰’‘永安2號(hào)’‘永安5號(hào)’，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院南瓜課題組提供。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加 30 g·L-1蔗糖，8 g·L-1瓊脂條，pH 值為5.8。1/2 MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中大量元素減半，其他元素不變，pH值為5.8。其他激素如KT、6-BA、IBA，均配成母液于4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 外植體的獲得 將浸泡1 h的種子在超凈工作臺(tái)上去殼，在70%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4次。將種子接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d。在超凈工作臺(tái)上將外種皮剝?nèi)?，再置于光照?qiáng)度2 500 lx、光照16 h/d的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 不定芽分化的誘導(dǎo) 選取日齡8～10 d、苗態(tài)為2片葉子斜向上伸展的無菌幼苗，用解剖刀切去部分下胚軸，留取3～5 mm連著2片子葉的下胚軸，將2片子葉分開，剔除中間的頂芽生長點(diǎn)，將子葉和3～5 mm下胚軸部位用無菌手術(shù)刀橫向劃多道傷口，然后將有傷口的一端垂直插入添加了不同濃度激素的培養(yǎng)基中。該試驗(yàn)以MS基本培養(yǎng)基為對照，共設(shè)9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1）。每瓶接種4個(gè)外植體，每個(gè)處理6瓶。將接種好的子葉節(jié)置于光照強(qiáng)度2 500 lx、光照16 h/d的條件下培養(yǎng)。

表1 9種誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基 ρ（/mg·L-1）

1.2.3 子葉節(jié)不定芽增殖與生根 將愈傷組織分化出的不定芽，轉(zhuǎn)接到5號(hào)培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1IBA）上進(jìn)行繼代擴(kuò)增。當(dāng)芽叢生長到2～3 cm時(shí)，將芽叢取出，切分后接到MS培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度 2 500 lx、光照 16 h/d。

計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率和生根率。數(shù)據(jù)用Excel 2007、SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析。

不定芽誘導(dǎo)率/%=（生長不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

生根率/%=（誘導(dǎo)出根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA和IBA配比對南瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2可知，在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA和IBA均可以誘導(dǎo)南瓜子葉節(jié)形成不定芽，而不添加植物激素的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)不定芽。其中以添加1.0 mg·L-16-BA和0.02 mg·L-1IBA處理的不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到66.67%，出芽時(shí)間最短，為18 d。而隨著6-BA和IBA濃度的不斷升高，出芽時(shí)間增加，出芽數(shù)量減少，出芽率顯著降低，說明當(dāng)6-BA和IBA的濃度過高時(shí)不易誘導(dǎo)出芽。

表2 6-BA和IBA配比對南瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同KT濃度對南瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

6-BA和IBA的質(zhì)量濃度分別確定為1.0mg·L-1和0.02 mg·L-1，進(jìn)一步確定KT的最佳濃度。由表3可知，除5號(hào)培養(yǎng)基外，其余添加了KT的培養(yǎng)基的出芽率均顯著高于無KT的1號(hào)培養(yǎng)基。說明KT能夠促進(jìn)愈傷組織分化成芽。在一定范圍內(nèi)隨KT濃度的增加，出芽率顯著增加，其中當(dāng)KT質(zhì)量濃度為2 mg·L-1和3 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率最高均為100%。但當(dāng)KT質(zhì)量濃度超過3 mg·L-1時(shí)，出芽率顯著降低。且添加了KT的培養(yǎng)基出芽時(shí)間較短。

表3 不同KT濃度對南瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同基因型對南瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

由表4可知，這6組培養(yǎng)基均可以用來誘導(dǎo)南瓜不定芽。但不同基因型南瓜的誘導(dǎo)效果在不同培養(yǎng)基上表現(xiàn)不同?！惱趸摇?號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率均為100%，且顯著高于其他品種；但在1號(hào)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率僅為37.5%，顯著低于其他品種?！腊?號(hào)’在8號(hào)培養(yǎng)基上的出芽率顯著高于其他品種，但在1號(hào)培養(yǎng)基上的表現(xiàn)明顯不如其他品種?！鹄酢?號(hào)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率為100%，且顯著高于其他品種；但在6號(hào)培養(yǎng)基上低于‘永安2號(hào)’‘貝栗灰’和‘銀栗’。不同南瓜基因型在誘導(dǎo)率上也存在明顯差異，‘上桔’在所有培養(yǎng)基中的平均誘導(dǎo)率顯著低于其他品種。

表4 基因型對不定芽分化的影響%

2.4 不定芽的繼代擴(kuò)增與生根

將子葉節(jié)不定芽接種在5號(hào)培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1IBA）上繼代擴(kuò)增（圖1-1、1-2），發(fā)現(xiàn)新形成的不定芽的數(shù)量不僅多，而且葉色濃綠、植株健壯，易形成芽叢（圖1-3），生根也較容易。當(dāng)分化的幼苗長到2～3cm，將其接到生根培養(yǎng)基上（圖1-4）。發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)5 d后，幼苗莖基部切口處出現(xiàn)白色不定根；培養(yǎng)10 d后，均能生長出正常根系，生根率為100%。

圖1 南瓜子葉節(jié)再生體系

3 討論與結(jié)論

張玉園[13]等研究‘北觀’南瓜子葉節(jié)離體再生時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度超過1.0 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率下降。肖守華等[14]在研究西瓜高效再生體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA是西瓜外植體分化的關(guān)鍵因素，且再添加低濃度的IAA和IBA對不定芽的誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA和IBA的配比為1.0 mg·L-1和0.02 mg·L-1時(shí)培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高，而高濃度的6-BA和IBA則抑制了不定芽的發(fā)生。徐恒戩[15]在研究黑籽南瓜器官離體再生時(shí)發(fā)現(xiàn)，KT的添加對不定芽的發(fā)生是必需的，高濃度的KT能顯著提高出芽率，但當(dāng)KT質(zhì)量濃度大于 4 mg·L-1時(shí)，外植體玻璃化嚴(yán)重，影響其正常生長發(fā)育。崔波等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)KT對幼芽的伸長起促進(jìn)作用。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加3 mg·L-1KT時(shí)誘導(dǎo)率最高，為83.33%。吳廷全等[17]研究發(fā)現(xiàn)在相同條件下，不同基因型的誘導(dǎo)率不同。任桂紅[18]的試驗(yàn)表明，南瓜離體再生對基因型的依賴性很強(qiáng)，且不同的南瓜對各種激素的敏感性不同。本試驗(yàn)所選的6個(gè)材料均可以誘導(dǎo)出不定芽，但不同品種的誘導(dǎo)率有顯著差異。其中‘銀栗’最易誘導(dǎo)出芽，誘導(dǎo)率為93.75%。

本研究中，不定芽繼代擴(kuò)增在5號(hào)培養(yǎng)基中完整進(jìn)行，效果較好，其他5個(gè)培養(yǎng)基對繼代擴(kuò)增的效果如何，有待以后的試驗(yàn)證明。

本研究結(jié)果表明，南瓜子葉節(jié)通過人工誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以獲得再生植株，其最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+3 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1IBA，平均誘導(dǎo)率可達(dá)到 83.3%。6-BA 1.0 mg·L-1和 IBA 0.02 mg·L-1質(zhì)量濃度組合是6-BA與IBA組合中不定芽誘導(dǎo)率最高的。KT可以顯著提高不定芽的誘導(dǎo)率；南瓜的基因型在子葉節(jié)誘導(dǎo)出芽方面有差異，南瓜品種‘銀栗’最易誘導(dǎo)出芽，誘導(dǎo)率為93.75%。本試驗(yàn)中建立的南瓜子葉節(jié)再生體系采用器官直接發(fā)生途徑，不經(jīng)過脫分化和再分化，直接誘導(dǎo)出苗，縮短了再生周期，且再生頻率較高，可以作為南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系。