廣州市海珠區(qū)2012-2015年登革病毒分子流行病學(xué)分析

郭鵬娟　吳德　張歡　周惠瓊　譚錦花　許少洪

510288 廣州市海珠區(qū)疾病預(yù)防控制中心(郭鵬娟、譚錦花、許少洪)；511340 廣州， 廣東省疾病預(yù)防控制中心(吳德、張歡、周惠瓊)

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·論著·

廣州市海珠區(qū)2012-2015年登革病毒分子流行病學(xué)分析

郭鵬娟吳德張歡周惠瓊譚錦花許少洪

510288 廣州市海珠區(qū)疾病預(yù)防控制中心(郭鵬娟、譚錦花、許少洪)；511340 廣州， 廣東省疾病預(yù)防控制中心(吳德、張歡、周惠瓊)

目的了解2012-2015年廣州市海珠區(qū)流行的登革病毒分子特征及可能的傳播來(lái)源。 方法收集2012-2015年登革熱患者血清樣本，分析登革熱流行特征。篩選急性期血清，核酸陽(yáng)性標(biāo)本用于細(xì)胞培養(yǎng)分離毒株，RT-PCR擴(kuò)增登革病毒E 基因全長(zhǎng)，測(cè)序并利用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行生物特征和信息學(xué)分析。 結(jié)果2012-2015年區(qū)域內(nèi)共報(bào)告病例6 260例，各年齡段均有發(fā)病，10月份為發(fā)病最高峰；選取發(fā)病5 d內(nèi)核酸檢測(cè)陽(yáng)性的血清樣本48例，成功分離16株病毒，擴(kuò)增測(cè)序獲得E基因全長(zhǎng)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)2013年及2014 年共11株分離株為同一種毒株，屬于1型登革病毒G1型，與廣州2009年分離株核苷酸同源性高達(dá)99.93%，與泰國(guó)流行株氨基酸同源性高達(dá)98.38%。2015年5個(gè)分離株為同一毒株屬于2型登革病毒Cosmopolitan基因型，與印度流行株親緣關(guān)系最近。結(jié)論區(qū)域內(nèi)近4年的1型登革病毒屬于G1基因型，最可能來(lái)源于泰國(guó)。2型登革病毒屬于Cosmopolitan基因型，可能來(lái)源于印度流行株。

【主題詞】登革熱病毒；基因；序列分析

Fund programs: Guangzhou Medical and Health Science and Technology Project(20151A011099);Science and Technology Project of Haizhu (2014-yl-10))

登革病毒(Dengue virus,DENV)屬于黃病毒科、黃病毒屬，為單正鏈RNA病毒，可引起登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)/登革休克綜合征(DSS)。登革熱作為嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，波及100多個(gè)國(guó)家，威脅著全球2/3的人口。登革熱是我國(guó)乙類傳染病，疫情主要集中在廣東、廣西、福建和云南等南方省份，但隨著人口流動(dòng)加劇及氣候變化，有向北擴(kuò)散趨勢(shì)[1]。廣州位處中國(guó)南部，是華南地區(qū)區(qū)域性中心城市和交通樞紐，是我國(guó)登革熱的主要流行區(qū)域和重點(diǎn)防控地區(qū),自2001年起，每年均有輸入性和本地病例[2-3]。海珠區(qū)地處廣州市中部，為廣州市老城區(qū)，全區(qū)十八條街道緊密相連，并與其他城區(qū)相接，能很好的反應(yīng)廣州市登革熱流行特點(diǎn)。2012-2015年，區(qū)域內(nèi)每年都有登革熱疫情發(fā)生，2012年、2013年發(fā)生登革熱局部小規(guī)模暴發(fā)，2014年發(fā)生登革熱大流行，累計(jì)報(bào)告病例五千余例，2015年發(fā)生廣州市首起登革熱本地疫情，區(qū)域內(nèi)登革熱防控形勢(shì)嚴(yán)峻。本研究通過(guò)整理2012-2015年臨床診斷及實(shí)驗(yàn)室確診病例資料，分析區(qū)域內(nèi)登革熱流行特點(diǎn)，并針對(duì)登革病毒E蛋白序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過(guò)基因測(cè)序分析其序列特征,進(jìn)而分析2012-2015年本區(qū)域內(nèi)登革熱可能的傳播來(lái)源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及樣本來(lái)源：C6/36細(xì)胞由廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗(yàn)所提供，細(xì)胞分離鑒定均在該所進(jìn)行。選取廣州市海珠區(qū)2012-2015年登革熱流行期間實(shí)驗(yàn)室/臨床診斷的登革熱病例血清標(biāo)本(診斷依據(jù)：《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，WS216-2008),病例均有完整的流行病學(xué)調(diào)查資料。

1.1.2檢測(cè)試劑及儀器：用于ELISA檢測(cè)登革病毒 IgM抗體及IgG抗體試劑為澳大利亞Panbio公司生產(chǎn)；核酸提取試劑盒(離心柱法)為life technologies (美國(guó),批號(hào)：1687840)生產(chǎn)；登革病毒核酸RT-PCR檢測(cè)試劑盒為life technologies(美國(guó),批號(hào)：1642485)；登革病毒通用型核酸測(cè)定試劑盒(熒光PCR法)為上海之江生產(chǎn)(批號(hào)：P20150901)；試劑均在有效期內(nèi)正確使用。BIO-RAD T100，Thermal Cycler 進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

1.2方法

1.2.1流行病學(xué)資料分析：所有數(shù)據(jù)錄入Excel 2007進(jìn)行整理，采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。卡方檢驗(yàn)分析區(qū)域內(nèi)登革熱流行特點(diǎn)。

1.2.2病毒分離培養(yǎng)：篩選發(fā)病1-5 d核酸檢測(cè)陽(yáng)性的登革熱患者血清樣本48份，2012-2015年各年份分別為6例、7例、22例和13例。24孔細(xì)胞培養(yǎng)，觀察到細(xì)胞病變后，直接吸取5 μl細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按照登革病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，一步法Real-time RT-PCR檢測(cè)病毒核酸，核酸陽(yáng)性者即為成功分離的細(xì)胞毒株，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，-70℃凍存。

1.2.3登革病毒E基因擴(kuò)增：取細(xì)胞培養(yǎng)上清液200 μl，按照l(shuí)ife technologies核酸提取試劑盒(離心柱法)說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取登革病毒核酸, 采用型特異性引物擴(kuò)增E基因(引物由廣東省疾控中心病原微生物檢驗(yàn)所蟲(chóng)媒組無(wú)償提供[10])。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化為體系25 μl：2×Reaction Mix 12.5 μl;上下游引物各0.5 μl；cDNA模板 5 μl；Tap酶1 μl，H2O 5.5 μl。反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性2 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、68℃ 90 s，循環(huán)35次；68℃延伸10 min。

1.2.4PCR產(chǎn)物鑒定及測(cè)序:PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司廣州部進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5測(cè)序基因片段拼接及同源性比對(duì):測(cè)序的基因片段用Seqman軟件(DNAstar software package)進(jìn)行序列拼接，得到完整的E基因序列,校正無(wú)誤后上傳至GenBank(序列號(hào)：KX082948-KX082963)。登錄EBI網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，應(yīng)用Multiple Sequence Alignment 程序在線進(jìn)行多序列比對(duì)及同源性分析。

1.2.6進(jìn)化樹(shù)繪制:在GenBank中選取不同地區(qū)登革病毒1型及2型E基因序列，應(yīng)用Mega 7.0軟件，N-J法分別繪制1型及2型序列進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行分子分型分析可能的傳播來(lái)源。

1.2.7本地區(qū)不同年份序列比對(duì):選取廣州地區(qū)不同年份登革病毒E基因序列，應(yīng)用Multiple Sequence Alignment 程序在線進(jìn)行多序列比對(duì)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)。

2　結(jié)果

2.1流行病學(xué)特征分析

2.1.1空間分布: 2012-2015年共報(bào)告登革熱臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室確診陽(yáng)性病例6 260例，分布在全區(qū)18條街道，各街道互相銜接，其中病例數(shù)居前三位的分別為：龍鳳街(549例)、南石頭街(518例)和海幢街(512例)。

2.1.2年齡、性別分布：按照發(fā)病年齡進(jìn)行分組，各年齡組均有發(fā)病，其中20-59歲為主要發(fā)病人群。(χ2=65.965，P=0.000),按α=0.05水準(zhǔn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)；報(bào)告病例中，男性2 923例，女性3 337例(χ2=0.090，P=0.993)。男女發(fā)病構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3時(shí)間分布：報(bào)告病例最早在5月出現(xiàn)，12月份結(jié)束，10月份達(dá)到最高峰。(χ2=1.264E3，P=0.000)表2。

表1　2012-2015年不同年齡組登革熱病例分布

表2　2012-2015年不同月份登革熱病例分布

2.2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果48例樣本經(jīng)C6/36細(xì)胞分離培養(yǎng),16例出現(xiàn)細(xì)胞病理性效應(yīng)(CPE)，且經(jīng)Real-time RT-PCR鑒定病毒核酸陽(yáng)性，其中2012年0例、2013年4例(4/7)、2014年7例(7/22)、2015年5例(5/13)。陽(yáng)性樣本細(xì)胞培養(yǎng)液核酸提取后，用型特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，16個(gè)細(xì)胞分離株RT-PCR產(chǎn)物均在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異條帶，且證實(shí)2013年及2014年共11個(gè)陽(yáng)性分離株均為1型登革病毒，2015年5個(gè)陽(yáng)性分離株均為2型登革病毒。

2.3序列測(cè)定及拼接所有樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序反應(yīng)均獲成功，應(yīng)用Seqman程序進(jìn)行拼接，序列全長(zhǎng)均>1 500 bp，包含完整的E基因開(kāi)放讀碼框序列。

2.4E基因序列的同源性分析通過(guò)EBI網(wǎng)站在線比對(duì)，2013-2014年分離到的11株1型登革病毒同源性達(dá)到99.55%-100%。2015年樣本分離到的5株2型登革病毒的同源性高達(dá)99.69%-100%。

2.5進(jìn)化樹(shù)測(cè)序結(jié)果用DNAStar(lasergene 7)軟件進(jìn)行拼接，DNAClub翻譯驗(yàn)證無(wú)誤后，所有序列上傳至GenBank(序列號(hào)：KX082948-KX082963)。分別選取不同地區(qū)國(guó)家的登革病毒1型代表株55個(gè)、2型代表株37個(gè)，MEGA7.0繪制進(jìn)化樹(shù)。2013-2014年共11株，同源性高達(dá)99.6%，位于同一進(jìn)化分支中，屬于1型登革病毒的G1型別，與分離自泰國(guó)的1型毒株JF967945同源性最高(圖1)。2015年分離的毒株為登革病毒2型，與印度流行株(FJ538913)同源性最高(圖2)，位于同一進(jìn)化分支，同屬Cosmopolitan 基因型。

2.6與廣州市歷年分離毒株E基因序列比對(duì)分別選取2013年毒株(KX082949)及2015年毒株(KX082959)E基因序列與GenBank中登錄的廣州市2001-2012年登革病毒1、2型毒株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2013年分離株E基因序列與廣州2010年(GI673387472)分離株相似度達(dá)99.93%，與2009分離株(GI320120062)同源性高達(dá)99.4%；2015年分離株與2012年廣州分離的輸入性病例分離株(JN009091)E基因序列同源性最高達(dá)97.64%，與廣州本地流行株同源性相對(duì)較低。

3　討論

圖1　廣州市海珠區(qū)1型登革病毒分離株進(jìn)化樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree of DENV-1 isolates from the 2013-2014 outbreak in Haizhu district of Guangzhou

圖2　廣州市海珠區(qū)2型登革病毒流行株進(jìn)化樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree of DENV-2 Shrains from the 2015 outbreak in Haizhu district of Guangzhou

登革病毒基因序列全長(zhǎng)約11 Kb，編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C,prM,E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。登革病毒E區(qū)有494-501個(gè)氨基酸，是病毒的包膜蛋白，與病毒受體結(jié)合，參與病毒與宿主細(xì)胞的膜融合[4]。E蛋白還是登革病毒的重要抗原表位、登革病毒分子分型的目標(biāo)基因[5]。在過(guò)去的三十年，登革熱傳播迅猛，病例增長(zhǎng)了4倍，而全球防控登革熱70%的壓力在東南亞[6]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)， 1型登革病毒的G1型及2型登革病毒Cosmopolitan基因型是東南亞國(guó)家的主要流行株[7]。當(dāng)今隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化，物流和旅游的加快，東南亞國(guó)家與廣州之間貿(mào)易往來(lái)頻繁，更是廣州居民喜歡的旅游目的地，也是廣州市登革熱輸入性病例的主要來(lái)源地[2]，此次分離的病毒毒株均屬于這兩種基因型。

廣州地區(qū)全年平均氣溫21 ℃-23 ℃，平均相對(duì)濕度75%，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。每年從4月開(kāi)始直到9月為多雨季節(jié)，蚊媒密度在6-8月達(dá)到最高峰[8]。自2001年起，每年均有輸入性和本地病例，四個(gè)型別的登革熱均有發(fā)生，而1型登革病毒是廣州地區(qū)登革熱流行的主要型別，分別在2002年、2006年及2014年發(fā)生過(guò)三次大的暴發(fā)流行。2014年廣州市報(bào)告本地病例37 340例，發(fā)病率為290.83/10萬(wàn)，死亡病例5例，病死率為1.34/萬(wàn)[2,9]。本研究發(fā)現(xiàn)區(qū)域內(nèi)登革病例高發(fā)的大都是人口密集的老街區(qū)，分析原因可能與人口密度大，本地居民喜歡養(yǎng)殖水生植物有關(guān)。人群普遍易感，各年齡段均有發(fā)病，其中20-59歲為主要發(fā)病人群，男女發(fā)病無(wú)差異。發(fā)病高峰期在10月，與廣州氣候密切相關(guān)，與之前的報(bào)到一致[2]。

確定疫情本地化有賴于從蚊媒中分離登革病毒，但通過(guò)對(duì)流行株的分析，一定程度上可以推測(cè)登革病毒的傳播來(lái)源，分析本地化的可能性。海珠區(qū)是廣州市老城區(qū)，尤其是赤崗街蚊媒密度一直較高，連續(xù)3年均有疫情發(fā)生，研究特選赤崗街病例進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查，以期發(fā)現(xiàn)登革流行株的變遷以及是否本地化可能。遺憾的是2012年未成功分離到病毒株，2013及2014年病毒分離株經(jīng)分析為同一毒株，與2009年廣州分離的泰國(guó)輸入病例毒株同源性高達(dá)99.93%，進(jìn)化樹(shù)分析為登革病毒1型的G1型，與泰國(guó)流行株最接近，這與之前報(bào)道的廣東省2014年登革熱流行以G5型為主有所不同[10-11]。流行病學(xué)資料顯示病例均為本地病例，無(wú)境外活動(dòng)史，分析區(qū)域內(nèi)1型登革病毒疫情可能是由2009年泰國(guó)輸入性毒株本地化引起。2015年該地發(fā)生了廣州市首次本地疫情，疫點(diǎn)早期病例為外地建筑工人，后波及到本地居民，流行病學(xué)及病原學(xué)分析確定疫情為DF-2型且為外地輸入性病例引起的本地疫情暴發(fā)，與廣州市往年分離的2型登革病毒堿基同源性相對(duì)較低，在91.18%-97.64%之間。

近年來(lái)，隨著登革熱在廣州呈現(xiàn)毒株多樣化、不同型別毒株交替流行的復(fù)雜狀況，這讓我們不得不擔(dān)心異型登革病毒二次感染會(huì)造成抗體依賴性感染增強(qiáng)作用(ADE)現(xiàn)象的出現(xiàn)，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)廣州地區(qū)登革熱分子流行特征，對(duì)疾病防控顯得尤為重要。

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Molecular epidemiological analysis of dengue virus in Haizhu district of Guangzhou from 2012 to 2015

GuoPengjuan,WuDe,ZhangHuan,ZhouHuiqiong,TanJinhua,XuShaohong

HaizhuDistrictCenterforDiseaseControlandPreventionofGuangzhouCity，Guangzhou510288，China(GuoPJ，TanJH,XuSH)；GuangdongProvincialCenterthesequencesDiseaseControlandPrevention，Guangzhou511340，China(WuD,ZhangH,ZhouHQ)

GuoPengjuan,Email:24168651@qq.com

Objective To analyze the molecular characteristic and trace the resource of dengue virus in Zhuhaidistrict of Guangzhou during 2012-2015. MethodsCollected the cases data of dengue fever in Zhuhai district from 2012-2015 and analyzed the epidemical characteristic. DENV strains were isolated by C6/36 cells, the E gene was amplified from the positive specimen by RT-PCR.The PCR products were sequenced and then analyzed by bio-information software. ResultsTotal of 6 260 DENV infection cases were reported, and the cases happened in every age group; 57.78% of the cases occurred in October. 16 virus strains were isolated from 48 samples and the whole E genes were successfully amplified, the virus strains from 2013 and 2014 were the same one and the nucleotide sequence 99.93% identify with DENV-1 in 2009. Phylogenetic analysis showed that DENV-1 belonged to the G1 genotype, genetically close to the strains from Thailand; strains from 2015 were the same one and belonged to the Cosmopolitan genotype of DENV-2, most similar with the strains from India. ConclusionsThe DENV-1 outbreak in Haizhu district of Guangzhou during 2012-2015 were belonged to G1 that originated from Thailand and might indigenous in 2009; DENV-2 was belonged to Cosmopolitan genotype which was imported.

Dengue virus; Gene; Sequence analysis

郭鵬娟，Email:24168651@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.003

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20151A011099)；廣州市海珠區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-yl-10)

2016-06-21)